CN111378650A - 一种用于巢式扩增的组合引物及其应用 - Google Patents
一种用于巢式扩增的组合引物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于巢式扩增的组合引物，所述组合引物包括两轮引物组，每轮引物组分别包括轻链可变区引物和重链可变区引物，各轻重链可变区引物分别包括正向引物组和反向引物组，所述组合引物可实现抗原特异性抗体基因的高效率高通量扩增和和分析。
Description
技术领域
本发明属于抗体发现领域，特别涉及一种用于巢式扩增的组合引物及其应用。
背景技术
单克隆抗体具有靶点性强、成药性强、副作用小等优点。生物药，尤其是抗体类药已成为药物领域最有活力和前景的一个方向。全球获批抗体有超过80余个，销售额已突破千亿美金。抗体药物研发已构成各大跨国药企和国内药企的主要研发管线。
目前一些方法可获得单克隆抗体，比如小鼠杂交瘤技术、人杂交瘤技术、噬菌体文库技术、EBV转化B淋巴细胞技术等。小鼠杂交瘤技术免疫原性高、半衰期短，临床效果有限；而人杂交瘤技术则具有融合效率低、亚克隆易丢失等缺点，噬菌体文库展示技术则在建库过程中易出现轻重链随机配对的情况，并且研发周期长；EBV转化B细胞技术的抗体产量较低。而单B细胞抗体克隆技术可有效解决这些问题，可实现抗原特异性小鼠单克隆抗体的快速克隆和鉴定分析。
抗体可变区等位基因众多，多样性极其复杂。小鼠重链可变区VH是由VDJ 重排产生，小鼠有250—1000个V片段，有12个D片段，4个J片段。轻链可分为κ和λ两个亚型，在鼠中，二者的比例为19:1。小鼠κ链可变区Vκ是由VJ 重排产生，轻链Vk片段约为250个，Jk片段为5个。抗体V(D)J片段重排是抗体多样性产生的主要分子机制。小鼠比人V(D)J等位基因数目更多，这也为抗体引物设计提出更高要求。通过对小鼠germline序列对比，在高同源性位置设计引物并利用兼并碱基，是抗体引物设计以实现小鼠抗体基因最大覆盖的难点，也是是小鼠单B细胞扩增技术的难点之一。
本发明根据IMGT小鼠轻重链可变区基因数据库设计引物，该引物可特异性扩增所有VH和Vk基因序列，所述的引物为组合引物，可用于巢式PCR扩增抗体的重链或轻链可变区。
发明内容
一方面，本发明提供了一种用于巢式扩增的组合引物，所述组合引物包括第一轮引物组1和第二轮引物组2，所述的第一轮引物组1包含重链可变区引物组 1和轻链可变区引物组2；所述的第二轮引物组2包括重链可变区引物组2和轻链可变区引物组2；所述的重链可变区引物组1包含重链可变区正向引物组1和重链可变区反向引物组1；所述的轻链可变区引物组1包含轻链可变区正向引物组1和轻链可变区反向引物组1；所述的重链可变区引物组2包含重链可变区正向引物组2和重链可变区反向引物组2；所述的轻链可变区引物组2包含轻链可变区正向引物组2和轻链可变区反向引物组2。
所述的重链可变区正向引物组1包含编号为LX1、LX2和LX3的引物：
LX1：AGGAACTGCAGGTGTCC；
LX2：CAGCTACAGGTGTCCACTCC
LX3：TGGCAGCARCAGCTACAGG
此外，所述的重链可变区正向引物组1还可包含以下序列引物LX4至LX53 中的任意1～50个，优选5～20个，优选地包含10～15个。
LX4：TCTGCCTGGTGACWTTCCCA
LX5：CAGCTACAGGGCAGGTG
LX6：TGGAGTTTGGACTTAGTTGGG
LX7：AGRTYCAGCTGCARCAGTCT
LX8：GTGCAGCTTCAGGAGTCAG
LX9：GGCAGCTGCCCAAAGTRYCC
LX10：TGTTGTCAGCCCTTCCTGG
LX11：ACACCTTTAAATGGTATCCAGTGT
LX12：CCTGTCAGTAACTRCAGGTGTCC
LX13：GCTTGGCAGCAGCTCTA
LX14：TCTGCATGCTGACATTCCCA
LX15：CCAAGCTGTGTCCTGTC
LX16：TGCCTGGTGACWTTCCCAAGCTGT
LX17：CTGCCTGGTGACATTCCCA
LX18：AGGTCCAACTGCAGCAGCC
LX19：GTGCAGCTTCAGGAGTCAGGAC
LX20：GAGGTGAAGCTTCTCGAGTC
LX21：TTTTAAAAGGKGTCCAGWGT
LX22：TTTTAAAAGGTGTCCAGKGT
LX23：CCTGTCAGTAACTRCAGGTGTCC
LX24：ACACTTTTAMATGGTATCCAGTGT
LX25：CGTTCCTGGTATCCTGTCT
LX26：CCAGGTTACTCTGAAAGAGTC
LX27：TTTTAAAAGGGGTCCAGTGT
LX28：GACCTTGCTATTCCTGATGGCAGC
LX29：GAAGTGAAGCTGGTGGAGTC
LX30：TGTTGGGGCTKAAGTGGG
LX31：ATGKACTTGGGACTGARCTGT
LX32：TGCTCTTTTAAAAGATGTCCAGTGT
LX33：AGCTTCAGGAGTCAGGACC
LX34：CAGTGTGAGGTGAAGCTGGT
LX35：TCCTGTGCTTGGCAGCAGCTC
LX36：CAGGTGCAGCTTGTAGAGAC
LX37：ATGCAGCTGGGTCATCTTCTT
LX38：ATGAAGTTGTGGYTRAACTGG
LX39：TGTTGGGGCTKAAGTGGG
LX40：GGCAGTGGTTACAGGGGTC
LX41：CCAGGTTACTCTGAAAGAGTC
LX42：TGTGGACCTTGCTATTCCTGA
LX43：AGRTYCAGCTGCARCAGTCT
LX44：ATGGAGTGGGAACTGAGCTTA
LX45：TGTTGGGGCTGAAGTGGGTTT
LX46：AGGTCCAACTGCAGCAGCC
LX47：CTTTCCTGGTATCCTGTCT
LX48：CTTTWWMAAGGKRTSCAKTGT
LX49：TGCTCTTTTAAAAGATGTCCAGTGT
LX50：ATGCAGCTGGGTCATCTTCTT
LX51：AAGTGAAGCTGGTGGAGTC。
LX52：TGTTCACAGCCTTTCCTGGT
LX53：GACTGGATTTGGATCACKCTC。
所述的重链可变区反向引物组1包含编号为NX1的引物，
NX1：CAGCTTCCTGCTAATCAGTG
此外，所述的重链可变区反向引物组1还可包含以下序列引物NX2至NX6 中的任意1～5个，优选地包含2～3个。
NX2：GAARTAGCCCTTGACCAGGCATC
NX3：AGAAGGTGTGCACACCGCTGGAC
NX4：AGGGGGCTCTCGCAGGAGACGAGG
NX5：CTTTTCTGGATTTCAGCCTCC
NX6：TGGAGTCACAGACYCAGG。
所述的轻链可变区正向引物组1包含编号为LX54、LX55、LX56和LX57的引物：
LX54：TGATGACCCARACTCCACT
LX55：CTGCTGCTCTGGGTTCCAGG
LX56：TGGAGTCACAGACYCAGG
LX57：TGCTGCTATGGGTATCTG
此外，所述的轻链可变区正向引物组1还可包含以下序列引物LX58至LX113 中的任意1～56个，优选5～20个，优选地包含10～15个。
LX58：TGATGACCCARACTCCACT
LX59：CTTGTGCTCTGGATCCCTGG
LX60：TGGACATGAGGGCYCCTGCTCAGT
LX61：CAGTTCCTGTTTCTGTTARTGCTCTGG
LX62：RGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCT
LX63：GCTTGTGCTCTGGATCCC
LX64：ATGAGACCGTCTATTCAGTT
LX65：CAGCTTCCTGCTAATCAGTG
LX66：CTTTTCTGGATTTCAGCCTCC
LX67：CTGCTGCTCTGGGTTCC
LX68：ATGGAAACTCCAGCTTCATTT
LX69：TGGGTGCTGCTGCTCTGGGT
LX70：TGGAGTTTCAGACCCAGG
LX71：CTGCTMTGGGTATCTGGT
LX72：ATGAGGGTCCTTGCTGAG
LX73：TCTTGTTGCTCTGGTTTCCAGG
LX74：TGGAGTCACAGACYCAGG
LX75：GAGGTTCCAGGTTCAGGT
LX76：GCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGC
LX77：TGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT
LX78：TTTTTAGGTGCCAGATGT
LX79：CTAGCTCYTCTCCTCAGYCTTCTTCTCCTC
LX80：TTAGGTCCTTGGTAGGCTGT
LX81：CTSTGGTTGTCTGGTGTTGAYGGA
LX82：GTTGCTGCTGCTGTGGCTTACA
LX83：TCAACTTCTGCTCTTCCTGCTGTTC
LX84：CTCAGCTCCTGTTGCTGTGGC
LX85：CTGCTGCTGTGGCTTACAG
LX86：CWTCTTGTTGCTCTGGTTTC
LX87:AGGGCCCYTGCTCAGTTT
LX88:TCAACTTCTGCTCTTCCTGCTG
LX89:CAGCTTCCTGCTAATCAGTG
LX90:CTCAGATCCTTGGACTTHTG
LX91:CCATGACCATGYTCTCACT
LX92:CTGGGGCTSCTKCTGYTCTG
