CN102670614B

CN102670614B - 化合物6-苄氨基嘌呤用于制备抑制肝组织氧化损伤组合物的应用

Info

Publication number: CN102670614B
Application number: CN 201210000981
Authority: CN
Inventors: 刘玉梅; 张自强; 邓雯; 吕琼霞; 陈晓光
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2012-01-04
Filing date: 2012-01-04
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2032-01-04
Also published as: CN102670614A

Abstract

本发明公开了一种化合物6-苄氨基嘌呤用于制备抑制肝组织氧化损伤组合物的应用。本申请以大量的实验为基础证实了6-BA对动物肝组织也具有抗氧化损伤作用。可以作为抗肝组织氧化损伤的活性物质，添加到药物、食品或保健品当中，抑制肝组织氧化损伤，提高免疫力和抗衰老，增强肝组织抗氧化损伤能力。其中药物可以采用医学上可接受的任何剂型，用量为900mg/kg.b.w左右。

Description

化合物6-苄氨基嘌呤用于制备抑制肝组织氧化损伤组合物的应用

技术领域

本发明涉及一种化合物6-苄氨基嘌呤用于制备抑制肝组织氧化损伤组合物的应用。

背景技术

氧化损伤的积累是引起机体衰老及疾病发生的主要原因。氧的毒性不是由于氧分子本身的反应能力，而是由于氧分子还原成水过程中产生的许多中间产物，包括超氧阴离子、过氧化氢分子、羟自由基、氢过氧基、氢过氧化物、烷氧基、烷过氧基和单线态氧，这些中间产物习惯被称为自由基。由于自由基是具有不配对电子的原子、分子或离子，具有得到或失去电子的倾向，因此其性质特别活泼，具有很高的反应活性，极易与其它物质发生反应生成新的自由基或氧化物。在有机体的生命活动过程中，自由基的产生、淬灭、利用和损伤作用是几乎同时进行的对立统一过程。在生理状况下，机体内氧自由基的产生和清除处于动态平衡状态，动物体内有一套完整的防御系统来保护机体不受自由基的伤害。但在病态和衰老的情况下，机体不能有效清除产生的氧自由基，这些过剩的自由基主要通过脂质过氧化作用损伤蛋白质与核酸等生物分子致使组织损伤而发生疾病。

肝脏是人体内最大的、功能最多的实质性腺体器官，被喻为“人体最大的化工厂”，它参与体内消化、代谢、排泄、解毒和免疫等过程，是机体内代谢极为活跃的重要脏器。因此，肝脏一方面耗氧量大，产生的氧自由基多；另一方面肝脏在药物(或外源性药物)的代谢和处置中起着重要作用，许多药物和毒物经细胞色素P450氧化后可形成不成对的电子的代谢物，即自由基。肝内产生过多的自由基，将会造成氧化损伤，而氧化应激是许多肝脏疾病的共同发病机制。如环境应激物及代谢应激物通过对肝细胞线粒体的损伤产生自由基，在细胞因子等共同作用下引发脂肪性肝炎；病毒性肝炎的发病机制至今尚未完全阐明，但越来越多的研究表明氧化损伤是重要的影响因素，因为病毒性肝炎患者的肝脏中促氧化/抗氧化系统处于严重失衡状态。因此，肝脏氧化损伤是动物和人体所面临的一个非常常见和严重的问题，它可引起动物和人体的衰老和其他疾病的发生，加重机体的衰老和病变。目前，市场上有许多抗肝脏氧化损伤的物质，但是大多数都有不易提取获得、纯度不高、有效成分不明确、价格高等缺点，给应用带来了很大的麻烦。由此，开发一种来源广，纯度高，成分明确，效果好，安全无毒无害的抗肝脏氧化损伤的物质将是非常迫切且具有重要意义的任务。

发明内容

本发明的目的是提供一种化合物6-苄氨基嘌呤用于制备抑制肝组织氧化损伤组合物的应用。

所述的组合物为食品、药物或保健品。

所述的肝组织氧化损伤是由自由基导致的。

所述的肝组织氧化损伤为由CCl₄引起肝索结构紊乱的损伤。

所述的6-苄氨基嘌呤用于提高氧化损伤肝组织中的T-SOD活性。

所述的6-苄氨基嘌呤用于提高氧化损伤肝组织中的GSH-Px活性。

所述的6-苄氨基嘌呤用于降低氧化损伤肝组织中的MDA含量。

6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)，1952年美国wellcome research实验室合成，六十年代日本将其商品化，是第一个人工合成的细胞分裂素。6-BA分子式为C₁₂H₁₁N₅，结构式如下：

