CN102688190A - 一种用于口服齐墩果酸固体脂质纳米粒制剂及其转运机制 - Google Patents

Abstract

该发明提出了齐墩果酸固体脂质纳米粒(OA-SLN)新剂型，属于药学中纳米药物技术领域。其结构见附图，OA药物以分子形式分散在类脂材料中，形成了固溶体结构。类脂材料组成主要为单硬脂酸甘油酯和硬脂酸，表面活性剂为Tween-80。采用乳化-溶剂挥发法经处方优选后能得到包封率＞90％，载药率＞4％的OA-SLN。发现了OA-SLN具有良好的胃肠道稳定性；生物利用度得到显著提高；肠道内的吸收部位主要在于小肠部分；口服后在肠道的转运机制为细胞间隙和跨细胞转运的协同作用，其中跨细胞转运是主要的转运途径，细胞摄取受到P-gp外排作用的影响。OA-SLN口服给药最佳制剂剂型为纳米片剂或胶囊。

Description

一种用于口服齐墩果酸固体脂质纳米粒制剂及其转运机制

技术领域该发明提出了一种新的齐墩果酸口服制剂，其特点在于用单硬脂酸甘油酯和硬脂酸为主要材料的齐墩果酸固体脂质纳米粒制剂，提出了优化的制备工艺和处方、其在胃肠道的稳定性、在肠道中吸收部位以及生物利用度的优越性，属于药学中纳米药物技术领域。

背景技术齐墩果酸(oleanolic acid，简称OA)，为齐墩果烷型五环三萜类化合物，化学名为(3β)-3-Hydroxyolean-12-en-28-oic acid，分子式为C₃₀H₄₈O₃，结构式见图1。20世纪70年代以来，齐墩果酸(oleanolic acid，OA)的保肝作用引起人们的广泛关注。在实验研究中发现^[1]，齐墩果酸可使变性坏死的肝组织恢复正常来减轻丙氨酸(ALT)活力下降，肝组织炎症反应减弱，血中丙种球蛋白下降，并能促进肝细胞再生，使坏死区迅速修复，从而抑制发胶原纤维增生，使肝硬变难以形成。有实验^[2]证明OA有直接抑制谷丙转氨酶活性的特点。临床已作为肝病辅助治疗的OTC药物，用于急性化学性肝损伤、慢性肝硬化和肝纤维化^[3]。然而，OA难溶于水，细胞透过性差，生物利用度差，根据生物药分类体系(BiopharmaceuticsClassification System，BCS)分类，属于Class IV类药物，大大的限制了其临床应用。目前市场上主要制剂形式有胶囊和分散片。

固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticle，SLN)是指粒径在10～1000nm之间的固态胶体颗粒，它以固态天然或合成的类脂如卵磷脂、单硬脂酸甘油酯等为载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中制成固体胶粒给药系统，是一种可替代乳剂、脂质体和聚合物纳米粒的新型胶体给药系统。SLN作为口服给药系统时，具备以下优点^[4，5]：(1)制备SLN的脂材均为生物可降解、生理相容性好的天然的或合成的类脂材料，因此SLN具有良好的生理相容性；(2)SLN粒子较小，与胃肠道有较好的粘附性，可以延长药物与吸收部位的接触时间，从而增加吸收机会；(3)SLN将药物包载其中，形成实心粒子，在口服给药时，可以保护不稳定药物，使其免受胃肠道环境的破坏；(4)制备工艺简单易行，适用于工业化生产；(5)避免有机溶剂的残留；(6)SLN具有一定的缓控释及靶向作用。

为解决齐墩果酸(OA)溶解度差及渗透性低等问题，本发明采用以单硬脂酸甘油酯和硬脂酸为主要材料，辅以表面活性剂Tween-80，研制了OA固体脂质纳米粒制剂(OA-SLN)。经大鼠口服灌胃给药后血药动学研究，发现OA-SLN生物利用度得到显著提高。说明OA固体脂质纳米粒在临床上较OA简单制剂如片剂具有更广阔的应用前景。经文献检索，目前没有能够显著提高OA生物利用度的固体脂质纳米粒制剂及其相关转运机制的研究报道。

发明内容

1.该发明的创新点之一是采用两种脂质材料制备齐墩果酸固体脂质纳米粒。

齐墩果酸与单硬脂酸甘油酯具有良好的物理相溶性，其部分溶解度参数之差值最小。但由仅有单硬脂酸甘油酯一种材料制备的OA-SLN易发生凝集聚沉现象，制剂不稳定。为改善制剂稳定性及提高OA载药率，本发明使用两种脂质材料——单硬脂酸甘油酯和硬脂酸来制备OA-SLN。该种处方组成防止了单一晶体的形成，具有晶体缺陷，为药物提供更多的容纳空间。

