CN102676532B - 通过mda-pcr富集基因组重排免疫球蛋白基因及生产抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种特异地扩增基因组的重排免疫球蛋白基因的方法，包括：裂解成熟的B细胞；用多重置换扩增的方法，通过能够特异地扩增抗体重链和/或轻链的可变区的引物扩增所述B细胞的基因组基因，从而相对特异地从基因组扩增包含重链和/或轻链的可变区的序列；以所述多重置换扩增所得的反应液为底物，用特异地结合所述抗体重链和/或轻链的可变区的引物进行PCR扩增，以获得所述抗体重链或轻链的可变区的基因序列；对所得到的PCR产物测序，以确定PCR扩增得到所述抗体重链或轻链的可变区的基因序列。通过本发明的方法获取重排的免疫球蛋白基因并利用该基因生产抗体。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的抗体生产的方法，更具体地，涉及一种通过MDA-PCR富集基因组重排免疫球蛋白基因，并利用该基因进行抗体生产的方法。
背景技术
动物机体的体液免疫主要是通过B细胞所分泌的抗体完成的。如图1中所示，抗体由四条多肽链组成，其中两条较长、分子量相对较大的链为重链(也称为H链)；两条较短、分子量相对较小的链为轻链(也称为L链)。链间由二硫键和非共价键联结。轻链有κ和λ两种，重链有μ、δ、γ、ε和α五种。整个抗体分子可分为恒定区(也称为C区)和可变区(也称为V区)两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于抗体″Y″形结构的两臂的末端。一个抗体分子上的两个可变区是相同的，也称为抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab)，参与抗体与抗原的特异性结合。
尽管人体的所有细胞均起源于一个相同的受精卵，即应该具有相同的基因组基因，但B细胞却能分泌出多种具有不同序列的抗体，究其原因是由于在B细胞分化成熟的过程中经历了基因重排的过程。胚系状态的抗体基因，无论是重链基因还是轻链基因，都不能作为一个独立的单位进行表达，只有经过重排以后才能成为具有表达功能的基因。编码一条抗体多肽链的基因是由在胚系中多个分隔的基因片段经重排而形成的。
下面简单介绍人抗体基因的结构：
人类重链基因位于第14号染色体上，如图2中所示，基因结构非常复杂，分为4个不连续的基因节段，从着丝点5′末端起依次为：可变区(VH)基因、多样性区(diversity region，DH)基因、接合区(JH)基因和恒定区(CH)基因。VH基因片段编码VH的信号序列和V区靠N端98个氨基酸残基，包括CDR1和CDR2，小鼠VH基因段约为250～1000，人的VH基因片段约为100；DH基因片段仅存在于H链，不存在于L链，DH基因编码H链CDR3中大部分氨基酸残基，小鼠DH共有12个片段，人的DH片段共有25个；JH基因编码连接V区和C区的片段，小鼠JH有4个，人有9个JH片段，其中6个是有功能的；CH基因编码恒定区。
V区基因分成6个亚群，在2500kD的区域内排列有100～200个基因。某些大亚群如VHIII含有约25～30个基因，而某些小亚群如VHV或VHVI仅含一个或几个基因。在VH座内还有一些不具表达功能的假基因。
C基因结构约200kb，含有11个基因。第一个CH为Cμ，以后依次为：Cδ、Cγ3、Cγ1、Cα1、
Cγ2、Cγ4、Cε、Cα2。其中(不在第14号染色体上)和
是两个假基因。除Cδ基因外，其他CH基因上游都有一个转换(S)顺序，负责H链的类转换。
轻链的基因比重链的基因结构简单，如图2所示，仅有V区和J区而无D基因节段。κ链和λ链的基因互不相同。
人类κ链基因位于第2号染色体上。Cκ基因只有一个，邻近上游的J区基因座位内有5个Jκ基因，Vκ基因节段大约有80个Vκ基因，约一半以上可能是假基因。
λ链基因位于第22号染色体上。Cλ基因簇比Cκ基因复杂得多，至少有6个非等位基因，其中2个为假基因；每个功能Cλ基因前均有一个(或更多)相关的Jκ基因；对Vλ基因库目前所知甚少，其基因数目尚不清楚。
在B细胞成熟过程中，Ig基因存在重排的现象。在多能造血干细胞分化发育成为幼稚B细胞(又称前B细胞)时，就发生V-D-J重排，开始表达H链。在成熟抗体基因的产生过程中，抗体基因的重排需遵循一定的顺序，先由V-J连接或V-D-J连接，然后由VJ或VDJ与C区基因连接(图3)。在重链，还可以发生类转换。轻链的V-J连接和重链的V-J-D连接都是在DNA水平发生，均由重组酶介导。V-J或V-D-J的组合都是随机的；重组后的V-J编码轻链的V区，V-D-J编码重链的V区。
