CN102688193B - 长春碱类药物的热敏脂质体制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及长春碱类药物的热敏脂质体制剂及其制备方法。所述热敏脂质体制剂包含长春碱类药物、热敏磷脂和任选的长循环材料，其中热敏磷脂和长循环材料的摩尔比为70∶30～92∶8；长春碱类药物与空白脂质体的重量比为1∶10～1∶50。本发明采用pH梯度主动载药法，包封率可达到90.0％～99％。本发明的脂质体制剂具有热敏性，在肿瘤组织局部加热时，可使该脂质体被动靶向肿瘤部位，同时释放大量药物，提高疗效，降低全身的毒副作用。

Description

长春碱类药物的热敏脂质体制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及脂质体制剂，具体涉及包含长春碱类药物的热敏脂质体制剂，及其制备方法。

背景技术

长春碱类抗肿瘤药物是从夹竹桃科植物长春花中分离得到的具有抗癌活性的一类生物碱。属细胞周期特异性抗肿瘤药，其作用机理是通过阻滞细胞有丝分裂过程中的微管形成，使细胞分裂停止于有丝分裂中期，临床主要用于治疗恶性淋巴瘤、绒毛膜上皮癌、中晚期食管癌、晚期非小细胞肺癌和乳腺癌等。目前我国上市剂型有静脉注射液、冻干粉针，但是该药物静脉注射后，毒副作用比较大，常见神经毒性和血液毒性，静脉炎，局部皮肤坏死等症状。

美国的Inex申请专利(US2009/0041834A1)将此类药物制备成脂质体，经研究表明此种抗肿瘤药物制备成脂质体后，可以延长体内循环时间，增强靶向性，降低毒副作用。但其制备的脂质体与以前的剂型相比，并未明显地提高疗效。

因此，需要研制一种靶向性强的脂质体，可以在不增加药物剂量的情况下，延长药物的半衰期，提高药物的抗肿瘤效果，减少药物的毒副作用，增强药物的临床应用性。例如，可以根据长春碱类药物的特性设计并制备包含此类药物的热敏脂质体，以进一步提高该类药物的临床疗效。

发明内容

长春碱类药物是一种两性弱碱类药物，根据此性质可以考虑采用pH主动载药的方式进行制备此类药物的脂质体制剂。在本发明中，发明人根据长春碱类药物的特性，通过大量的实验摸索，制备了包含该类药物的热敏脂质体制剂，制备方法先进合理，包封率高，稳定性好，不易泄露，提高了该类药物的临床疗效。

本发明的一个方面涉及一种长春碱类药物的热敏脂质体制剂，其包含长春碱类药物、热敏磷脂和任选的长循环材料，其中热敏磷脂和长循环材料的摩尔比为50∶50～92∶8，优选为70∶30～92∶8，更优选为80∶20～92∶8；长春碱类药物与空白脂质体的重量比为1∶10～1∶100，优选为1∶10～1∶50，更优选为1∶20～1∶30。

在本发明中，所述长春碱类药物包含长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、长春氟宁、脱水长春碱、长春甘酯、长春西醇、长春罗新、长春倍酯、长春罗定。在本发明的一个实施方案中，所述长春碱类药物为长春瑞滨。

其中所述的热敏磷脂选自相变温度在35～80℃之间的磷脂酰胆碱、氢化卵磷脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油中的至少一种，获得的热敏磷脂或其组合物的相变温度在37-50℃之间，优选为在39-45℃之间。

其中所述的长循环材料选自聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇、吐温、苄泽、PEG化磷脂、PEG化聚己内酯、PEG化聚乙交酯丙交酯、PEG化聚乳酸、伯洛沙姆、聚氧乙烯脂肪酸酯类、聚氧乙烯脂肪酸醚和聚氧乙烯甲基蓖麻油醚中的至少一种，优选为聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺，例如平均分子量为2000的聚乙二醇-氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE-mPEG2000)、平均分子量为5000的聚乙二醇-氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE-mPEG5000)或平均分子量为2000的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-mPEG2000)。