2.该发明的创新点之二在于提出了OA-SLN的制备工艺。

按优化处方取适量OA，GMS，SA溶于乙醇中作为油相，配制3％Tween-80水溶液作为水相，两相均放置80℃～90℃水浴中恒温，平衡后，在水浴中，1000rpm电动搅拌下，迅速将乙醇溶液滴入至水相中，继续乳化搅拌，使乙醇完全挥发。溶液迅速至于0℃超声水浴固化10min，室温放置即得OA-SLN纳米混悬液。制备的OA-SLN包封率大于90％，载药率为4％～5％，平均粒径为70nm～150nm。

3.该发明的创新点之三在于发现该OA-SLN制剂为固溶体结构，OA以分子形式分散于固体脂质纳米粒组成基质中。

本发明中制备的OA-SLN在TEM观察下粒子形态圆整、分布均匀。X-射线衍射(XRD)和差示扫描量热技术(DSC)检测以及体外释放结果互相验证，共同表明OA药物以分子形式均匀分散在SLN组成基质中，与脂材形成固溶体结构。

4.该发明的创新点之四在于发现该OA-SLN制剂在人工胃液及肠液中具有良好的稳定性，能够维持固体纳米粒形态发挥药效，有利于口服给药。

胃肠道中苛刻的环境，对口服药物以及口服药物输送系统是一大考验。药物输送系统在胃肠道中能否稳定存在，直接影响到药物制剂的药效。本发明按照中华人民共和国药典2005版，以粒径和包封率为指标，考察OA-SLN在人工胃、肠液中的稳定性，结果表明OA-SLN在人工胃液或肠液中24h之内，粒径略有增加，但无显著变化。在人工胃液3h，人工肠液中12h，制剂的包封率无明显变化。

5.该发明的创新点之五在于发现该OA-SLN制剂生物利用度显著提高。

SD大鼠灌胃给药，OA-SLN的AUC与OA混悬液相比，提高了近3.9倍，Cmax提高了23倍，达峰时间Tmax无显著性变化，均在半小时左右。OA与OA-SLN的表观分布容积(Vz/F)和表观清除率(Cl/F)也有显著不同。其中，OA的Vz/F为1535.75L/Kg，是OA-SLN的10倍。OA的清除速率明显高于制剂组。以上结果表明，OA-SLN较OA的肠吸收速率得到明显提高，SLN有明显改善OA肠渗透性，促进肠吸收的作用。该制剂生物利用度的提高为发挥药效奠定了基础。

6.该发明的创新点之六在于发现该OA-SLN制剂在肠道内的吸收部位主要在于小肠部分，即十二指肠、空肠、回肠。

OA经SLN包载后小肠粘附性增加了1.69倍，为药物与肠粘膜的接触提供了更多的机会，有利于肠粘膜对药物的吸收。大鼠原位在体肠灌流实验结果显示，大鼠在体肠循环120min后，OA-SLN在十二指肠、空肠、回肠中的累积吸收百分率分别在45％以上，60min内，十二指肠的吸收速度大于空肠与回肠；而OA-SLN在结肠中的累积吸收百分率为25.81±0.93％，明显低于其他三个肠段。说明OA-SLN的主要吸收部位在小肠，这可能与小肠的生理结构有关，小肠的皱皱和绒毛使得肠腔内表面积大大增加，为药物在吸收部位的有效吸收提供了可能。

7.该发明的创新点之七在于发现SLN制剂的肠粘膜转运机制为细胞间隙和跨细胞转运的协同作用，其中跨细胞转运是主要的转运途径。SLN的细胞摄取受到P-gp外排作用的影响。

本发明采用三种方法研究了SLN肠粘膜转运机制。激光共聚焦显微镜成像结果表明：SLN载体对跨细胞转运和细胞旁路转运均有促进作用。SLN给药系统的跨膜转运可能存在跨细胞转运和细胞旁路转运两种途径，其中以跨细胞转运途径为主。荧光偏振研究结果表明：SLN所用的表面活性剂Tween-80，以及空白药物载体SLN均可显著增加细胞膜的流动性。细胞膜流动性的改变有利于紧密连接的打开以及药物的跨细胞膜转运。细胞透过性实验结果表明，SLN给药系统为P-gp的底物，其吸收受到P-gp外排作用的影响。

附图说明

图1.齐墩果酸的分子结构图。

图2.OA-SLN的透射扫描图像，标尺为0.2um。

图3.OA-SLN与OA、SLN及OA+SLN X-粉末衍射图谱。其中a为OA，b为OA与SLN简单混合，c为空白SLN，d为OA-SLN。

图4.OA-SLN与OA、SLN及OA+SLN DSC图谱。其中a为OA，ΔH＝87.77J/g，熔点为312.41℃；b为OA与SLN简单混合，ΔH＝68.03J/g，熔点为60.34℃；c为OA-SLN，ΔH＝74.77J/g，熔点为59.98℃；d为空白SLN，ΔH＝72.50J/g，熔点为58.87℃。

