CN102665687A - 用于细胞刺激随后进行治疗性免疫的乙肝病毒抗原制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗性免疫的领域，特别涉及使用乙肝病毒(HBV)的抗原的新的制剂用于细胞刺激。所述制剂由HBV的悬浮液中沉淀的表面抗原(HBsAg)和核衣壳(HBcAg)构成。该制剂包含这些抗原的大小小于500nm和大于500nm的悬浮颗粒的混合物，其中所述大小的颗粒的比例分别是50％-50％和80％-20％。选择一定范围的大小的颗粒允许使数种细胞类型的刺激水平最大化。另外，描述了使用该制剂的细胞刺激方法和后续对患有慢性乙肝的患者的被动免疫，其是基于使用异源或自体细胞(树突细胞、B细胞和巨噬细胞)在体内或体外的最大化的刺激。以该制剂刺激的细胞被转移至慢性感染HBV的患者。

Description

用于细胞刺激随后进行治疗性免疫的乙肝病毒抗原制剂

技术领域

本发明涉及医药，特别是通过转移已经经过乙肝病毒(HBV)的表面抗原(HBsAg)和核衣壳抗原(HBcAg)的制剂刺激的细胞而进行的治疗性免疫。通过包含这些抗原的混合物的制剂诱导细胞刺激，所述抗原从悬浮液中沉淀，其比例是基于在被动免疫治疗应用之前实现最大化细胞刺激而选择的。

背景技术

世界卫生组织(WHO)认为世界上三分之一以上的人口已经被乙肝病毒(HBV)感染。认为5％至10％的成人和高达90％的被感染的新生儿是以持续方式产生感染，在世界水平而言有350,000,000人口携带该病毒。长时间段内HBV的持续复制导致进行性的肝病，其在大约25％的携带者中进展为肝硬化或肝癌。认为每年有一百万以上的死亡与不同进展形式的该病毒的感染相关(Zuckerman JN.J MEDVIROL 2006；78：169-177)。

使用缀合于聚乙二醇(PEG)的干扰素α(IFN-α)或其变体和核苷或核苷酸、例如拉米夫定、阿德福韦-二匹伏、恩替卡韦和Telbivudina进行的治疗构成了治疗慢性乙肝(CHB)的现有技术。一般地，就持续消除病毒而言，这些药物有效性差，并且它们的使用与严重的次级效应相关(Osborn MK，et to the one.J ANTIMICROBCHEMOTHER.2006；57：1030-34)。

具有高百分率的预防乙肝的有效性的疫苗的开发构成了世界水平的预防医学的重大成就。目前，超过150个国家在免疫项目中向儿童、青少年和风险群体提供抗乙肝疫苗。第一代疫苗是基于从无症状携带者的血浆获得的纯化且灭活的HBsAg。这些制剂是免疫原性的；但是，它们迅速被在酵母中产生的具有更高安全性的重组疫苗替代(Zuckerman JN.J MED VIROL 2006；78：169-177)。目前，研究聚焦于免疫原性更高、更有效的制剂的开发，起始于强有力的佐剂的导入，但是这些制剂对于治疗慢性感染未获成功。

从上世纪90年代开始，进行了旨在评估使用疫苗接种来治疗HBV慢性感染的研究。该治疗策略已经受到了强烈关注，其来自证实了免疫应答对于控制该病毒的基础性作用的证据。研究此课题的研究组寻求颠覆对于HBV的免疫耐受态，从施用疫苗制剂开始(Hui CK，et al.INT J MED SCI.2005；2：24-29)。

最近，以治疗目的使用常规的预防性疫苗在免疫治疗领域获得的结果提示了研究使用更强有力的、包含新的抗原、佐剂、新施用途径和合理的组合治疗的疫苗候选物的必要性(Pol S，et al.Expert RevVaccines 2006；5：707-16)。设计最佳疫苗候选物时应牢记与抗原性成分相关的方面，以及与制剂的佐剂成分相关的方面。

遗传工程与生物技术中心(CIGB)使用酵母“巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)”作为宿主细胞生产了重组HBsAg。该抗原是古巴从九十年代初期批准和使用的抗乙肝疫苗的一部分(Muzio V，et al.European patent No.EP 480525)。

HBsAg具有在健康人中诱导强烈的特异性免疫应答(抗体的和辅助性T细胞的)的能力。另外，已经证明HBsAg表位可以由I类主要组织相容性系统(HLA)的分子呈递，即使是当该蛋白像异源蛋白一样被抗原呈递细胞加工的时候。该性质允许非佐剂化的HBsAg通过经替代性加工途径产生的表位诱导细胞毒性应答，允许HBsAg特异性细胞毒性细胞库的扩增(Bertoletti A，J Hepatol 2003；39：115-124)。然而，该抗原在治疗性免疫中的使用未在II期研究中产生可重现的益处。目前，尚不存在针对HBV慢性感染的治疗性疫苗。

用于促进慢性患者中的免疫应答的策略之一是使用HBcAg作为疫苗抗原。HBcAg的氨基酸序列的显著特性是在羧基末端存在富含精氨酸的区域。该区域具有在天然颗粒中连接前基因组核糖核酸(RNA)的功能。在重组颗粒的情况下，该区域与细菌RNA(大小为30-3000个核苷酸)结合，这赋予了重要的免疫性质(Riedl P.J Immunol 2002；168：4951-59)。