一个机体何以能产生多达106～108种具有不同抗体特异性的Ig分子，其机制至今虽未完全清楚，但从基因的结构组成及重排中可找到一些答案。众多V区基因和一个或少数几个C区基因不连续地排列在染色体上，它们在DNA水平随机地结合是Ig分子多样性的基础，而体细胞突变又可增大V区的库容。
多样性程度可以通过Ig基因在染色体内重组时V-J与V-D-J的乘积来计算：当100个Vκ和5个Jκ重组时所产生的多样性至少是100×5＝5×102个；V-D-J重排时100个VH与10个DH和6个JH连接所的生的多样性至少有100×10×6＝6×103。同时连接这些基因时还会发生不精确性而使多样性增加，因而由κ链和H链组成的抗体分子的多样性最少有5×102×6×103＝3×106之多。另外，在V-J、V-D-J连接过程中发生的碱基缺失和插入又扩大了多样性的程度。
随着医学和分子生物学技术的不断发展，抗体作为一种治疗剂在多种疾病中发挥越来越重要的作用。例如，给予患者特异性的抗体以辅助机体进行免疫防御，或者将单克隆抗体与治疗性药物、毒素或放射剂结合进行靶向治疗等。而如何容易地制造出与特异抗原结合的抗体，尤其是单克隆抗体在大规模广泛地应用抗体进行的治疗中显得尤其重要。
传统的生产单克隆抗体的方法为杂交瘤的方法，利用杂交瘤的方法能够生产出仅针对一个抗原表位的抗体，抗体具有相同的特异性，缺点在于获得生产针对特定抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞的生产周期较长，且成功率极低，可谓“大海捞针”。
而利用原始文库的方法生产抗体，由于没有经过抗原提呈的过程，因此，抗体在亲和性方面表现不佳。
目前，利用RT-PCR技术，从分泌抗体的B细胞对mRNA进行逆转录和PCR，将PCR的产物克隆到真核表达系统中，以生产具有相同特异性的抗体，具有较杂交瘤技术更高效的前景。参见Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cellRT-PCR and expression vector cloning.Tiller T，Meffre E，Yurasov S，Tsuiji M，Nussenzweig MC，Wardemann H.J Immunol Methods.2008 May 20；334(1-2)：142以及Cloning and expression ofmurine Ig genes from single B cells.Tiller T，Busse CE，Wardemann H，J Immunol Methods.2009Oct 31；350(1-2)：183-93。该方法的缺点在于由于B细胞中的mRNA拷贝数很低，mRNA也很不稳定，导致样品制备很困难，而且需要经过逆转录和PCR等步骤，容易导致PCR污染，由于这些技术上的障碍，使该方法的大规模生产和应用受到限制，到目前为止，还仅局限于实验室研究阶段。
多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)：是一种最近发现的DNA扩增的方法，该方法利用phi29DNA聚合酶，在30℃的恒温下即可进行反应。该方法的特点是样本无需纯化，实现对全基因组的均匀扩增，可获得大量高分子量的DNA，且错配率较低。其扩增的机制是一种链置换反应，首先将随机六碱基核苷酸作为引物在多个位点与基因组模板DNA退火，接下来phi29DNA聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制，它沿着DNA模板合成DNA，同时取代模板的互补链。被置换的互补链又成为新的模板进行扩增，成为一个级联分支的放大系统。phi29DNA聚合酶对于模板有很强的模板结合能力，能够持续扩展至100kb而不从模板上解离，平均长度＞10kb。而且phi29DNA聚合酶具有高保真性，错配率仅为1∶106～1∶107，比Taq酶至少低100倍。因此，MDA扩增后的产物序列与模板高度一致，而且，能够获得大量高分子量的DNA。
上述利用随机六碱基寡核苷酸引物可以实现对全基因组的均匀扩增，这些全基因组DNA可用于诊断，如荧光原位杂交(Fluorescent In-site hybridization，FISH)等。然而，这样扩增的DNA片段由于序列的种类繁多，不适合作为PCR扩增目的基因的底物。