图5.OA和OA-SLN体外释放曲线(n＝3)。

图6.药物与SLN的结合方式。其中a为药物以分子形式分散固体脂质纳米粒中，形成固溶体结构，体现出恒速率释放特征；b为脂质分子形成“核”，药物形成“壳”，包在脂质分子的外面，有明显的界面，释放时表现为短时间内的突释完全；c为药物被脂质分子包载在“核”中，在释放中体现出弛豫效应，即开始一段时间内药物释放为0，一段时间后，方出现释放。

图7.OA和OA-SLN大鼠灌胃后的血药动力学曲线。给药剂量为含OA10mg/kg(n＝6)。

图8.OA-SLN在肠道不同部位的吸收曲线。

图9.Caco-2细胞穿透实验装置图。在12孔细胞培养板上放入合适大小的

内腔为AP侧，Caco-2细胞种在

的聚碳酸酯膜上，

外腔为BL侧。细胞培养液充盈12孔细胞培养吧的培养孔。

图10.Caco-2细胞摄取香豆素-SLN的共聚焦显微镜图像。(a)为空白SLN；(b)为香豆素Coumarin-6；(c)为香豆素与SLN混合物；(d)为包载了香豆素的SLN，即Coumarin-6-SLN。

具体实施方式

实施例1OA-SLN脂材的选择

一、计算方法

脂材与药物的相容性决定了制剂的成功与否以及药物包封率的高低。通过计算脂材和药物的部分溶解度参数，比较各脂材与齐墩果酸之间部分溶解度参数的差，来选择合适脂材。部分溶解度参数的计算采用GCM^[6]法，计算公式如下：

${\mathrm{\δ}}_d=\frac{\mathrm{\Σ}{F}_d}{V};$ ${\mathrm{\δ}}_p=\frac{\sqrt{\mathrm{\Σ}{F}_p^2}}{V};$ ${\mathrm{\δ}}_h=\frac{\sqrt{\mathrm{\Σ}{E}_h}}{V}$

式中δ_d、δ_p、δ_h分别代表色散溶解度参数、极性溶解度参数和氢键溶解度参数，F_d、F_p、E_h分别代表色散力、偶极相互作用、氢键相互作用，V是药物的摩尔体积或聚合物分子中的重复结构单元的体积。

根据如下公式比较药物与类脂的部分溶解度参数的差别Δδ_p：

Δδ_p＝[(δ_d，l-δ_d，d)²+(δ_p，l-δ_p，d)²+(δ_h，l-δ_h，d)²]^1/2

式中δ_d，l为类脂的δ_d，δ_d，d为药物的δ_d，δ_p，l为类脂的δ_p，δ_p，d为药物的δ_p，δ_h，l为类脂的δ_h，δ_h，l为药物的δ_h。若Δδ_p越小，表示药物与类脂的部分溶解度参数越接近，即相容性越好。

本发明在长链脂肪酸和甘油酯中选择合适的脂材，选择范围为：硬脂酸SA，棕榈酸PA，单硬脂酸甘油酯GMS，单月桂酸甘油酯MLN，三硬脂酸甘油酯TSN，三棕榈酸甘油酯TPN，三油酸酯TON，三月桂酸甘油酯TLN。

二、结果和结论

计算部分溶解度参数，得到各个脂材与药物OA之间的部分溶解度参数之差，结果如表1所示。结果可知，GMS与OA的Δδ_p最小，相容性最好。由于单一脂材制备SLN易发生凝集聚沉现象，不稳定，而且据文献^[7]报道，合用多种脂材制备SLN，可防止单一晶体的形成，从而形成晶体缺陷，为药物提供更多的容纳空间，有利于提高包封率。因此本发明联用GMS和SA两种脂材。

表1脂材与OA的部分溶解度参数

实施例2OA-SLN制备工艺

按优化处方取适量OA，GMS，SA溶于乙醇中作为油相，配制3％Tween-80水溶液作为水相，两相均放置80℃～90℃水浴中恒温，平衡后，在水浴中，1000rpm电动搅拌下，迅速将乙醇溶液滴入至水相中，继续乳化搅拌，使乙醇完全挥发。溶液迅速至于0℃超声水浴固化10min，室温放置即得OA-SLN纳米混悬液。制备的OA-SLN包封率大于90％，载药率为4％～5％，平均粒径为70nm～150nm。

其优化处方：

OA∶GMS∶OA比例为1∶14∶6～1∶10∶10(重量比)，

油相与水相比例为1∶5～100∶1(重量比)，

乳化剂Tween-80的浓度为3％～5％(质量体积比)