LX93:CTCTTCTTCTTCTTTGTTCTTCATTGCT
LX94:ATGACCATGYTCTCACTAGC
LX95:GATGTCCTCTGCTCAGTTC
LX96:CCTTCTCAACTTCTGCTCT
LX97:CTGTGGACCACGGTCTCAGCTGTC
LX98:GTATCTGGTACCTGTGG
LX99:CCTCATATTTTTGCTGCTATGGG
LX100:GCTGTTTTGTATACCTGGG
LX101:ATGAGACCGTCTATTCAGTT
LX102:CCTGCTGAGTTCCTTGGG
LX103:CTGCTGCTGTGGCTTACA
LX104:STGYTGHTGYTCTGG
LX105:GCCTGGAYTTCACTTATACTC
LX106:TGGCCTGGACTCCTCTCTT
LX107:GGGTATCTGGTACCTGTGG
LX108:STGYTGHTGYTCTGG
LX109:TGCTTTTCTGGATTTCAGCCTCCAG
LX110:TGCTCTGGTTATATGGTGCTGATGGG
LX111：ACTCAGCCAAGCTCTGTG
LX112：ACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTC
LX113：GTGTMTGGTGCTBRTGGG
所述的轻链可变区反向引物组1包含编号NX7的引物：
NX7：GCACCTCCAGATGTTAACTG
此外，所述的轻链可变区反向引物组1还可包含以下序列引物NX8至NX11 中的任意1～4个，优选地包含2～3个。
NX8：GTACCATYTGCCTTCCAGKCCACT
NX9：ACTGAGGCACCTCCAGATGTT
NX10：CTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG
NX11：CTCYTCAGRGGAAGGTGGRAACA
所述的重链可变区正向引物组2包含LX114、LX115、LX116和LX117的引物：
LX114GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG
LX115GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGG
LX116GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTGCAGCTGAAGSAGTCAGG
LX117GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGG
此外，所述的重链可变区正向引物组2还可包含以下序列引物LX118至 LX141中的任意1～24个，优选地包含5～15个。
LX118：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTGCAACTGAAGCAGTC
LX119：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGTTCAGCTRCARCAGTCTGG
LX120：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAAGTGCAGCTGTTGGAGAC
LX121：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGACGTGAAGCTCGTGGAGTC
LX122: GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAWGTGCAGCTGGTGGAGTC
LX123：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTGCAGATGAAGCAGTC
LX124：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAAGTGATGCTGGTGGAGTC
LX125：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGSAGGTYCAGCTGCARCAGTC
LX126：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTGCAGCTGAAGSAGTC
LX127：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGARGTGAAGCTGGTGGARTC
LX128：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGTGMAGCTTSTYGAGTCTGG
LX129：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTGCAGAATAAGTCAGG
LX130：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTCCAACTGCAGCAGCC
LX131：GACAGCAGGAGTGCACTCCGARGTGMAGCTGGTGGARTCTG
LX132：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAGGTCCAGCTTCAGCAGTC
LX133：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAGGTGAAGCTGATGGAGTC
LX134：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCWGG
LX135：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAAGTGCAGATGAAGGAGTC
LX136：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGG
LX137：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGATCCAGTTGGYGCAGTC
LX138：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAGGTGCAGCTTGTTGAGTC
LX139：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGG
LX140：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTCCAACTCCAGCAGCC
LX141：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTKKTRGAGACYGG
所述的重链可变区反向引物组2包含编号为NX12的引物：
NX12:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGG
此外，所述的重链可变区反向引物组2还可包含以下序列引物NX13至NX18 以及NX25中的任意1～7个，优选地包含2～4个。
NX13:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTCAGCTTGTTGATGCCGTGG
NX14:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGACGTGATCTCGCCGTGG
NX15:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGG
NX16:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAG
NX17：GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGGAGCAGTGAGCGTGTCGC
NX18：GGGGCCCTTGGTGGAAGCTCCGCAGGTTGACGGAGCGGTG
NX25：GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGGAGACGGTGACTGAGG
所述的轻链可变区正向引物组2包含编号为LX142、LX143、LX144和LX145 的引物：
LX142GACAGCAGGAGTGCACTCCRRTRTTGTGATGACCCARAC
LX143GACAGCAGGAGTGCACTCCGATATTGTGATGACBCAGGC
LX144GACAGCAGGAGTGCACTCCSAAATTGTKCTCACCCAGTC
LX145GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATTGTGMTGACCCAATC
此外，所述的轻链可变区正向引物组2还可包含以下序列引物LX146至LX169中的任意1～24个，优选地包含5～15个。
LX146：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTTGTGGTGACTCAAAC
LX147：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAAWTGTGCTCACCCAGTC
LX148：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAmATTGTkmTsACCCAGTC
LX149：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATTGTGMTGACHCAGTC
LX150：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCCAGATGACHCAGTC
LX151：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCCTGATGACCCAATC
LX152：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATATCCAGATGACACAGAC
LX153：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAACAACTGTGACCCAGTC
LX154：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATATTGTGATGACSCAGGC
LX155：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTCCAGATGATTCAGTC
LX156：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAAATTGTTCTCACCCAGTC
LX157：GACAGCAGGAGTGCACTCCRRTRTTGTGATGACCCARAC
LX158：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATTGTGATGACMCAGTC
LX159：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCAAGATGACCCAGTC
LX160：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTCCAGATAACCCAG
LX161:GACAGCAGGAGTGCACTCCACACAGGCTGCACTCTCCAA
LX162:GACAGCAGGAGTGCACTCCACTGGAGAAACAACACAGGC
LX163:GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCCwGATGACyCArwCTCC
LX164:GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTCCAGATRAMCCAGTC
LX165:GACAGCAGGAGTGCACTCCAATATCCAGGTGATCCAG
LX166:GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCCAGATGACHCAGTC
LX167:GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAACAACTGTGACCCAGTC
LX168:GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCTTGCTGACTCAGTC
LX169:GACAGCAGGAGTGCACTCCACTGGAGAAACAACACAGGCTC
所述的轻链可变区反向引物组2包含编号为NX19和NX20的引物：
NX19：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC
NX20：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTTATTTCCAGTCTGGTCCC
此外，所述的轻链可变区反向引物组2还可包含以下序列引物NX21至NX24 中的任意1～4个，优选地包含2～3个。
NX21：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC
NX22：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC
NX23：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTKATTTCCARCTTKGTSCC
NX24GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC
其中，序列出现兼并碱基意义如下：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T， S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。
另一方面，本发明还涉及使用所述的组合引物进行抗体轻重链可变区扩增的方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)进行抗原特异性单B细胞的分选；
(2)将抗原特异性单B细胞的基因进行反转录；
(3)使用本发明所述的组合引物进行巢式PCR扩增。
所述的步骤(3)包括以下步骤：以cDNA为模板分别进行第一轮巢式PCR 抗体重链可变区和轻链可变区基因的扩增，所述第一轮重链可变区的扩增使用重链可变区引物组1；所述第一轮轻链可变区的扩增使用轻链可变区引物组1；以第一轮扩增的重链、轻链PCR反应产物为模板分别进行第二轮巢式PCR抗体重链可变区基因的扩增，所述第二轮重链可变区的扩增使用重链可变区引物组2；所述第二轮轻链可变区的扩增使用轻链可变区引物组2。
优选地，在步骤(3)后，还包括纯化和/或回收扩增片段的步骤，所述的纯化和/或回收优选为磁珠法。
关于细胞分选
所述的细胞分选为流式分选。所述的流式分选包括用特异性抗原免疫动物，取动物脾脏研磨成单细胞悬液，取部分细胞用荧光抗体染色，经流式分选至预先装有细胞裂解液的高通量反应容器中。
关于高通量反应容器
所述的高通量反应容器为微板形式的实验器具，包括但不限于12孔板，24 孔板，48孔板，96孔板等。
关于PCT扩增
所述的步骤(2)的PCT扩增优选为巢式扩增。
所述的重链和轻链可变区的巢式扩增各进行两轮扩增。
所述的两轮扩增的操作如下：以cDNA为模板分别进行第一轮巢式PCR抗体重链可变区和轻链可变区基因的扩增；以第一轮扩增的重链、轻链PCR反应产物为模板分别进行第二轮巢式PCR抗体重链可变区基因的扩增。
所述的PCT扩增条件为：反应体系中加入扩增模板，AccuPrimer PCR buffer,AccuPrimer高保真酶可变区引物，预变性95℃ x 5分钟，然后进行35个PCR循环，每个循环为：95℃ x 30秒，48～62℃ x 60秒，72℃ x 90秒，最后用72℃延伸 7分钟。
所述的扩增模板在第一轮扩增时为特异性单B细胞的逆转录反应产物；在第二轮扩增时，所述的扩增模板分别为第一轮扩增得到的重链或轻链可变区扩增 PCT反应产物。
优选地，所述步骤(2)后还包括纯化和/或回收扩增片段的步骤，所述的纯化和/或回收优选为磁珠法。
附图说明
图1-1是实施例2小鼠抗原特异性IgG+B细胞分选图(对照染色组)；
图1-2是实施例2小鼠抗原特异性IgG+B细胞分选图(CREG抗原染色组)；
图2是实施例2抗CREG抗体重链和轻链可变区扩增基因片段电泳图；
图3-1是实施例2抗体重链可变区扩增基因磁珠纯化后测序结果多样性分析；
图3-2是实施例2抗体轻链可变区扩增基因磁珠纯化后测序结果多样性分析；
具体实施方式
实施例1
(1)单细胞扩增引物设计
根据IMGT上已提交的小鼠抗体germline基因序列中，
1)针对重链可变区239个信号肽和5个IgG亚型(IGHG1*01、IGHG2A*01、IGHG2B*01、IGHG2C*01和IGHG3*01)的CH1序列分别设计重链一轮PCR 扩增的正向和反向引物。
2)针对重链可变区239个VH片段和5个JH片段分别设计重链二轮PCR 扩增引物正向和反向引物。重链二轮扩增引物加入合适长度的同源重组臂序列(15bp-20bp)，便于重链可变区基因重组入重链表达载体。
3)针对轻链可变区128个信号肽和k链恒定区分别设计轻链一轮PCR扩增的正向和反向引物。
4)针对轻链可变区128个Vk和5个Jk片段分别设计轻链二轮PCR扩增的正向和反向引物。轻链二轮扩增引物加入合适长度的同源重组臂序列 (15bp-20bp)，便于轻链可变区基因重组入轻链人鼠嵌合表达载体。
重链和轻链正向引物和反向引物的序列如下：
重链可变区正向引物(第一轮)
LX1：AGGAACTGCAGGTGTCC；
LX2：CAGCTACAGGTGTCCACTCC
LX3：TGGCAGCARCAGCTACAGG
LX4：TCTGCCTGGTGACWTTCCCA
LX5：CAGCTACAGGGCAGGTG
LX6：TGGAGTTTGGACTTAGTTGGG
LX7：AGRTYCAGCTGCARCAGTCT
LX8：GTGCAGCTTCAGGAGTCAG
LX9：GGCAGCTGCCCAAAGTRYCC
LX10：TGTTGTCAGCCCTTCCTGG
LX11：ACACCTTTAAATGGTATCCAGTGT
LX12：CCTGTCAGTAACTRCAGGTGTCC
LX13：GCTTGGCAGCAGCTCTA
LX14：TCTGCATGCTGACATTCCCA
LX15：CCAAGCTGTGTCCTGTC
LX16：TGCCTGGTGACWTTCCCAAGCTGT
LX17：CTGCCTGGTGACATTCCCA
LX18：AGGTCCAACTGCAGCAGCC
LX19：GTGCAGCTTCAGGAGTCAGGAC
LX20：GAGGTGAAGCTTCTCGAGTC
LX21：TTTTAAAAGGKGTCCAGWGT
LX22：TTTTAAAAGGTGTCCAGKGT