发明内容
现有技术中的使用RT-PCR克隆抗体mRNA的方法，由于mRNA很不稳定，且后续的巢式PCR步骤导致污染的机会较大，这些技术上的障碍使该方法还仅局限于实验室研究阶段。
在现有技术中，使用MDA的方法，利用随机六碱基寡核苷酸引物可对全基因组进行均匀扩增，而B细胞基因组中重排的免疫球蛋白基因为单拷贝的，如此扩增的DNA片段序列的种类繁多，免疫球蛋白基因在拷贝数上并不占优势，因此不适合作为扩增B细胞免疫球蛋白基因的底物。
因此，需要一种获取免疫球蛋白基因及能够高效地生产抗体的方法。该方法可应用于小鼠，但不局限于小鼠，可以是各种能够产生抗体的动物，例如人、大鼠、兔、骆驼等。
本发明提供了一种特异地扩增基因组的重排免疫球蛋白基因的方法，包括：裂解成熟的B细胞；用多重置换扩增的方法及能够特异地扩增抗体重链和/或轻链的可变区的引物扩增所述B细胞的基因组基因，从而相对特异地从基因组扩增包含重链和/或轻链的可变区的序列；以所述多重置换扩增所得的反应液为底物，用特异地针对所述抗体重链或轻链的可变区的引物进行PCR扩增，以获得所述抗体重链或轻链的可变区的基因序列；对所得到的PCR产物测序，以鉴定PCR扩增得到的序列是否为所述抗体重链或轻链的可变区的基因序列。
优选地，所述B细胞是经过抗原刺激产生的B细胞，包括记忆性B细胞。
优选地，在所述多重置换扩增方法中使用的引物与抗体重链和/或轻链的恒定区的基因序列特异地结合。
优选地，在所述多重置换扩增方法中使用的引物与抗体重链和/或轻链恒定区的内含子基因序列特异地结合。
优选地，在所述多重置换扩增方法中使用的引物与抗体基因重排相关序列，例如RSS(重组信号序列，recombination signal sequence)，包括七聚体(heptamer)CACAGTG和九聚体(nonamer)ACAAAAACC特异地结合。
优选地，在所述多重置换扩增方法中使用的针对小鼠IgG重链的引物具有如在表2中列出的mCH1-1、mCH1-2、mCH1-3、mCH1-4、mCH1-5、mCH1-6、mCH1-7、mCH1-8、mCH1-9、mCH1-10、mCH1-11和/或mCH1-12序列。
优选地，在所述多重置换扩增方法中使用的针对小鼠κ轻链的引物具有如在表2中列出的mCK1、mCK2、mCK3、mCK4、mCK5、mCK6、mCK7、mCK8、mCK9、mCK10、mCK11和mCK12序列的混合物。
优选地，在所述多重置换扩增方法中使用的针对小鼠λ轻链的引物具有如在表2中列出的mCL1、mCL2、mCL3、mCL4、mCL5、mCL6、mCL7、mCL8、mCL9、mCL10、mCL11和/或mCL12序列。
优选地，在所述PCR中使用的引物为针对小鼠的IgG重链可变区的引物对。
优选地，所述针对小鼠的IgG重链可变区的引物对为表4中列出的mVH和mJH序列。
优选地，在所述PCR中使用的引物为针对小鼠的κ轻链的引物对。
优选地，所述针对小鼠的κ轻链的引物对为表4中列出的靶基因为mVK和mJK的PCR引物序列。
优选地，在所述PCR中使用的引物为针对小鼠的λ轻链的引物对。
优选地，所述针对小鼠的λ轻链的引物对为表4中列出的靶基因为mVL12及mJL和/或mVL3及mJL的PCR引物序列。
本发明提供了一种生产抗体的方法，包括：将上述方法获得的免疫球蛋白基因序列克隆到表达系统中，在适当的条件下，在表达系统中表达免疫球蛋白基因序列。
优选地，还包括对所述免疫球蛋白进行测序和鉴定的步骤。
通过本发明的方法获取重排的免疫球蛋白基因并利用该基因生产抗体，是以基因组基因为底物，避免了现有的RT-PCR中的mRNA不稳定的缺点，由于MDA可在300C的恒温条件下进行扩增，后续的PCR也可以在进行MDA反应的容器中进行反应，因此步骤较简单，减少了后续污染的机会。本发明利用MDA-PCR进行免疫球蛋白基因的扩增，利用特异的引物，对基因组的免疫球蛋白基因实现了相对特异的扩增，以克服由于基因组免疫球蛋白基因是单拷贝而现有的MDA方法只能对全基因组实现均匀扩增所造成的缺陷。
附图说明
图1是抗体结构的示意图；
图2是抗体重链以及两种轻链κ链和λ链基因的示意图；
图3是抗体重链和轻链基因及重组示意图。
图4示出了通过MDA-PCR从B cell分离抗体基因的过程。重排的抗体基因通过用抗体基因特异的寡聚体MDA从分选的单个B细胞富集重排的抗体基因，以增加超过100倍的分子。该步骤克服了由于使用通用引物使在后续的PCR反应中的低退火效率的问题。将前面富集的抗体DNA作为模板(＞100拷贝)，PCR的扩增效率明显提高，能够达到检测水平。