实施例3OA-SLN结构构成考察

一、实验方法

1样品的制备

按实施例2方法，分别制备空白SLN、OA-SLN制剂，冷冻干燥(冻干温度-50℃，干燥时间24h，气压小于13Pa，冻干饼体积2mL)，得到干燥粉末。取空白SLN粉末与原料药OA以处方量相混合，得到物理混合物Mixture。

2X-粉末衍射

将上述制备的空白SLN，Mixture，OA-SLN粉末以及OA固体粉末分别于X-衍射仪扫描衍射谱。X射线衍射的扫描范围2θ为：10°～40°，Cu K_α靶，管电压60kV，管电流30mA，步长0.02°。

3差示扫描量热技术(DSC)

以空Al₂O₃坩锅为参比，另一Al₂O₃坩锅分别放入上述四个样品粉末，升温速度10℃·min^-1，扫描范围0℃～320℃。扫描得到四个样品的DSC谱图。

4制剂的体外释放研究

精密吸取1mLOA-SLN或者1mLOA乙醇(1mg/mL)溶液制剂于50KDa透析袋中，同时加入1mL释放介质稀释，透析袋两端扎紧后放入含有100mL释放介质的三角瓶中，三角瓶置于37±0.5℃，100rpm的气浴振荡器中，分别于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0h取出0.5mL释放介质，同时补充等量的空白介质。将所取样品用0.22μm微孔滤器过滤后，HPLC测定释放介质中的OA含量。计算累积释放百分数p％，绘制释放曲线。

$p\%=\frac{C_t}{C_0}\×100\%$

式中，C_t为t时刻释放介质中OA的浓度，C₀为透析袋内OA-SLN或OA乙醇溶液完全分散在100mL释放介质中时OA的浓度。

二、结果和结论

1.透射扫描电镜(TEM)下观察OA-SLN的形态，结果如图2所示。从图中可知，OA-SLN粒子圆整，分布均匀，粒径在100nm左右。

2.OA-SLN的X-衍射图谱见图3。OA-SLN制剂中OA特征衍射峰(12.8°，13.6°，15.1°，15.4°)消失，，表明在制剂中OA以分子形式分散，失去晶体结构特征。OA-SLN的DSC谱图见图4。OA在310℃左右出现尖锐吸热峰，与其熔点相一致。OA-SLN谱图中，OA特征吸热峰消失，说明了OA与脂材间相容性很好，在升温过程中有可能溶于脂材中。

3.游离药物组和OA-SLN组的累积释放曲线见图5。游离药物组在4h内，累积释放41.89％，而OA-SLN组仅释放14.82％。12h内，游离药物组几乎释放完全，累积释放百分数达到89.94％，而OA-SLN仅释放54.42％。

分别用零级、一级动力学方程、Higuchi、Peppas、Niebergull方程[8]对游离药物组和制剂组的累积释放百分率(Y)及时间(t)的关系作线性拟合。拟合方程参数计算以及相关性如表2所示。

表2累计释放率(Y/％)与时间(t/h)的关系拟合方程和相关系数

从拟合结果可以看出，OA的释放与Higuchi方程拟合良好，而OA-SLN的释放符合零级动力学方程，表现为恒速释放，释放速率为4.883％/h。这是由于随着释放介质对脂材的溶蚀速率为释放的控制步骤，使得药物经脂材溶蚀后以恒定速率释放。

上述X-RD、DSC及释放结果共同互相验证表明，OA是以分子形式分散至载体材料中，两者形成了固溶体，如图6中a所示。

实施例4OA-SLN制剂在人工胃肠液中的稳定性

一、实验方法

按照中华人民共和国药典2005版，配制人工胃液和肠液。分别取OA-SLN(1mg/mL)制剂1mL，加入至50mL人工胃液或人工肠液中，37℃水浴放置，分别在0，1，2，3，5，8，12，24h取2mL分散制剂，过0.45um滤膜，测定平均粒径。

分别取OA-SLN(1mg/mL)制剂1mL，加入至4mL人工胃液或人工肠液中，室温放置，分别在0，1，2，3，5，8，12，24h取0.5mL分散制剂，通过柱分离法和HPLC法测定不同时间点的制剂包封率。

二、结果和结论

分别以制剂粒径及包封率为考察指标，OA-SLN在人工胃液或人工肠液中的稳定性结果见表3。从表中数据结果可以看出，OA-SLN在人工胃液或肠液中24h之内，粒径略有增加，但无明显变化。在人工胃液3h内，制剂的包封率无明显变化；在人工肠液中12h，制剂的包封率无明显变化；在人工肠液中24h，包封率有所下降，可能是胰酶对脂材酶解的结果^[9]。实验结果表明，在12h内，OA-SLN在人工胃液/肠液中可以稳定存在。

表3OA-SLN在人工胃液和肠液中的稳定性(mean±SD，n＝3)