根据本发明的热敏脂质体制剂，其粒径分布范围是30-500nm，优选为50-200nm。

根据本发明的热敏脂质体制剂，其包封率为60.0％～99.9％，优选为90.0％～99.9％。

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的热敏脂质体制剂，以及药学可接受的载体。

本发明的另一方面涉及本发明的热敏脂质体制剂的制备方法，其包括以下步骤：

(1)制备空白脂质体：将热敏磷脂、长循环材料的混合物溶于有机溶剂中，得到磷脂溶液。蒸成薄膜。在薄膜中加入缓冲液，水化20～60min，脱气，得到多层脂质体溶液。多层脂质体溶液通过挤压过聚碳酸酯膜，得到粒径在30-500nm，优选为50-200nm的空白脂质体溶液；所述有机溶剂为选自乙醇、甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、异丙醇等易挥发的有机溶剂中的一种或两种以上的混合溶剂；

(2)制备载药脂质体：在空白脂质体中加入长春碱类药物，混合均匀，25～50℃下用碱溶液调节脂质体溶液的外相pH值至6.0～8.5，10～60min内完成载药，得到长春碱类药物的热敏脂质体制剂的溶液。

其中步骤(1)中所述的缓冲液为0.1M～0.5M的柠檬酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，其pH值为3.0～6.0，优选为0.2M～0.3M的柠檬酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH值为3.0～4.0。

本发明的再一方面涉及本发明的热敏脂质体制剂在制备抗肿瘤药物中的用途。

下面更进一步地描述本发明。本发明的使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

本发明提供了一种长春碱类药物的热敏脂质体制剂，其特征在于该脂质体为含长春碱类抗肿瘤药物的、具有在适宜温度以上发生相变而可以快速释放药物的热敏特点；其包含长春碱类药物、热敏磷脂和任选的长循环材料，其中热敏磷脂和长循环材料的摩尔比为50∶50～92∶8，优选为70∶30～92∶8，更优选为80∶20～92∶8；长春碱类药物与空白脂质体的重量比为1∶10～1∶100，优选为1∶10～1∶50，更优选为1∶20～1∶30。

本发明的长春碱类药物的热敏脂质体，包括单纯的热敏脂质体和长循环热敏脂质体。当制剂组成中含有长循环材料时即为长循环热敏脂质体。

本发明的长春碱类药物的热敏脂质体，其热敏温度(即相变温度，脂质体从凝胶态向液晶态转变的温度)范围为35-50℃，优选37-48℃，优选39-45℃，优选39-42℃。

在本发明中，其中所述的热敏磷脂选自相变温度在35～80℃之间的磷脂酰胆碱、氢化卵磷脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油中的至少一种，获得的热敏磷脂或其组合物的相变温度在上述热敏温度之间。所述磷脂酰胆碱选自饱和或不饱和的磷脂酰胆碱，优选为饱和的磷脂酰胆碱，例如为二硬脂酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱。所述氢化卵磷脂选自氢化的天然磷脂，例如为氢化大豆磷脂或氢化蛋黄卵磷脂。所述磷脂酰乙醇胺选自饱和或不饱和的磷脂酰乙醇胺，优选为饱和的磷脂酰乙醇胺，例如为氢化大豆磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。所述磷脂酰甘油选自饱和或不饱和的磷脂酰甘油，优选为饱和的磷脂酰甘油，例如为二硬脂酰基磷脂酰甘油。

在本发明中，选取热敏磷脂中的一种或数种进行组合，使组合后的热敏磷脂组合物达到上述相变温度。在本发明的一个实施方案中，所述热敏磷脂为DPPC和MSPC；在本发明的一个实施方案中，所述热敏磷脂为DPPC和DSPG；在本发明的一个实施方案中，所述热敏磷脂为DPPC、DSPG和MSPC。

在本发明的一个实施方案中，所述的热敏脂质体制剂包含：

在本发明的一个实施方案中，所述的热敏脂质体制剂包含：

在本发明的一个实施方案中，所述的热敏脂质体制剂包含：

在本发明中，由于长春碱类药物属于弱碱性药物，采用pH梯度主动载药法制备，包封率达到90.0～99.0％。

发明的有益效果

本发明根据长春碱类药物的特性设计并制备了热敏脂质体制剂和长循环热敏脂质体制剂，其具有以下特点：

(2)本发明的长循环热敏脂质体具有在体内循环时间长，靶向性好，可以在加热条件下迅速释放药物于加热部位的特性。

(3)本发明采用薄膜分散和主动载药法制备脂质体，稳定性好，不易泄露，克服了现有技术中长春碱类脂质体易泄露、稳定性差的问题。

(4)本发明根据长春碱类药物的特性采用pH梯度主动载药法制备，包封率高，可达到90.0～99.0％。

实验结果表明，本发明的热敏脂质体与普通注射剂和普通脂质体相比，肿瘤抑制效果明显提高；与普通脂质体相比，靶向性更好，在加热的条件下，药物释放快且量大，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1长春瑞滨长循环热敏脂质体的DSC图