图5示出了实施例1中利用MDA-PCR方法扩增的小鼠的记忆B细胞基因组DNA的重排IgH(抗体重链)和Igk(抗体的κ链)的可变区链。5A中通道6-10中是通过MDA富集后再行PCR扩增的IgH和Igk的可变区链，通道1-5中是不通过MDA富集，仅由PCR扩增的IgH和Igk的可变区链。5B中通道1-5是用随机六聚体引物通过MDA-PCR分离的IgH和Igk的可变区链，通道6-10是用抗体基因特异的引物通过MDA-PCR分离的IgH和Igk的可变区链。
图6示出了实施例2中利用MDA-PCR从单个B细胞分离的小鼠Ig基因。图6上部是用IgH引物通过PCR进一步扩增的MDA富集的基因组DNA，图6下部是用Igk引物通过PCR进一步扩增的MDA富集的基因组DNA。通道1、6、10等用箭头示出了获得与IgH和Igk扩增子匹配的孔。其中样品1、6、10、11、12、17、20、21(箭头指示的样品)的重链和轻链都获得了扩增的目的片段，说明该样品被成功地扩增了完整的抗体基因(包括重链和轻链)。
具体实施方式
需要说明的是，在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。本发明的附图及其实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。
实施例
步骤1：制备B细胞的裂解液
向含有小鼠B细胞的溶液中加入10μg/ml的蛋白酶K，在55℃的水浴中保持50分钟，以使细胞裂解，接着在95℃的水浴中保持10分钟，以使蛋白酶K灭活。
上述的过程可以在96孔板中进行，每个孔中加入4μl的含有10μg/ml的蛋白酶K的细胞裂解缓冲液，再向每个孔中加入含有很少量的含有小鼠B细胞的溶液。
上述的B细胞可以是经过基因重排的成熟的B细胞，也可以是从经过抗原刺激的动物体的淋巴结和脾获得的记忆性B细胞，上述的B细胞也可以经过流式细胞技术对其表面表达的抗体进行分选，获得表面表达具有特异结合能力的分子的B细胞。
步骤2：进行多重置换扩增(MDA)
向上述细胞裂解溶液中加入终浓度如表1中所列的溶液，进行MDA：
表1
| phi29反应缓冲液 | 浓度 |
| (NH4)2SO4 | 10mM |
| dNTP混合液 | 2mM |
| Tris-Hcl(ph7.5) | 50mM |
| MgCl2 | 10mM |
| DTT | 4mM |
| BSA | 200μg/mL |
| mCH1-1～mCH1-12混合液 | 2μM |
| mCK1～12或CL1～12混合液 | 2μM |
| Phi29聚合酶 | 1个单位 |
dNTP混合液：包含d ATP、d GTP、d CTP和d TTP的混合液；DTT：二硫苏糖醇；BSA：牛血清蛋白；mCH1-1～mCH1-12混合液：是指包含表2中的mCH1-1、mCH1-2、mCH1-3、mCH1-4、mCH1-5、mCH1-6、mCH1-7、mCH1-8、mCH1-9、mCH1-10、mCH1-11和mCH1-12的混合液，mCH(mouse constant heavy)是指与小鼠的重链恒定区结合的引物序列。mCK1～12混合液是指包含表2中的mCK1、mCK2、mCK3、mCK4、mCK5、mCK6、mCK7、mCK8、mCK9、mCK10、mCK11和mCK12的混合液，mCK(mouse constantκ)是指与小鼠的轻链κ链的恒定区结合的引物序列。CL1～12混合液是指包含表2中的mCL1、mCL2、mCL3、mCL4、mCL 5、mCL 6、mCL 7、mCL 8、mCL 9、mCL 10、mCL 11和mCL12的混合液，mCL(mouse constantλ)是指与小鼠的轻链λ链的恒定区结合的引物序列。
在表2中列出了在上述MDA中使用的各引物的序列：
反应的条件如下：30℃60分钟，一个循环；94℃10分钟，一个循环。94℃10分钟的目的是使phi29聚合酶灭活。
步骤3：PCR扩增
向50μl包含下列表3成分的PCR反应液中加入5μl上述的MDA扩增反应获得的反应液，对重链和轻链的可变区基因进行扩增。
表3
| PCR缓冲液 | 浓度 |
| Tris-SO4(pH 8.9) | 60mM |
| MgSO4 | 2mM |
| 甘油 | 1％ |
| (NH4)2SO4 | 18mM |
| dNTP混合液 | 2mM |
| VDJ PCR引物或VJ PCR引物 | 2μM |