A.G.J表示人工胃液；A.I.J表示人工肠液

实施例5OA-SLN制剂在大鼠体内的血药动力学

一、实验方法：

1实验动物的准备

实验条件：温度20-25℃，湿度50-60％，自然光照明，每笼6只，自由食用饲料、自由饮水。实验前24h禁食，自由饮水。

2实验分组

选取体重为200±20g的SD雄性大鼠12只，随机分为两组，每组六只。一组口服给OA混悬液，一组口服给OA-SLN。

3口服供试液的制备

OA混悬液：准确称量10.0mgOA，滴数滴甘油润湿，用1％CMC-Na水溶液稀释、超声定容至10mL，得到OA浓度为1mg/mL的游离OA供试液。

OA-SLN供试液：按照本文第一章制备方法制得OA-SLN，得到含OA浓度为1mg/mL的OA-SLN供试液。

4给药方案及血样的采集

实验前大鼠禁食24h，自由饮水。各组动物称重后按10mg/kg体重分别灌胃给予OA混悬液或者OA-SLN供试液。分别于给药后5min、15min、30min、45min、1.0h、2.0h、4.0h、8.0h、12.0h、24.0h从大鼠眼眶后静脉丛取0.2mL血液至肝素化具塞EP管中，用手轻弹EP管，防止肝素分布不均而凝血，室温下放置10～20min后离心，10000rpm，5min。吸取上层血浆于另一干净的EP管内，-20℃下放置待测。

5血样处理及OA含量测定

精密吸取40μL血浆至试管中，加入5μL内标溶液，涡旋1min。加入150μL乙腈及40μLNH₄Ac(5M)，涡旋1min。15000rpm离心5min。取上清液100μL，加水25μL，涡旋1min。6.0μL进样，70％分流，进行HPLC-MS/MS测定OA含量。将OA的峰面积与内标物GA峰面积之比A_OA/A_GA分别代入OA的标准曲线方程，计算样品中所含OA的浓度C。

6数据处理

血药浓度数据采用美国Phoenix WinNonlin Connect NLME软件(version 6.0，PharsightCorp.，Mountain View，CA，USA)的非房室模型以及Microsoft Office Excel 2007对药动学数据进行处理，计算药时曲线下面积(AUC)、平均驻留时间(MRT)、表观分布容积(V_z/F)、表观清除率(Cl/F)、OA-SLN相对生物利用度F_r。其中F_r计算公式如下：

F_r＝AUC_0-24(OA-SLN)/AUC_0-24(OA)×100％

二、实验结果

1各组血药浓度及药时曲线

游离药物OA组以及OA-SLN组药时曲线如图7所示。

2药动学参数的计算及统计

采用Phoenix WinNonlin Connect NLME软件(version 6.0，Pharsight Corp.，Mountain View，CA，USA)的非房室模型对两组药物口服给药后的血药浓度数据进行处理，得到各动力学参数，结果如表4所示。

SD大鼠灌胃给药，OA-SLN的AUC与OA混悬液相比，提高了近3.9倍，C_max提高了23倍，经统计学检验，具有显著性差异(P＜0.01)。制剂组达峰时间T_max与原料药OA混悬液无显著性差异，均在半小时左右。OA-SLN组的平均驻留时间(MRT)为3.91h，而原料药组的MRT为17.03h，具有显著性差异(P＜0.01)。原料药OA与OA-SLN的表观分布容积(V_z/F)和表观清除率(Cl/F)也有显著不同。其中，原料药OA的V_z/F为1535.75L/Kg，是OA-SLN的10倍。原料药OA的清除速率明显高于制剂组。

表4OA和OA-SLN经大鼠口服灌胃后药动学参数(mean±SD，n＝6)

^**P＜0.01 vs Free OA

实施例6OA-SLN制剂在大鼠胃肠道的吸收部位

一、实验方法 ^[10-13] ：

大鼠各肠段区间如下：十二指肠自幽门2cm处开始；空肠段离幽门15cm处开始；回肠段离盲肠上行20cm处开始；结肠段从盲肠后段开始。

SD大鼠禁食24h，自由饮水。大鼠腹腔注射15％乌拉坦生理盐水溶液(10mL/kg)进行全身麻醉，待大鼠完全麻醉后进行固定，沿腹部正中线切开腹部。找到所需实验肠段10cm，两端插管并结扎，用50mLK氏液清洗空肠段后，以空气排出K氏液以及肠腔内液。将肠段与蠕动泵连接形成循环回流体系，加入恒温37℃的灌流液25mL，以2mL/min的速率进行循环回流，分别于回流后0、10、20、30、40、60、90、120min取出0.5mL灌流液，并相应补充0.5mL的新鲜酚红补充液。