LX23：CCTGTCAGTAACTRCAGGTGTCC
LX24：ACACTTTTAMATGGTATCCAGTGT
LX25：CGTTCCTGGTATCCTGTCT
LX26：CCAGGTTACTCTGAAAGAGTC
LX27：TTTTAAAAGGGGTCCAGTGT
LX28：GACCTTGCTATTCCTGATGGCAGC
LX29：GAAGTGAAGCTGGTGGAGTC
LX30：TGTTGGGGCTKAAGTGGG
LX31：ATGKACTTGGGACTGARCTGT
LX32：TGCTCTTTTAAAAGATGTCCAGTGT
LX33：AGCTTCAGGAGTCAGGACC
LX34：CAGTGTGAGGTGAAGCTGGT
LX35：TCCTGTGCTTGGCAGCAGCTC
LX36：CAGGTGCAGCTTGTAGAGAC
LX37：ATGCAGCTGGGTCATCTTCTT
LX38：ATGAAGTTGTGGYTRAACTGG
LX39：TGTTGGGGCTKAAGTGGG
LX40：GGCAGTGGTTACAGGGGTC
LX41：CCAGGTTACTCTGAAAGAGTC
LX42：TGTGGACCTTGCTATTCCTGA
LX43：AGRTYCAGCTGCARCAGTCT
LX44：ATGGAGTGGGAACTGAGCTTA
LX45：TGTTGGGGCTGAAGTGGGTTT
LX46：AGGTCCAACTGCAGCAGCC
LX47：CTTTCCTGGTATCCTGTCT
LX48：CTTTWWMAAGGKRTSCAKTGT
LX49：TGCTCTTTTAAAAGATGTCCAGTGT
LX50：ATGCAGCTGGGTCATCTTCTT
LX51：AAGTGAAGCTGGTGGAGTC
LX52：TGTTCACAGCCTTTCCTGGT
LX53：GACTGGATTTGGATCACKCTC
重链可变区反向引物(第一轮)：
NX1：CAGCTTCCTGCTAATCAGTG
NX2：GAARTAGCCCTTGACCAGGCATC
NX3：AGAAGGTGTGCACACCGCTGGAC
NX4：AGGGGGCTCTCGCAGGAGACGAGG
NX5：CTTTTCTGGATTTCAGCCTCC
NX6：TGGAGTCACAGACYCAGG
轻链可变区正向引物(第一轮)：
LX54：TGATGACCCARACTCCACT
LX55：CTGCTGCTCTGGGTTCCAGG
LX56：TGGAGTCACAGACYCAGG
LX57：TGCTGCTATGGGTATCTG
LX58：TGATGACCCARACTCCACT
LX59：CTTGTGCTCTGGATCCCTGG
LX60：TGGACATGAGGGCYCCTGCTCAGT
LX61：CAGTTCCTGTTTCTGTTARTGCTCTGG
LX62：RGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCT
LX63：GCTTGTGCTCTGGATCCC
LX64：ATGAGACCGTCTATTCAGTT
LX65：CAGCTTCCTGCTAATCAGTG
LX66：CTTTTCTGGATTTCAGCCTCC
LX67：CTGCTGCTCTGGGTTCC
LX68：ATGGAAACTCCAGCTTCATTT
LX69：TGGGTGCTGCTGCTCTGGGT
LX70：TGGAGTTTCAGACCCAGG
LX71：CTGCTMTGGGTATCTGGT
LX72：ATGAGGGTCCTTGCTGAG
LX73：TCTTGTTGCTCTGGTTTCCAGG
LX74：TGGAGTCACAGACYCAGG
LX75：GAGGTTCCAGGTTCAGGT
LX76：GCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGC
LX77：TGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT
LX78：TTTTTAGGTGCCAGATGT
LX79：CTAGCTCYTCTCCTCAGYCTTCTTCTCCTC
LX80：TTAGGTCCTTGGTAGGCTGT
LX81：CTSTGGTTGTCTGGTGTTGAYGGA
LX82：GTTGCTGCTGCTGTGGCTTACA
LX83：TCAACTTCTGCTCTTCCTGCTGTTC
LX84：CTCAGCTCCTGTTGCTGTGGC
LX85：CTGCTGCTGTGGCTTACAG
LX86：CWTCTTGTTGCTCTGGTTTC
LX87:AGGGCCCYTGCTCAGTTT
LX88:TCAACTTCTGCTCTTCCTGCTG
LX89:CAGCTTCCTGCTAATCAGTG
LX90:CTCAGATCCTTGGACTTHTG
LX91:CCATGACCATGYTCTCACT
LX92:CTGGGGCTSCTKCTGYTCTG
LX93:CTCTTCTTCTTCTTTGTTCTTCATTGCT
LX94:ATGACCATGYTCTCACTAGC
LX95:GATGTCCTCTGCTCAGTTC
LX96:CCTTCTCAACTTCTGCTCT
LX97:CTGTGGACCACGGTCTCAGCTGTC
LX98:GTATCTGGTACCTGTGG
LX99:CCTCATATTTTTGCTGCTATGGG
LX100:GCTGTTTTGTATACCTGGG
LX101:ATGAGACCGTCTATTCAGTT
LX102:CCTGCTGAGTTCCTTGGG
LX103:CTGCTGCTGTGGCTTACA
LX104:STGYTGHTGYTCTGG
LX105:GCCTGGAYTTCACTTATACTC
LX106:TGGCCTGGACTCCTCTCTT
LX107:GGGTATCTGGTACCTGTGG
LX108:STGYTGHTGYTCTGG
LX109:TGCTTTTCTGGATTTCAGCCTCCAG
LX110:TGCTCTGGTTATATGGTGCTGATGGG
LX111：ACTCAGCCAAGCTCTGTG
LX112：ACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTC
LX113：GTGTMTGGTGCTBRTGGG
轻链可变区反向引物：
NX7：GCACCTCCAGATGTTAACTG(第一轮)
NX8：GTACCATYTGCCTTCCAGKCCACT
NX9：ACTGAGGCACCTCCAGATGTT
NX10：CTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG
NX11：CTCYTCAGRGGAAGGTGGRAACA
重链可变区正向引物(第二轮)
LX114GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG
LX115GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGG
LX116GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTGCAGCTGAAGSAGTCAGG
LX117GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGG
LX118：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTGCAACTGAAGCAGTC
LX119：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGTTCAGCTRCARCAGTCTGG
LX120：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAAGTGCAGCTGTTGGAGAC
LX121：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGACGTGAAGCTCGTGGAGTC
LX122: GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAWGTGCAGCTGGTGGAGTC
LX123：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTGCAGATGAAGCAGTC
LX124：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAAGTGATGCTGGTGGAGTC
LX125：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGSAGGTYCAGCTGCARCAGTC
LX126：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTGCAGCTGAAGSAGTC
LX127：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGARGTGAAGCTGGTGGARTC
LX128：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGTGMAGCTTSTYGAGTCTGG
LX129：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTGCAGAATAAGTCAGG
LX130：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTCCAACTGCAGCAGCC
LX131：GACAGCAGGAGTGCACTCCGARGTGMAGCTGGTGGARTCTG
LX132：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAGGTCCAGCTTCAGCAGTC
LX133：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAGGTGAAGCTGATGGAGTC
LX134：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCWGG
LX135：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAAGTGCAGATGAAGGAGTC
LX136：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGG
LX137：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGATCCAGTTGGYGCAGTC
LX138：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAGGTGCAGCTTGTTGAGTC
LX139：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGG
LX140：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTCCAACTCCAGCAGCC
LX141：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTKKTRGAGACYGG
重链可变区反向引物(第二轮)
NX12:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGG
NX13:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTCAGCTTGTTGATGCCGTGG
NX14:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGACGTGATCTCGCCGTGG
NX15:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGG
NX16:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAG
NX17：GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGGAGCAGTGAGCGTGTCGC
NX18：GGGGCCCTTGGTGGAAGCTCCGCAGGTTGACGGAGCGGTG
NX25：GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGGAGACGGTGACTGAGG
轻链可变区正向引物(第二轮)
LX142GACAGCAGGAGTGCACTCCRRTRTTGTGATGACCCARAC
LX143 GACAGCAGGAGTGCACTCCGATATTGTGATGACBCAGGC
LX144：GACAGCAGGAGTGCACTCCSAAATTGTKCTCACCCAGTC
LX145：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATTGTGMTGACCCAATC
LX146：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTTGTGGTGACTCAAAC
LX147：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAAWTGTGCTCACCCAGTC
LX148：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAmATTGTkmTsACCCAGTC
LX149：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATTGTGMTGACHCAGTC
LX150：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCCAGATGACHCAGTC
LX151：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCCTGATGACCCAATC
LX152：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATATCCAGATGACACAGAC
LX153：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAACAACTGTGACCCAGTC
LX154：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATATTGTGATGACSCAGGC
LX155：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTCCAGATGATTCAGTC
LX156：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAAATTGTTCTCACCCAGTC
LX157：GACAGCAGGAGTGCACTCCRRTRTTGTGATGACCCARAC
LX158：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATTGTGATGACMCAGTC
LX159：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCAAGATGACCCAGTC
LX160：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTCCAGATAACCCAG
LX161:GACAGCAGGAGTGCACTCCACACAGGCTGCACTCTCCAA
LX162:GACAGCAGGAGTGCACTCCACTGGAGAAACAACACAGGC
LX163:GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCCwGATGACyCArwCTCC
LX164:GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTCCAGATRAMCCAGTC
LX165:GACAGCAGGAGTGCACTCCAATATCCAGGTGATCCAG
LX166:GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCCAGATGACHCAGTC
LX167:GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAACAACTGTGACCCAGTC
LX168:GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCTTGCTGACTCAGTC
LX169:GACAGCAGGAGTGCACTCCACTGGAGAAACAACACAGGCTC
轻链可变区反向引物(第二轮)
NX19：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC
NX20：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTTATTTCCAGTCTGGTCCC
NX21：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC
NX22：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC
NX23：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTKATTTCCARCTTKGTSCC
NX24GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC。
序列出现兼并碱基意义如下：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G， W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。
经验证，当重链可变区正向引物组1包含编号为LX1、LX2和LX3引物，且重链可变区反向引物组1包含NX1引物；轻链可变区正向引物组1包含编号为LX54、LX55、LX56和LX57的引物，且轻链可变区反向引物组1包含编号 NX7的引物时，可较好地实现第一轮的抗体重、轻链可变区的PCR扩增。
当重链可变区正向引物组2包含LX114、LX115、LX116和LX117的引物，且重链可变区反向引物组2包含编号为NX12的引物；当轻链可变区正向引物组 2包含编号为LX142、LX143、LX144和LX145的引物，且轻链可变区反向引物组2包含编号为NX19和NX20的引物时，较好地实现第二轮的抗体重、轻链可变区的PCR扩增
实施例2
(1)抗原特异性单B细胞分选
用CREG蛋白小鼠终疫后3天，脱颈椎方法处死，分离小鼠脾脏，研磨成单细胞悬液。取部分细胞进行荧光抗体染色，经流式分选，把单个抗原特异性B 细胞分选到预先装有细胞裂解液的96孔板。抗原特异性B细胞的分选结果如图 1-1和图1-2所示。