纯品为白色结晶，工业品为白色或浅黄色，无臭，熔点235℃，在酸、碱中稳定，光、热不易分解。水中溶解度小，为60毫克/升，在乙醇、酸中溶解度较大。它具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，具有稳定、廉价和易于使用等特点，且是一种对人、畜安全的植物生长调节剂，因此广泛用在农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。

6-BA在植物方面的抗氧化损伤和抗衰老的作用是非常明显的，在动物和人体上的应用还未见相关报道。本申请以大量的实验为基础证实了6-BA对动物肝组织也具有抗氧化损伤作用。可以作为抗肝组织氧化损伤的活性物质，添加到药物、食品或保健品当中，抑制肝组织氧化损伤，提高免疫力和抗衰老，增强肝组织抗氧化损伤能力。其中药物可以采用医学上可接受的任何剂型，用量为每日900mg/kg.b.w左右。

附图说明

图1是实施例1对照组(I组)的肝脏组织切片显微镜400倍照片；

图2是实施例1模型组(II组)的肝脏组织切片显微镜400倍照片；

图3是实施例16-BA低剂量组(III组)的肝脏组织切片显微镜400倍照片；

图4是实施例16-BA高剂量组(IV组)的肝脏组织切片显微镜400倍照片。

具体实施方式

以下采用实施例来进一步说明化合物6-苄氨基嘌呤在制备抗肝组织氧化损伤药物上的应用。

实施例

通过试验动物及损伤模型来试验6-苄氨基嘌呤在提高肝组织抗氧化损伤能力方面的作用，四氯化碳(CCl₄)会导致动物肝组织中自由基的产生，是一种自由基诱发剂，摄入小鼠体内会使肝组织产生自由基从而构建小鼠体内的肝组织氧化损伤环境，利用摄入6-苄氨基嘌呤测试其对抑制肝组织氧化损伤的作用。本实施例仅用以说明而非限定本发明的用途，对于其它自由基诱发剂或自然因素的肝组织氧化损伤会起到相同的作用。

1.试验药品和试剂：6-苄氨基嘌呤(6-BA)，购于厦门星隆达化学试剂有限公司，由美国Sanland公司生产，用0.06mol/L的盐酸配制成1000mg/L、2000mg/L的储备液；丙二醛(MDA)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)检测试剂盒和考马斯亮兰试剂盒，均为南京建成生物工程研究所生产。

2.试验动物及损伤模型复制：健康昆明系小白鼠，雄性，体重(20.0±2.0)g，购自河南科技大学动物医学院；6-BA灌胃给药，给药量分别按照20和40mg/kg.b.w计算，每天一次，连续一周；末次给药两小时腹腔注射CCl₄溶液，复制小鼠肝脏组织氧化损伤模型。

3.小鼠分组及处理：将小鼠随机分为4组，具体分组和处理方法如下，I组：空白对照组，灌胃0.06mol/L盐酸0.4ml，每天一次，连续一周，末次灌胃两小时腹腔注射溶剂油溶液(新鲜无菌植物油)0.2ml，随后动物禁食。II组：模型组，灌胃0.06mol/L盐酸0.4ml，每天一次，连续一周，末次灌胃两小时腹腔注射3.2％CCl₄的注射溶剂油溶液(新鲜无菌植物油)0.2ml，复制小鼠肝脏组织氧化损伤模型，随后动物禁食。III组：6-BA低剂量保护组，灌胃1000mg/L 6-BA药液0.4ml，给药剂量为20mg/kg.b.w，每天一次，连续一周，末次灌胃两小时腹腔注射3.2％CCl₄油溶液(新鲜无菌植物油)0.2ml，复制小鼠肝脏组织氧化损伤模型，随后动物禁食。IV组：6-BA高剂量保护组：灌胃2000mg/L 6-BA药液0.4ml，给药剂量为40mg/Kg.b.w，每天一次，连续一周，末次灌胃两小时腹腔注射3.2％CCl₄的注射溶剂油溶液(新鲜无菌植物油)0.2ml，复制小鼠肝脏组织氧化损伤模型，随后动物禁食。

4.待测样本采集和处理：相应处理结束后，从每组随机抽取10只小鼠，禁食24小时后脱颈椎处死。取出肝组织，用冷生理盐水漂洗后制成10％的肝匀浆，离心，取上清液，准备检测各项指标。另每组随机抽取3只小鼠，准备制作石蜡切片。

4.1总蛋白的测定：按说明书的要求，在测定抗氧化酶和MDA之前，先测定10％肝匀浆的总蛋白含量，以考马斯亮兰法，用紫外可见分光光度计在540nm处测定各管吸光度(A)值，按下列公式计算各管的蛋白含量。