图2水浴温度对长春瑞滨长循环热敏脂质体释药量的影响。

图3水浴温度和加热时间对长春瑞滨长循环热敏脂质体释药量的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1长春瑞滨长循环热敏脂质体制剂的制备

(1)空白脂质体的制备

需要的药品与试剂：二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、DSPE-mPEG2000、单硬酯酰磷酯酰胆碱(MSPC)，柠檬酸，柠檬酸三钠、碳酸钠、双蒸水。

表1

磷酯	DPPC	DSPE-mPEG2000	MSPC
				质量(g)	8.9	0.8	0.3

按表1称取各种磷脂(制备100ml空白脂质体的用量)，溶于80ml氯仿，50～60℃下旋转蒸发除去有机溶剂，得到干燥、均匀附着在玻璃瓶底的膜。用100ml，0.2M，pH4柠檬酸盐缓冲液水化，得到多层脂质体溶液。挤压过聚碳酸酯膜，先过孔径为200nm的聚碳酸酯膜，再过孔径为100nm的聚碳酸酯膜。测定粒径110nm，脂质体溶液呈透明蓝色乳光，且流动性好。

(2)pH梯度法制备载药脂质体：称取0.26g长春瑞滨溶解于100ml空白脂质体溶液中，40℃水浴下加入28ml0.3M的碳酸钠溶液调节外相pH值为7.56，载药用时30min。加入冷冻保护剂乳糖8.7g溶解于脂质体溶液中，放置于-20℃的冰箱中冷冻保存。

实施例2长春瑞滨长循环热敏脂质体制剂的制备

(1)空白脂质体的制备

与实施例1相同。

(2)pH梯度法制备载药脂质体：称取0.3g长春瑞滨溶解于100ml，0.2M，pH4柠檬酸盐缓冲溶液中，配制3mg/ml的药物溶液。取20ml的药物溶液加入到20ml空白脂质体溶液中(可认为药物的用量为0.06g左右)，25℃下加入碳酸钠溶液调节外相pH值7.45，载药用时60min。加入冷冻保护剂蔗糖(10％)，放置于-20℃的冰箱中冷冻保存。

实施例3长春瑞滨长循环热敏脂质体制剂的制备

(1)空白脂质体的制备

需要的药品与试剂：二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、DSPE-mPEG2000、二硬酯酰磷脂酰甘油(DSPG)，酒石酸，酒石酸钠、碳酸钠、双蒸水，具体用量见表2。

表2

磷酯	DPPC	DSPE-mPEG2000	DSPG
				质量(g)	7.7	2	0.3

按表2称取各种磷脂(制备100ml空白脂质体的用量)，溶于80ml氯仿和甲醇溶液(1∶1)形成澄清透明的溶液，60℃下旋转蒸发除去有机溶剂，得到干燥、均匀附着在玻璃瓶底的膜。用(100ml，0.2M，pH4)酒石酸盐缓冲液水化，得到多层脂质体溶液。挤压过聚碳酸酯膜，先过孔径为200nm的聚碳酸酯膜，再过孔径为100nm的聚碳酸酯膜，得到粒径为104nm的脂质体溶液。

(2)pH梯度法制备载药脂质体：在100ml空白脂质体溶液中加入50ml，0.3M氢氧化钠溶液，调节外相pH值约为7，加入长春瑞滨溶液(3mg/ml)100ml，混合均匀，静置于30℃的水浴中60min。加入冷冻保护剂海藻糖，-20℃的冰箱中冷冻保存。