(2)抗原特异性单B细胞基因反转录
以96孔板中的单个抗原特异性B细胞为模板，将单细胞的mRNA反转录成 cDNA。逆转录的条件为：在96孔PCR板14ul反应体系中加2.8uM逆转录缓冲液，加入随机引物hexamerPrimers终浓度为0.3uM，0.4ul的10mM dNTPs及50U Superscript III反转录酶，65℃在PCR仪上反应1小时，反转录成cDNA。
(3)巢式PCR扩增抗体重链可变区(第一轮)
50ul体系中加入5ul的步骤(2)逆转录反应产物，5ul AccuPrimer PCR buffer, 5个单位的AccuPrimer高保真酶及0.2uM重链可变区引物组1，预变性95℃ x 5 分钟，然后进行35个PCR循环，每个循环为：95℃ x 30秒，48～62℃ x 60秒， 72℃ x 90秒，最后用72℃延伸7分钟。
所述重链可变区引物组1由正向引物和反向引物组成。
所述的正向引物包含编号为LX1、LX2和LX3引物；
所述的反向引物包含编号为NX1引物。
(4)巢式PCR扩增抗体轻链可变区(第一轮)
50ul体系中加入5ul的步骤(2)逆转录反应产物，5ul AccuPrimer PCR buffer, 5个单位的AccuPrimer高保真酶及0.2uM轻链可变区引物组1，预变性95℃ x 5 分钟，然后进行35个PCR循环，每个循环为：95℃ x 30秒，48～62℃ x 60秒， 72℃ x 90秒，最后用72℃延伸7分钟。
所述轻链可变区引物组1由正向引物和反向引物组成。
所述的正向引物包含编号为LX54、LX55、LX56和LX57的引物；
所述的反向引物包含编号NX7的引物。
(5)巢式PCR扩增抗体重链可变区(第二轮)
50ul体系中加入5ul的步骤(3)得到的第一轮重链扩增PCR反应产物，5ulAccuPrimer PCR buffer,5个单位的AccuPrimer高保真酶及0.2uM重链可变区引物组2。预变性95℃ x 5分钟，然后进行35个PCR循环，每个循环为：95℃ x 30 秒，48～62℃ x 60秒，72℃ x 90秒，最后用72℃延伸7分钟。
所述重链可变区引物组2由正向引物和反向引物组成。
所述的正向引物包含LX114、LX115、LX116和LX117的引物；
所述的反向引物包含编号为NX12的引物。
(6)巢式PCR扩增抗体轻链可变区(第二轮)
50ul体系中加入5ul的步骤(4)得到的第一轮轻链扩增PCR反应产物，5ulAccuPrimer PCR buffer,5个单位的AccuPrimer高保真酶及0.2uM轻链可变区引物组2。预变性95℃ x 5分钟，然后进行35个PCR循环，每个循环为：95℃ x 30 秒，48～62℃ x 60秒，72℃ x 90秒，最后用72℃延伸7分钟。
所述轻链可变区引物组2由正向引物和反向引物组成。
所述的正向引物包含编号为LX142、LX143、LX144和LX145的引物；
所述的反向引物包含编号为NX19和NX20的引物。
(7)磁珠法回收高通量抗体可变区PCR扩增片段
将电泳结果阳性克隆(参见图2)分重链和轻链分别加到新的96孔板中，向其中加入总体积80％的磁珠直接用枪混匀，室温孵育5min；将96孔板置于磁力架上至磁珠完全吸附在管壁，移液枪将废液移除；向每孔加入200ul 80％的乙醇，放置30s；将96孔板置于磁力架上，至磁珠完全吸附在管壁，移除废液；室温放置10min以蒸发全部酒精；向各孔板加入20ul的无菌水，移液枪混匀后放置 5分钟；将96孔板置于磁力架上至磁珠完全吸附在管壁，上清即所需纯化的片段。
对磁珠纯化回收的重链和轻链可变区片段分别进行测序分析，显示抗体片段有较好序列多样性，排除了单细胞扩增污染。此外序列还显示进化聚集性，与免疫后B细胞发育分化成熟及抗体亲和力成熟模式一致。如图3-1(重链可变区) 和图3-2(轻链可变区)所示。
由此可见，使用了本发明的组合引物，可实现对小鼠抗体可变区的高通量 PCR的扩增。
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围。
Claims (7)
1.一种用于巢式扩增的组合引物，所述组合引物包括第一轮引物组1和第二轮引物组2，所述的第一轮引物组1包含重链可变区引物组1和轻链可变区引物组2；所述的第二轮引物组2包括重链可变区引物组2和轻链可变区引物组2；所述的重链可变区引物组1包含重链可变区正向引物组1和重链可变区反向引物组1；所述的轻链可变区引物组1包含轻链可变区正向引物组1和轻链可变区反向引物组1；所述的重链可变区引物组2包含重链可变区正向引物组2和重链可变区反向引物组2；所述的轻链可变区引物组2包含轻链可变区正向引物组2和轻链可变区反向引物组2；
所述的重链可变区正向引物组1包含编号为LX1、LX2和LX3引物：
LX1：AGGAACTGCAGGTGTCC；
LX2：CAGCTACAGGTGTCCACTCC
LX3：TGGCAGCARCAGCTACAGG；
所述的重链可变区反向引物组1包含编号为NX1的引物，
NX1：CAGCTTCCTGCTAATCAGTG；
所述的轻链可变区正向引物组1包含编号为LX54、LX55、LX56和LX57的引物：
LX54：TGATGACCCARACTCCACT
LX55：CTGCTGCTCTGGGTTCCAGG
LX56：TGGAGTCACAGACYCAGG
LX57：TGCTGCTATGGGTATCTG
所述的轻链可变区反向引物组1包含编号为NX7的引物：
NX7：GCACCTCCAGATGTTAACTG；
所述的重链可变区正向引物组2包含LX114、LX115、LX116和LX117的引物：
LX114：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG
LX115：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGG
LX116：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTGCAGCTGAAGSAGTCAGG
LX117：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGG；
所述的重链可变区反向引物组2包含编号为NX12的引物：
NX12:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGG；
所述的轻链可变区正向引物组2包含编号为LX142、LX143、LX144和LX145的引物：
LX142：GACAGCAGGAGTGCACTCCRRTRTTGTGATGACCCARAC
LX143：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATATTGTGATGACBCAGGC
LX144：GACAGCAGGAGTGCACTCCSAAATTGTKCTCACCCAGTC
LX145：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATTGTGMTGACCCAATC；
所述的轻链可变区反向引物组2包含编号为NX19和NX20的引物：
NX19：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC
NX20：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTTATTTCCAGTCTGGTCCC。
2.根据权利要求1所述的组合引物，其特征在于：所述的重链可变区正向引物组1还可包含以下序列引物LX4至LX53中的任意1～50个，优选5～20个，优选地包含10～15个：
LX4：TCTGCCTGGTGACWTTCCCA
LX5：CAGCTACAGGGCAGGTG
LX6：TGGAGTTTGGACTTAGTTGGG
LX7：AGRTYCAGCTGCARCAGTCT
LX8：GTGCAGCTTCAGGAGTCAG
LX9：GGCAGCTGCCCAAAGTRYCC
LX10：TGTTGTCAGCCCTTCCTGG
LX11：ACACCTTTAAATGGTATCCAGTGT
LX12：CCTGTCAGTAACTRCAGGTGTCC
LX13：GCTTGGCAGCAGCTCTA
LX14：TCTGCATGCTGACATTCCCA
LX15：CCAAGCTGTGTCCTGTC
LX16：TGCCTGGTGACWTTCCCAAGCTGT
LX17：CTGCCTGGTGACATTCCCA
LX18：AGGTCCAACTGCAGCAGCC
LX19：GTGCAGCTTCAGGAGTCAGGAC
LX20：GAGGTGAAGCTTCTCGAGTC
LX21：TTTTAAAAGGKGTCCAGWGT
LX22：TTTTAAAAGGTGTCCAGKGT
LX23：CCTGTCAGTAACTRCAGGTGTCC
LX24：ACACTTTTAMATGGTATCCAGTGT
LX25：CGTTCCTGGTATCCTGTCT
LX26：CCAGGTTACTCTGAAAGAGTC
LX27：TTTTAAAAGGGGTCCAGTGT
LX28：GACCTTGCTATTCCTGATGGCAGC
LX29：GAAGTGAAGCTGGTGGAGTC
LX30：TGTTGGGGCTKAAGTGGG
LX31：ATGKACTTGGGACTGARCTGT
LX32：TGCTCTTTTAAAAGATGTCCAGTGT
LX33：AGCTTCAGGAGTCAGGACC
LX34：CAGTGTGAGGTGAAGCTGGT