将取出的样品200μL，加入10倍体积的0.1MNaoH溶液显色，测度ABS，根据酚红含量测定标准曲线，计算出酚红浓度C_t-phenol。根据下列公式对取样时间点是的灌流液体积进行校正。

$V_t=\frac{C_{0-\mathrm{phenol}}\·V_0}{C_{t-\mathrm{phenol}}}$

其中，V_t为t时刻的灌流液体积，C_t-phenol为t时刻灌流液中酚红浓度，V₀为灌流液初始体积，C_0-phenol为灌流液初始酚红浓度。

另取260μL样品，加入2倍体积的HPLC流动相，涡旋混匀，按本章第二节建立的HPLC法测定OA含量。计算药物吸收百分率Absorption％，计算如下：

$\mathrm{Absorption}\%=(1-\frac{C_{t-\mathrm{OA}}\·V_t}{C_{0-\mathrm{OA}}\·V_0})\×100\%$

其中，C_t-OA为灌流开始后t时刻灌流液中OA的浓度，V_t为t时刻灌流液的体积。C_0-OA为灌流液初始的OA浓度，V₀为灌流液初始体积。

二、结果和结论

OA-SLN在大鼠不同肠段的吸收情况图8所示。大鼠在体肠循环120min后，OA-SLN在十二指肠、空肠、回肠中的累积吸收百分率分别为46.39±5.21％、47.88±3.56％、45.76±2.55％，无显著性差异；OA-SLN在结肠中的累积吸收百分率为25.81±0.93％，明显低于其他三个肠段。测定结果表明，OA-SLN制剂在肠道的主要吸收部位在肠道上段的十二指肠、空肠和回肠。OA-SLN在三个肠段的吸收速率略有差异，从图8中吸收曲线可见，十二指肠在60min内的吸收速率大于空肠和回肠，而空肠和会场的吸收速率无显著差别。

实施例7OA-SLN制剂在大鼠胃肠道的吸收机制

为了考察SLN载体与细胞间的相互作用以及载体的促进药物吸收机制，我们将SLN包载模型药物香豆素6(Coumarin-6)。优点在于：Coumarin-6的检测方法简单方便，而且采用荧光分光光度法检测，灵敏度高，检测限低，避免了常规药物需要比较高的给药量才能定量检测的缺点。

一、实验方法：

1.激光共聚焦显微镜法

将融合90％以上的Caco-2细胞消化后，计数，用培养液稀释成2×10⁵个/mL的细胞悬液。于24孔细胞培养板中，放入圆形薄盖玻片，将上述细胞悬液0.5mL接种于24孔板的盖玻片上。隔天换液，培养5天，于显微镜下观察，细胞基本融合，可用于实验。

去除细胞培养液，用HBSS平衡液轻轻洗两遍，加入HBSS平衡液0.5mL，在37℃细胞培养箱中孵育30min。去除HBSS平衡盐溶液，加入供试液37℃避光孵育1.5h。

加入药物于细胞培养箱中孵育1.5h后，吸除药物，用PBS轻轻洗三遍，然后用组织细胞固定液室温下10min固定细胞；0.1％TritonX-100抽提3-5min；PBS洗涤两次；1％BSA封闭蛋白30min；移除后加入Rhodamin-Phalloidin，37℃对细胞骨架染色20min；随后加入Hochest33528室温下反对细胞核染色20min；PBS-甘油(1∶1)封片，激光共聚焦显微镜下观察。

2.荧光偏振法^[14-15]

DPH全称为1，6-二苯基-1，3，5-己三烯，它是非极性分子，在极性水溶液中，荧光强度很弱；但当插入膜脂双层结构，平行排列在膜脂分子的疏水链间，荧光增强，其激发波长为362nm左右，发射波长为430nm左右。以DPH标记脂质膜，通过荧光偏振P的测量，表示流动性越小。P值越大，微粘度越大，反之则流动性越大。

用过量乌拉坦麻醉大鼠致死。打开腹腔，取出小肠中段，用PBS(pH 7.4)冲洗干净。轻轻刮下粘膜层。用超声细胞粉碎仪超声2min，使粘膜破碎成为悬液。12000r·min^-1离心20min，得到细胞膜沉淀。称重(湿重)，加PBS重新分散成10mg·ml^-1的肠上皮细胞膜悬液。

取上述制备的浓度为10mg·ml^-1的肠上皮细胞膜悬液3ml，分别加入待测溶液3mL，在37℃下孵育30min。每组平行3个样本。

用四氢呋喃做溶剂，配制2×10^-3M的DPH溶液10ml。在上述孵育的肠粘膜溶液中各加入DPH溶液6μl，常温下孵育1.5h，测荧光各向异性值r。发射波长430nm，激发波长362nm。