蛋白含量(g/L)＝(测定管A值/标准管A值)*标准管浓度(g/L)

4.2T-SOD活力测定：取10％肝脏组织匀浆，用生理盐水稀释成1％组织匀浆后通过黄嘌呤氧化酶法参照试剂盒说明，用紫外可见分光光度计在550nm处比色，测定吸光度，计算T-SOD活力。

4.3GSH-Px活性测定：取10％肝脏组织匀浆用生理盐水稀释成0.8％的匀浆液后，参照试剂盒说明，通过DTNB法参照试剂盒说明，用紫外可见分光光度计在412nm处比色，测定吸光度，计算GSH-Px活力。

4.4MDA含量测定：取10％肝脏组织匀浆用生理盐水稀释成5％匀浆液后通过TBA法参照试剂盒说明，用紫外可见分光光度计在532nm处比色，测定吸光度，计算MDA活力。

4.5组织切片的制作：取肝脏组织，截取3mm×4mm大小方形块，放在10％甲醛溶液中固定24～48小时。随后经冲洗、脱水、透明、浸腊和包埋后，用切片机做连续冠状切片，厚度7～8μm。之后脱蜡行HE染色，再经脱水封片后用显微镜观察并拍照。

4.6数据分析：试验结果均以X±SD表示，并采用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，组间差异显著性采用Duncan检验法。本专利的X，指的是平均值，SD指标准差。

5.试验结果

5.1肝脏组织匀浆T-SOD活力的测定结果

肝匀浆T-SOD活力的测定结果见表1。II组小鼠T-SOD的活力比I组(对照组)显著降低，证明模型复制成功，III和IV组肝匀浆T-SOD的活力均显著高于II组。表明6-BA具有提高小鼠肝脏组织中T-SOD活性的能力。

表1各组小鼠肝脏组织匀浆中T-SOD活力(X±S)

注：^*与对照组相比，差异显著(P＜0.05)；^Δ与模型组相比差异显著(P＜0.05)。

5.2肝脏组织匀浆中GSH-Px活力的检测结果

如表2所示，模型组(II组)的GSH-Px活力为106.28U/mgprot，与空白对照组(I组)160.28U/mgprot相比，显著下降(P＜0.05)。III和IV组，GSH-Px活力分别达到141.35U/mgprot、154.98U/mgprot显著高于模型组(II组)。表明6-BA在小鼠肝脏氧化氧化损伤过程中能提高GSH-Px活力。

表2各组小鼠肝脏组织匀浆中GSH-Px活力情况(X±S)

注：*与对照组相比，差异显著(P＜0.05)；^Δ与模型组相比差异显著(P＜0.05)。

5.3肝脏组织匀浆中MDA含量的测定结果

如表3所示，模型对照组(II组)的MDA活力升高达到1.78nmol/mgprot，与空白对照组(I组)0.84nmol/mgprot有显著性差异(P＜0.05)。III和IV组与II组相比MDA含量显著降低，表明6-BA在小鼠肝脏组织氧化损伤过程中能降低MDA的产生量。

表3各组小鼠肝脏组织匀浆中MDA含量情况(X±S)

5.4HE染色观察各组小鼠肝脏组织形态结构变化

如图1所示，对照组肝细胞排列有序，染色均匀，细胞浆无深染、无空泡，细胞核无消失以及融合等表现。如图2所示，模型组小鼠出现肝索排列紊乱，中央静脉出现明显淤血，肝细胞大面积肿胀、空泡变性，部分细胞核碎裂以及溶解消失。如图3所示，6-BA低剂量组肝细胞索结构基本完整，个别细胞出现肿胀、核深染以及核消失现象。如图4所示，6-BA高剂量组肝细胞索结构清晰完整，损伤轻微，核结构与对照组无明显差异。

Claims

1.一种化合物6-苄氨基嘌呤用于制备抑制肝组织氧化损伤组合物的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的组合物为食品、药物或保健品。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肝组织氧化损伤是由自由基导致的。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肝组织氧化损伤为由CCl₄引起肝索结构紊乱的损伤。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的6-苄氨基嘌呤用于提高氧化损伤肝组织中的T-SOD活性。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的6-苄氨基嘌呤用于提高氧化损伤肝组织中的GSH-Px活性。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的6-苄氨基嘌呤用于降低氧化损伤肝组织中的MDA含量。

8.根据权利要求5或6或7所述的应用，其特征在于，所述氧化损伤肝组织是由CCl₄引起的。