LX35：TCCTGTGCTTGGCAGCAGCTC
LX36：CAGGTGCAGCTTGTAGAGAC
LX37：ATGCAGCTGGGTCATCTTCTT
LX38：ATGAAGTTGTGGYTRAACTGG
LX39：TGTTGGGGCTKAAGTGGG
LX40：GGCAGTGGTTACAGGGGTC
LX41：CCAGGTTACTCTGAAAGAGTC
LX42：TGTGGACCTTGCTATTCCTGA
LX43：AGRTYCAGCTGCARCAGTCT
LX44：ATGGAGTGGGAACTGAGCTTA
LX45：TGTTGGGGCTGAAGTGGGTTT
LX46：AGGTCCAACTGCAGCAGCC
LX47：CTTTCCTGGTATCCTGTCT
LX48：CTTTWWMAAGGKRTSCAKTGT
LX49：TGCTCTTTTAAAAGATGTCCAGTGT
LX50：ATGCAGCTGGGTCATCTTCTT
LX51：AAGTGAAGCTGGTGGAGTC。
LX52：TGTTCACAGCCTTTCCTGGT
LX53：GACTGGATTTGGATCACKCTC；
所述的重链可变区反向引物组1还可包含以下序列引物NX2至NX6中的任意1～5个，优选地包含2～3个：
NX2：GAARTAGCCCTTGACCAGGCATC
NX3：AGAAGGTGTGCACACCGCTGGAC
NX4：AGGGGGCTCTCGCAGGAGACGAGG
NX5：CTTTTCTGGATTTCAGCCTCC
NX6：TGGAGTCACAGACYCAGG；
其中，序列出现兼并碱基意义如下：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。
3.根据权利要求1-2任一项所述的组合引物，所述的轻链可变区正向引物组1还可包含以下序列引物LX58至LX113中的任意1～56个，优选5～20个，优选地包含10～15个:
LX58：TGATGACCCARACTCCACT
LX59：CTTGTGCTCTGGATCCCTGG
LX60：TGGACATGAGGGCYCCTGCTCAGT
LX61：CAGTTCCTGTTTCTGTTARTGCTCTGG
LX62：RGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCT
LX63：GCTTGTGCTCTGGATCCC
LX64：ATGAGACCGTCTATTCAGTT
LX65：CAGCTTCCTGCTAATCAGTG
LX66：CTTTTCTGGATTTCAGCCTCC
LX67：CTGCTGCTCTGGGTTCC
LX68：ATGGAAACTCCAGCTTCATTT
LX69：TGGGTGCTGCTGCTCTGGGT
LX70：TGGAGTTTCAGACCCAGG
LX71：CTGCTMTGGGTATCTGGT
LX72：ATGAGGGTCCTTGCTGAG
LX73：TCTTGTTGCTCTGGTTTCCAGG
LX74：TGGAGTCACAGACYCAGG
LX75：GAGGTTCCAGGTTCAGGT
LX76：GCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGC
LX77：TGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT
LX78：TTTTTAGGTGCCAGATGT
LX79：CTAGCTCYTCTCCTCAGYCTTCTTCTCCTC
LX80：TTAGGTCCTTGGTAGGCTGT
LX81：CTSTGGTTGTCTGGTGTTGAYGGA
LX82：GTTGCTGCTGCTGTGGCTTACA
LX83：TCAACTTCTGCTCTTCCTGCTGTTC
LX84：CTCAGCTCCTGTTGCTGTGGC
LX85：CTGCTGCTGTGGCTTACAG
LX86：CWTCTTGTTGCTCTGGTTTC
LX87:AGGGCCCYTGCTCAGTTT
LX88:TCAACTTCTGCTCTTCCTGCTG
LX89:CAGCTTCCTGCTAATCAGTG
LX90:CTCAGATCCTTGGACTTHTG
LX91:CCATGACCATGYTCTCACT
LX92:CTGGGGCTSCTKCTGYTCTG
LX93:CTCTTCTTCTTCTTTGTTCTTCATTGCT
LX94:ATGACCATGYTCTCACTAGC
LX95:GATGTCCTCTGCTCAGTTC
LX96:CCTTCTCAACTTCTGCTCT
LX97:CTGTGGACCACGGTCTCAGCTGTC
LX98:GTATCTGGTACCTGTGG
LX99:CCTCATATTTTTGCTGCTATGGG
LX100:GCTGTTTTGTATACCTGGG
LX101:ATGAGACCGTCTATTCAGTT
LX102:CTGCTGAGTTCCTTGGG
LX103:CTGCTGCTGTGGCTTACA
LX104:STGYTGHTGYTCTGG
LX105:GCCTGGAYTTCACTTATACTC
LX106:TGGCCTGGACTCCTCTCTT
LX107:GGGTATCTGGTACCTGTGG
LX108:STGYTGHTGYTCTGG
LX109:TGCTTTTCTGGATTTCAGCCTCCAG
LX110:TGCTCTGGTTATATGGTGCTGATGGG
LX111：ACTCAGCCAAGCTCTGTG
LX112：ACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTC
LX113：GTGTMTGGTGCTBRTGGG；
所述的轻链可变区反向引物组1还可包含以下序列引物NX8至NX11中的任意1～4个，优选地包含2～3个：
NX8：GTACCATYTGCCTTCCAGKCCACT
NX9：ACTGAGGCACCTCCAGATGTT
NX10：CTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG
NX11：CTCYTCAGRGGAAGGTGGRAACA；
其中，序列出现兼并碱基意义如下：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合引物，其特征在于：所述的重链可变区正向引物组2还可包含以下序列引物LX118至LX141中的任意1～24个，优选地包含5～15个：
LX118：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTGCAACTGAAGCAGTC
LX119：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGTTCAGCTRCARCAGTCTGG
LX120：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAAGTGCAGCTGTTGGAGAC
LX121：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGACGTGAAGCTCGTGGAGTC
LX122:GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAWGTGCAGCTGGTGGAGTC
LX123：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTGCAGATGAAGCAGTC
LX124：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAAGTGATGCTGGTGGAGTC
LX125：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGSAGGTYCAGCTGCARCAGTC
LX126：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTGCAGCTGAAGSAGTC
LX127：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGARGTGAAGCTGGTGGARTC
LX128：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGTGMAGCTTSTYGAGTCTGG
LX129：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTGCAGAATAAGTCAGG
LX130：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTCCAACTGCAGCAGCC
LX131：GACAGCAGGAGTGCACTCCGARGTGMAGCTGGTGGARTCTG
LX132：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAGGTCCAGCTTCAGCAGTC
LX133：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAGGTGAAGCTGATGGAGTC
LX134：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCWGG
LX135：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAAGTGCAGATGAAGGAGTC
LX136：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGG
LX137：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGATCCAGTTGGYGCAGTC
LX138：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGAGGTGCAGCTTGTTGAGTC
LX139：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGG
LX140：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGCAGGTCCAACTCCAGCAGCC
LX141：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTKKTRGAGACYGG
所述的重链可变区反向引物组2还可包含以下序列引物NX13至NX18以及NX25中的任意1～7个，优选地包含2～4个：
NX13:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTCAGCTTGTTGATGCCGTGG
NX14:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGACGTGATCTCGCCGTGG
NX15:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGG
NX16:GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAG
NX17：GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGGAGCAGTGAGCGTGTCGC
NX18：GGGGCCCTTGGTGGAAGCTCCGCAGGTTGACGGAGCGGTG
NX25：GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGGAGACGGTGACTGAGG；
其中，序列出现兼并碱基意义如下：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。
5.根据权利要求1-4任一项所述的组合引物，其特征在于：所述的轻链可变区正向引物组2还可包含以下序列引物LX146至LX169中的任意1～24个，优选地包含5～15个：
LX146：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTTGTGGTGACTCAAAC
LX147：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAAWTGTGCTCACCCAGTC
LX148：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAmATTGTkmTsACCCAGTC
LX149：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATTGTGMTGACHCAGTC
LX150：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCCAGATGACHCAGTC
LX151：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCCTGATGACCCAATC
LX152：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATATCCAGATGACACAGAC
LX153：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAACAACTGTGACCCAGTC
LX154：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATATTGTGATGACSCAGGC
LX155：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTCCAGATGATTCAGTC
LX156：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAAATTGTTCTCACCCAGTC
LX157：GACAGCAGGAGTGCACTCCRRTRTTGTGATGACCCARAC
LX158：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATTGTGATGACMCAGTC
LX159：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCAAGATGACCCAGTC
LX160：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTCCAGATAACCCAG
LX161:GACAGCAGGAGTGCACTCCACACAGGCTGCACTCTCCAA
LX162:GACAGCAGGAGTGCACTCCACTGGAGAAACAACACAGGC
LX163:GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCCwGATGACyCArwCTCC
LX164:GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTCCAGATRAMCCAGTC
LX165:GACAGCAGGAGTGCACTCCAATATCCAGGTGATCCAG
LX166:GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCCAGATGACHCAGTC
LX167:GACAGCAGGAGTGCACTCCGAAACAACTGTGACCCAGTC
LX168:GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATCTTGCTGACTCAGTC
LX169:GACAGCAGGAGTGCACTCCACTGGAGAAACAACACAGGCTC；
所述的轻链可变区反向引物组2还可包含以下序列引物NX21至NX24中的任意1～4个，优选地包含2～3个：
NX21：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC
NX22：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC
NX23：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTKATTTCCARCTTKGTSCC
NX24GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC
其中，序列出现兼并碱基意义如下：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。
6.使用权利要求1至5人一项所述的组合引物进行抗体轻重链可变区扩增的方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)进行抗原特异性单B细胞的分选；
(2)将抗原特异性单B细胞的基因进行反转录；
(3)使用所述的组合引物进行巢式PCR扩增。
7.根据权利要求6所述的方法，所述的步骤(3)包括以下步骤：以cDNA为模板分别进行第一轮巢式PCR抗体重链可变区和轻链可变区基因的扩增，所述第一轮重链可变区的扩增使用重链可变区引物组1；所述第一轮轻链可变区的扩增使用轻链可变区引物组1；以第一轮扩增的重链、轻链PCR反应产物为模板分别进行第二轮巢式PCR抗体重链可变区基因的扩增，所述第二轮重链可变区的扩增使用重链可变区引物组2；所述第二轮轻链可变区的扩增使用轻链可变区引物组2。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811618134.4A CN111378650A (zh) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | 一种用于巢式扩增的组合引物及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN112501273A (zh) * | 2020-07-27 | 2021-03-16 | 暨南大学 | 用于扩增马抗体的巢式pcr引物、试剂盒及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107760690B (zh) * | 2017-10-25 | 2018-08-28 | 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 | 一种高通量全人源抗体的制备方法及应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112501273A (zh) * | 2020-07-27 | 2021-03-16 | 暨南大学 | 用于扩增马抗体的巢式pcr引物、试剂盒及其应用 |
| CN112501273B (zh) * | 2020-07-27 | 2021-06-29 | 暨南大学 | 用于扩增马抗体的巢式pcr引物、试剂盒及其应用 |
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