实施例4长春瑞滨长循环热敏脂质体制剂的制备

(1)空白脂质体的制备

药品和试剂与实施例3相同，具体用量见表3。

表3

磷酯	DPPC	DSPE-mPEG2000	DSPG	MSPC
					质量(g)	7	2	0.8	0.2

按表3称取各种磷脂(制备100ml空白脂质体的用量)，其它操作过程与实施例1相同。

(2)pH梯度法制备载药脂质体：

100ml空白脂质体与100ml长春瑞滨溶液(3mg/ml)，制备过程与实施例2相同。

实施例5长春瑞滨长循环热敏脂质体的稳定性

为了考察本发明脂质体的稳定性，取实施例1制备的长春瑞滨长循环热敏脂质体，在-20℃条件下反复冻融(每隔一个月，室温下解冻)，测定脂质体的粒径(动态光散射法，Nanophoxn激光粒度分析仪)和包封率(黄何松，龚伟，张慧等重酒石酸长春瑞滨热敏脂质体的制备及其包封率测定方法研究，中国药学杂志，2010(45)：1250-1254.)。

表4脂质体在-20℃条件下的冻融稳定性考察结果。

冻融次数	0	1	2	3
					粒径(nm)	110	126	127	131
包封率(％)	94.9	95.4	97.5	96.4

从表4结果可知，所制备的长春瑞滨热敏脂质体反复冻融后性质稳定，粒径，包封率没有明显变化。

实施例6长春瑞滨长循环热敏脂质体的相变温度

采用差示扫描量热法(DSC)测定长春瑞滨长循环热敏脂质体的相变温度。将实施例1制备的长循环热敏脂质体稀释至磷脂浓度约为20mg/ml，吸取10μl于铝盘中，30-50℃范围扫描，扫描速度2℃/min。测得脂质体的相变温度在41.34℃左右(如图1)，表明相变明显且相变温度变化范围较窄。

另外，发明人还检测了不同磷脂组合所产生的相变温度，结果见表5。

表5不同磷脂组合所产生的相变温度

根据上述结果可知，通过调整磷脂相组合的不同比例，可以得到不同相变温度的长春瑞滨长循环热敏脂质体。

实施例7长春瑞滨长循环热敏脂质体体外释药考察

将实施例1的长循环热敏脂质体用生理盐水稀释至浓度0.5mg/ml，分别放置于37℃、39℃、41℃、42℃、43℃共5组不同温度水浴中加热15min后，取样HPLC法测定释放药物的总量。在不同温度下的释放率见图2。可以看出，在正常体温附近，本发明的脂质体几乎不释放药物，达到39℃以上，特别是41℃以上时会迅速释药。

另取两份稀释后的脂质体置于37℃、43℃水浴中，于0，0.5，1，1.5，2.5，4，6，8，15min取样，计算各时间点的释放率。如图3所示，该脂质体在43℃附近时迅速释药，前4min内释放量即可达90％，而在37℃下几乎不释放药物。

实施例8本发明中的长循环热敏脂质体体内释药考察：

(1)长循环热敏脂质体组与普通注射剂组比较

实验小鼠(昆明小鼠)随机分成三组，每组20只，每组又随机分成两组，每组10只。分别尾静脉注射长春瑞滨普通注射液(市售制剂，江苏豪森药业股份有限公司)和实施例1制备的长春瑞滨长循环热敏脂质体(10mg/kg)。普通注射液组中，小鼠的两条腿分别采用43℃水浴加热和保持常温；同样，长循环热敏脂质体中，小鼠的两条腿分别采用43℃水浴加热和保持常温。30min后分别HPLC法测定加热和不加热的老鼠腿部肌肉药物累积量，结果见表6。

表6长循环热敏脂质体组与普通注射剂组的体内释药(ng/g)

以上数据表明本发明的长循环热敏脂质体组在加热的条件下，释放的药物量比不加热条件下释放药物量的两倍还要大，而普通注射液组没有明显改变。

(2)长循环热敏脂质体组与普通脂质体组比较

实验小鼠随机分成两组，每组10只，每组分别尾静脉注射(注射剂量为10mg/kg)长春瑞滨普通脂质体(实验室自制，制备过程同实施例1，只是把其中的DPPC换成蛋黄卵磷脂-EPC)和实施例1制备的长春瑞滨长循环热敏脂质体。普通脂质体组中，小鼠的两条腿分别加热和保持常温；同样，长循环热敏脂质体中，小鼠的两条腿分别加热和保持常温。15min后分别HPLC法测定加热和不加热的老鼠腿部肌肉药物累积量，结果见表7。

表7长循环热敏脂质体组与普通脂质体组的释药(ng/g)