由荧光偏振仪直接测得荧光各向异性r。按照如下公式计算荧光偏振度P和粘滞系数η。用SPSS软件进行统计学分析，判断各组别是否具有显著性差异。

$P=\frac{3r}{2+r}$ $\mathrm{\η}=\frac{2P}{0.46-P}$

3.Caco-2细胞模型通透率测定法

将融合达到90％的Caco-2细胞消化后，计数，用培养液稀释成2×10⁵个/mL的细胞悬液。在

的顶端绒毛面(AP侧)加入0.5mL的细胞悬液，底端基底面(BL侧)加入1.5mL不含细胞的培养液，将

板置于5％CO2、相对湿度为90％、37℃的恒温培养箱中进行培养。第二天换液，分别吸去AP、BL侧的培养液，再分别加入0.5、1.5mL的新鲜培养液。第2-7天隔天换AP和BL侧培养液，第8-14天每天换AP侧培养液，隔天换BL侧培养液，第15-21天每天换AP和BL侧培养液。培养至21天后，通过测定Caco-2细胞单层跨膜电阻(TEER)的大小来确定细胞单层膜的完整性：将上皮细胞电阻仪的长端插入的BL侧，短端插入

的AP侧测定TEER值。TEER值大于600Ω/cm²的单层膜用于细胞转运实验。Caco-2单层细胞模型示意图如图9所示。

选取TEER值大于600Ω/cm²的Caco-2单层细胞模型用于转运实验。

轻轻吸去

两侧的培养液，在AP和BL侧分别加入0.5mL、1.5mL的HBSS，轻轻摇动后吸去HBSS，同法操作两次，再在AP和BL侧分别加入0.5mL、1.5mL的HBSS后在37℃培养箱中平衡30min后用于转运实验。

在AP-BL转运实验中，移去

板两侧的HBSS，在AP侧加入0.5mL供试液，在BL侧加入1.5mL新鲜HBSS；在BL-AP转运实验中，在AP侧加入0.5mLHBSS，在BL侧加入1.5mL新鲜供试液。

将

板置于37℃温浴摇床中进行振摇，注意避光，分别于转运开始后0.5、1.0、1.5、2.0h后从接收侧精确取100μL溶液，测定Coumarin-6含量，并相应补充100μL新鲜HBSS。按本章第三节项下方法测定Coumarin-6浓度，并计算Coumarin-6的表观渗透系数P_app，以评价药物的跨膜转运速率。

$P_{\mathrm{app}}=\frac{\mathrm{dQ}}{\mathrm{dt}}\·\frac{1}{C_{0}A}$

其中，dQ/dt为单位时间内跨膜转运的药量，C₀为初始给药浓度，A为跨膜转运所经过的面积。转运过程中，监测TEER，2h后均大于600Ω/cm²，无明显变化。

跨膜透过率T％(Transmissivity％)计算公式如下

$T\%=\frac{{\mathrm{dQ}}_T}{d{Q}_0}$

其中，dQ_T为一定时间内转运过膜的Coumarin-6的量，dQ₀为Coumarin-6的初始给药量。

以T％对测定时间t(hour)作图，得药物经细胞转运动力学曲线，以此评价药物转运能力。

二、结果与结论

1激光共聚焦图谱

各组细胞在激光共聚焦显微镜的观察结果如图10所示，图中蓝色为细胞核染色，红色为细胞骨架染色，绿色为药物Coumarin-6荧光，每组最后一张图片为三通道图像叠加照片。从图像结果可以看出，各组细胞完好无损，表明用于实验的细胞活性良好。空白组(a图)中，可见单个细胞核，细胞骨架轮廓清晰，未见Coumarin-6的特征绿色荧光。在游离药物组(b图)中，细胞摄取Coumarin-6量较少，在胞浆内仅见少量荧光。c图为Coumarin-6与空白SLN物理混合组，与b图相比，胞浆内荧光强度有所增加，且在细胞间隙出现少量荧光斑点，间隙出现药物Coumarin-6的荧光，说明紧密连接被打开，部分药物通过细胞间隙转运。d组为Coumarin-6-SLN制剂组，与c组和b组相比较，Coumarin-6绿色荧光强度更强，充满胞浆，药物的细胞摄取量明显大于混合组和游离药物组，可以说明Coumarin-6-SLN的转运是跨细胞途径为主的转运过程。综上所述，Coumarin-6-SLN的转运包括两条途径，一为通过打开紧密连接，实现细胞间隙转运，另一为跨细胞转运。其中跨细胞转运是主要的转运途径。