| Taq DNA聚合酶 | 5个单位 |
VDJ PCR引物：是扩增抗体重链可变区的V-D-J基因的引物，如在表4中列出的以mVH和mJH为靶基因的PCR引物。
VJ PCR引物：是扩增抗体轻链可变区的V-J基因的引物，如在表4中列出的以mVK和mJK为靶基因的PCR引物(针对轻链中的κ链)或者以m VL1_2(和/或m VL3)和mJL为靶基因的PCR引物(针对轻链中的λ链)。
在表4中列出了在上述PCR中使用的各引物的序列：
接头：又称adaptor，是指一段人为设计的DNA序列，其中含有需要的内切酶识别序列，或测序引物结合序列。将含有表达载体的克隆位点内切酶序列的adopter置于IgH，IgL，IgK可变区PCR引物两端的目的，是在获得PCR产物后直接对其进行内切酶消化，并克隆入表达载体。
反应的条件如下：94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒，50个循环；72℃5分钟，一个循环。
可选地，本发明的方法还可以包括：对通过MDA-PCR的方法获得的抗体重链或轻链可变区的基因进行测序以鉴定获得的目的序列是否需要的序列，以及将通过MDA-PCR的方法获得的抗体重链或轻链可变区的基因克隆到真核表达系统，以进行蛋白质的表达、纯化和鉴定的步骤。
结果
以下是根据上面所述的方法通过MDA-PCR富集基因组重排免疫球蛋白基因的两个实施例的结果。
实施例1
图5A的通道1-5以及通道6-10的分析针对的是连续稀释的小鼠B细胞(约1000、100、10、1、0.1个细胞)。在细胞裂解之后(步骤1)，针对VH(390～400bp)和Vk(370～380bp)基因进行或不进行MDA富集(步骤2)，然后通过PCR扩增(步骤3)，其中通道1-5仅进行了PCR，通道6-10进行了MDA-PCR，如图5A所示，在每管仅有单个细胞的反应管中就可以同时扩增出VH和Vk基因(通道9)，如果没有进行MDA富集，仅仅在100和1000细胞水平能够检测到IgH基因(通道2和1)。其中图5A的通道6-10和图5B的通道6-10进行MDA的引物都是表2的特异引物。图5A的通道1-5是没有经过MDA扩增直接进行PCR的结果，图5B的通道1-5是经过随机六聚体引物进行MDA扩增后再行PCR的结果。在图5B的通道6-10示出了利用表2中的抗体基因特异性引物混合物进行MDA富集，下游的PCR能够扩增单个B细胞的VH和Vk基因(通道9)，然而通道1-5示出了无法用随机六聚物扩增VH和Vk基因扩增出VH和Vk基因(在图5B中也是连续稀释的小鼠B细胞，梯度与图5A相同)。图5A示出了进行MDA富集(通道6-10)/没有进行MDA富集(通道1-5)的IgH和Igk扩增，图5B示出了用随机引物(通道1-5)/Ig基因特异性引物(通道6-10)通过MDA-PCR分离的IgH和Igk。图5中，在图5A中，通道15是没有经过MDA扩增直接进行PCR的产物；通道610是经过表2中的特异引物进行MDA扩增后，进行PCR的产物；通道110的PCR引物见表3。在图5B中，通道15是用随机六聚体引物进行了MDA扩增后进行PCR的产物，通道610是用特异引物进行MDA扩增后再进行PCR的产物，PCR引物见表3。
实施例2
实施例2是通过MDA-PCR从单个B细胞分离小鼠抗体基因。利用荧光激活的细胞分选(FACS)，单个小鼠κ型记忆性B细胞分布在96孔板中，然后进行MDA富集。分别通过IgH(图6，上部)或Igk(图6，下部)引物进一步PCR扩增MDA富集的基因组DNA。图6包括上下两块胶，通道是对应的。上面的胶显示的是样品1-24的重链(IgH)PCR扩增结果，下面的胶显示的是样品1-24的轻链(Igk)PCR扩增结果。其中样品1、6、10、11、12、17、20、21(箭头指示的样品)的重链和轻链都获得了扩增的目的片段，说明该样品被成功地扩增了完整的抗体基因(包括重链和轻链)，那些仅获得一条链扩增的样品，实际不能获得完整的抗体分子。。对扩增子进行测序证明了PCR产物分别是来自小鼠VHDJ和VKJ。该实施例中进行MDA的引物为表2中的特异引物，PCR引物见表3。
尽管本发明的已经通过具体实施方式在上下文中进行了描述，但是本发明并不仅限于此。因此，以上的描述不应该当作是本发明范围的限制，本发明的范围由所附的权利要求进行限定。本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的精神的情况下可以对本发明作出各种改变和变更，其都将落入在本发明的保护范围内。