以上数据表明长循环热敏脂质体组在加热的条件下，比不加热时释放的药物快且量较大，而普通脂质体组加热与不加热没有明显差异，表明长循环热敏脂质体组具有更好的靶向性。

实施例9药效学考察

用小鼠建立肺癌肿瘤模型，具体方法为取对数生长期Lewis肺癌细胞，按每只0.2mlLewis肺癌细胞悬液(2×10⁶/mL)接种于小鼠右腋偏背部皮下。于接种肿瘤细胞后第10日，选择肿瘤大小相对均一的小鼠10只，随机分为三组：生理盐水组，普通注射液组，实施例1制备的长循环热敏脂质体组。除了生理盐水组，其它两组分别尾静脉注射给相同剂量(10mg/kg)的长春瑞滨，称为治疗组。注射后，立即在肿瘤部位加热30min。共给药三次，每隔两天一次，每次给药后加热30min。第三次给药后3天取三组小鼠的肿瘤称重，根据公式计算肿瘤抑制率，结果见表8。

其中，Ws为生理盐水组的肿瘤质量；Wx为治疗组的肿瘤质量。

表8本发明脂质体的药效学观察

以上数据表明把长春瑞滨包封进长循环热敏脂质体后，经过热疗，肿瘤抑制效果与普通注射液和普通脂质体组相比明显增强。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (14)

1.一种长春碱类药物的热敏脂质体制剂，其包含长春碱类药物、热敏磷脂和长循环材料，其中热敏磷脂和长循环材料的重量比为80︰20～92︰8；长春碱类药物与空白脂质体的重量比为1︰20～1︰30；

其中所述的热敏磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱和单硬脂酰磷脂酰胆碱，或者所述的热敏磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰基磷脂酰甘油，获得的热敏磷脂的相变温度在39-45℃之间；

其中所述的长循环材料选自聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺。

2.权利要求1的热敏脂质体制剂，其中所述聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺为平均分子量为2000的聚乙二醇-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、平均分子量为5000的聚乙二醇-氢化大豆磷脂酰乙醇胺或平均分子量为2000的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。

3.权利要求1的热敏脂质体制剂，其中所述长春碱类药物为长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、长春氟宁、脱水长春碱、长春甘酯、长春西醇、长春罗新、长春倍酯或长春罗定。

4.权利要求3的热敏脂质体制剂，其中所述长春碱类药物为长春瑞滨。

5.权利要求1-4任一项的热敏脂质体制剂，其粒径分布范围是30-500nm。

6.权利要求5的热敏脂质体制剂，其粒径分布范围是50-200nm。

7.权利要求1-4任一项的热敏脂质体制剂，其包封率为60.0％-99.9％。

8.权利要求7的热敏脂质体制剂，其包封率为90.0％～99.9％。

9.药物组合物，其包含权利要求1-8任一项的热敏脂质体制剂，以及药学可接受的载体。

10.权利要求1或2的热敏脂质体制剂的制备方法，其包括以下步骤：

(1)制备空白脂质体：将热敏磷脂、长循环材料的混合物溶于有机溶剂中，得到磷脂溶液，蒸成薄膜，在薄膜中加入缓冲液，水化20～60min，脱气，得到多层脂质体溶液，多层脂质体溶液通过挤压过聚碳酸酯膜，得到粒径在30-500nm的空白脂质体溶液；

(2)制备载药脂质体：在空白脂质体中加入长春碱类药物，混合均匀，25～50℃下用碱溶液调节脂质体溶液的外相pH值至6.0～8.5，10～60min内完成载药，得到长春碱类药物的热敏脂质体制剂的溶液；

其中步骤(1)中所述的缓冲液为0.2M～0.3M的柠檬酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH值为3.0～4.0；

所述有机溶剂为选自乙醇、甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、异丙醇中的一种或两种以上的混合溶剂。

11.权利要求10的制备方法，其中步骤(1)中得到粒径在50～200nm的空白脂质体溶液。

12.权利要求10的制备方法，其中所述长春碱类药物选自长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、长春氟宁、脱水长春碱、长春甘酯、长春西醇、长春罗新、长春倍酯、长春罗定。

13.权利要求12的制备方法，其中所述长春碱类药物为长春瑞滨。

14.权利要求1-8任一项的热敏脂质体制剂在制备抗肿瘤药物中的用途。