2荧光探针法

由FLS920稳态瞬态荧光光谱仪可直接测得各组荧光各向异性r，以及按照实验原理中的公式求得p、η的计算结果列入表5。与空白对照组比较，阳性对照lecithin可以非常显著地改变细胞膜的流动性(p＜0.01)，同样Tween-80组和SLN组也可非常显著地改变肠上皮细胞膜的流动性(p＜0.01)。说明Tween-80和空白SLN制剂均具有一定改善细胞膜流动性的作用。值得注意的是，SLN组与Tween-80组比较，也具有显著性差异(p＜0.01)。由于本发明所制备的SLN给药系统是由GMS和SA组成的纳米粒子分散在3％Tween-80形成的液体制剂，这说明SLN改善细胞膜流动性，除了受到Tween-80影响以外，还有很大一部分是来自于SLN粒子本身的组成和结构。

表5各种材料细对细胞膜流动性影响参数r、p、η(mean±SD，n＝3)

vs control ^*P＜0.05；^**p＜0.01

vs Tween-80^#P＜0.05；^##p＜0.01

3Caco-2细胞通透率实验

不同Coumarin-6形式的细胞转运实验，经时转运透过率表6所示。从结果可以看出，游离药物Coumarin-6跨膜转运能力较低，2小时透过率仅为0.52％。在AP-BL转运方向实验中，Mixture、Coumarin-6-SLN和Coumarin-6-SLN+Verapamil组都显著提高了模型药物Coumarin-6的跨膜透过率，其透过率大小顺序为SLN+Verapamil＞Coumarin-6-SLN＞Mixture。

表6不同药物组在Caco-2细胞模型上的通透率(mean±SD，n＝4)

各组的表观渗透系数P_app结果如表7所示。Coumarin-6原料药从AP侧向BL侧转运时，P_app仅为3.02×10^-7cm·s^-1，其他组别的P_app均显著大于Coumarin-6原料药组。P_app大小顺序为：SLN+Verapamil＞Coumarin-6-SLN＞Mixture。由结果可知，Coumarin-6与空白SLN混合即可显著提高表观渗透系数P_app，当药物包载在SLN上形成的Coumarin-6-SLN，其表观渗透系数P_app得到进一步提高，与混合组相比，具有统计学显著性(p＜0.01)，说明SLN对药物的转运具有一定的促进作用，尤以制剂组的整体转运更为显著。当受试液中加入P-gp抑制剂Verapamil后，Caco-2模型的外排作用收到抑制，使得SLN给药系统的药物转运更加明显。这提示我们SLN给药系统跨膜转运中受到p-gp的外排作用，在制剂中加入抑制剂，可进一步提高药物的吸收转运。

Coumarin-6-SLN从B-A转运的P_app略大于从A-B转运的P_app，但二者无统计学意义。

表7不同药物组在Caco-2细胞模型上的通透系数P_app

^*p＜0.05vs Coumarin-6；^**p＜0.01vs Coumarin-6；^##p＜0.01vs SLN(A-B)

A-B：表示从AP端到BL端的转运；B-A：表示从BL端到AP端的转运

结论：

SLN口服给药系统促进药物吸收转运的机制有：(1)SLN通过增加细胞膜流动性，打开细胞间紧密连接，促进药物的细胞旁路转运；(2)SLN的主要转运途径为跨细胞转运，通过增加细胞膜流动性，加大与细胞膜融合摄取的机会。(3)SLN的细胞摄取受到P-gp外排作用的影响。

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Claims (8)

1.一种用于口服给药的齐墩果酸固体脂质纳米粒制剂，其特征在于，该制剂含有类脂材料、表面活性剂、药物齐墩果酸。所述类脂材料为单硬脂酸甘油酯和硬脂酸；所述表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯Tween-80。

2.根据权利要求1所述的制剂，该制剂为口服悬浮液、片剂、胶囊。

3.权利要求1所述制剂的制备方法，其特征为乳化-溶剂挥发法。具体步骤如下：取适量齐墩果酸OA，单硬脂酸甘油酯GMS，硬脂酸SA溶于乙醇中作为油相，配制合适度的Tween-80水溶液作为水相，两相均放置80℃～90℃水浴中恒温，平衡后，在水浴中，1000rpm电动搅拌下，迅速将乙醇溶液滴入至水相中，继续乳化搅拌，使乙醇完全挥发。溶液迅速至于0℃超声水浴固化10min，室温放置即得OA-SLN纳米混悬液。

4.权利要求1所述的制剂在结构上位固溶体结构，OA以分子形式分散于固体脂质纳米粒组成基质中。

5.权利要求1所述的制剂在人工胃液及肠液中具有良好的稳定性，能够维持固体纳米粒形态发挥药效，有利于口服给药。

6.权利要求1所述的制剂生物利用度较OA混悬液提高了近3.9倍，达峰浓度Cmax提高了23倍。

7.权利要求1所述的制剂在肠道内的吸收部位主要在于小肠部分，即十二指肠、空肠、回肠。

8.权利要求1所述的制剂口服后在肠道的转运机制为细胞间隙和跨细胞转运的协同作用，其中跨细胞转运是主要的转运途径。SLN的细胞摄取受到P-gp外排作用的影响。

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