Claims (15)
1.一种特异地扩增基因组的重排免疫球蛋白基因的方法，包括：
裂解成熟的B细胞；
用多重置换扩增的方法，通过能够特异地扩增抗体重链和/或轻链的可变区的引物扩增所述B细胞的基因组基因，从而相对特异地从基因组扩增包含重链和/或轻链的可变区的序列；
以所述多重置换扩增所得的反应液为底物，用特异地结合所述抗体重链和/或轻链的可变区的引物进行PCR扩增，以获得所述抗体重链或轻链的可变区的基因序列；
对所得到的PCR产物测序，以确定PCR扩增得到所述抗体重链或轻链的可变区的基因序列；
其中在所述多重置换扩增方法中使用的针对小鼠IgG重链的引物其序列为如在表2中列出的mCH1-1、mCH1-2、mCH1-3、mCH1-4、mCH1-5、mCH1-6、mCH1-7、mCH1-8、mCH1-9、mCH1-10、mCH1-11和mCH1-12序列；
其中在所述多重置换扩增方法中使用的针对小鼠κ轻链的引物其序列为如在表2中列出的mCK1、mCK2、mCK3、mCK4、mCK5、mCK6、mCK7、mCK8、mCK9、mCK10、mCK11和mCK12序列；
其中在所述多重置换扩增方法中使用的针对小鼠λ轻链的引物其序列为如在表2中列出的mCL1、mCL2、mCL3、mCL4、mCL5、mCL6、mCL7、mCL8、mCL9、mCL10、mCL11和mCL12序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述B细胞是经过抗原刺激产生的记忆性B细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在所述多重置换扩增方法中使用的、能够特异地扩增抗体重链和/或轻链的可变区的引物与抗体重链和/或轻链中的已知序列特异地结合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在所述多重置换扩增方法中使用的、能够特异地扩增抗体重链和/或轻链的可变区的引物与抗体重链和/或轻链的恒定区的基因序列特异地结合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在所述多重置换扩增方法中使用的、能够特异地扩增抗体重链和/或轻链的可变区的引物与抗体重链和/或轻链恒定区的内含子基因序列特异地结合。
6.根据权利要求3所述的方法，其中在所述多重置换扩增方法中使用的、能够特异地扩增抗体重链和/或轻链的可变区的引物与抗体基因重排相关序列特异地结合。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在所述多重置换扩增方法中使用的、能够特异地扩增抗体重链和/或轻链的可变区的引物与选自CACAGTG和ACAAAAACC的重组信号序列特异地结合。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述PCR中使用的引物为针对小鼠的IgG重链可变区的引物对。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述针对小鼠的IgG重链可变区的引物对为表4中列出的mVH和mJH序列。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述PCR中使用的引物为针对小鼠的κ轻链的引物对。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述针对小鼠的κ轻链的引物对为表4中列出的靶基因为mVK和mJK的PCR引物序列。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述PCR中使用的引物为针对小鼠的λ轻链的引物对。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述针对小鼠的λ轻链的引物对为表4中列出的靶基因为mVL1_2及mJL和/或mVL3及mJL的PCR引物序列。
14.一种生产抗体的方法，包括：
通过权利要求1-13任一项所述的方法获得免疫球蛋白基因序列，将获得的所述免疫球蛋白基因序列克隆到表达系统中，
在所述表达系统中表达免疫球蛋白基因。
15.根据权利要求14所述的方法，还包括对所述免疫球蛋白进行测序和鉴定的步骤。
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