治疗HBC时的“免疫治疗”的概念暗示了缺陷性免疫应答的重激活，目标是控制病毒复制和消除或控制感染。在骨髓移植研究中已经直接验证了该概念。可以证明，来自具有针对HBV的免疫力的供体的细胞的骨髓移植至被该病毒慢性感染的受体时，该程序能够治愈受体患者的慢性感染(Lau GK，Gastroenterology 2002；122：614-24；SHOUVAL D，ILAN Y.J HEPATOL 1995；23：98-101)。然而，使用商售疫苗免疫对HBV无免疫的供体(non-immune donor)未在受体患者骨髓淋巴细胞中产生治疗性应答，这使得该治疗策略的工业应用产生了巨大的局限性，因为其依赖于供体的天然感染。

在被HBV慢性感染的过程中，在效应子细胞和专职抗原呈递细胞中，T和B效应子细胞的应答是差的、缺失的或功能上有缺陷的。然而，产生自我限制或急性感染的患者显示出针对表面蛋白、核衣壳和聚合酶的多克隆和多特异性的强烈的细胞毒性和辅助性应答(Webster GJ，J Virol 2004；78：5707-19)。另一方面，在慢性感染过程中，被不同病毒抗原刺激的外周血的淋巴细胞分泌的Th1相关的细胞因子的水平非常差，与急性感染时的情况正相反(Jung MC.Virology1999；261：165-72；PENNA A，HEPATOLOGY 1997；25：1022-27)。这些发现提示：促进特异性免疫应答能构成治疗替代方案。

另一项有趣的发现是：从HBC自发复原的患者，或对于IFN-α治疗有应答的患者，能够产生强度类似于产生急性感染的患者的细胞毒性应答(Rehermann B，J Clin Invest 1996；97：1655-65)。另外，证明了以拉米夫定治疗的患者中的CD4+和CD8+细胞应答的水平的升高，这提示可以从病毒的持续抑制出发，诱导免疫应答(Boni C，Hepatology 2001；33：963-71；BONI C，J HEPATOL 2003；39：595-605)。

在免疫治疗策略中，治疗性疫苗接种构成了1990年代治疗被HBV慢性感染的患者时应用的替代方案。主要的免疫治疗策略着眼于表面和病毒核衣壳抗原的使用。

通过过继转移(adoptive transfer)的方式证明了针对HBcAg的细胞免疫力在控制乙肝慢性感染中的重要性。在患有CHB、接受免疫供体的骨髓细胞的过继转移的患者中进行的研究证明：可以消除这些患者的血清中的HBsAg。能够通过此治疗消除HBsAg的患者的研究证明了HBV慢性感染的消除与特异于HBcAg的CD4+T淋巴细胞的转移相关(Chee-Kin H，Int J Med Sci 2005；2：24-29)。

使用抗原呈递细胞的免疫治疗

树突细胞是免疫系统的专职抗原呈递细胞，其指令并控制T和B淋巴细胞(特异性免疫力的介导者)的激活。从1996年直至2004年，使用载入了肿瘤抗原或以肿瘤抗原脉冲化处理的树突细胞进行了超过60项临床研究(Steinman RM.Nature 2007；449：419-426)。这些研究中多数是在黑色素瘤患者中进行。在很多患者中，临床应答与特异性细胞毒性T应答的诱导匹配(Figdor CG.Nat Med 2004；10：475-480)。显然，以树突细胞治疗的癌症患者的临床进展不令人满意。

目前，使用树突细胞的免疫治疗(免疫治疗中使用的所有呈递细胞中最先进的)领域的专家预测：以抗原脉冲化处理的树突细胞极有可能在未受癌症影响的患者中是更有效的，因为它们的免疫系统损伤小(Onji M，Akbar SMF.Dendritic cells in clinics.2008；2nd edition，Springer)。然而，这仍然是空想计划。

发明内容

本发明解决了上述问题，提供了用于刺激同源或异源细胞的最佳制剂。本发明的制剂是由悬浮液中的HBsAg和HBcAg抗原的颗粒构成的。另外，公开了使用特定和合适比例的该制剂进行细胞刺激的方法，以及基于异源或自体细胞(包括树突细胞、B细胞和巨噬细胞)的体内或体外最大刺激而进一步被动免疫CHB患者。本发明的制剂包含HBsAg和HBcAg抗原，作为悬浮液中的颗粒的混合物，大小分别为小于500nm和大于500nm，这些大小的颗粒的比例为50％-50％至80％-20％。

本发明的目标还有：被动免疫方法，其特征在于：通过使用包含HBsAg和HBcAg抗原的制剂体内免疫未受感染的人——供体，从而进行细胞刺激；提取特异性激活的免疫细胞；然后将其被动转移至被HBV慢性感染的患者。在本发明的替代性实施方式中，细胞刺激是：体内免疫未受影响的人——供体；提取特异性激活的免疫细胞；使用HBsAg和HBcAg抗原的制剂在体外重新刺激所述细胞；然后将其被动转移至被HBV慢性感染的患者。在本发明的另一个实施方式中，细胞刺激这样进行：提取对于HBsAg或HBcAg无免疫的人的免疫细胞；使用HBsAg和HBcAg抗原的制剂在体外刺激所述细胞；然后被动转移至患者。在本发明的另一个实施方式中，细胞刺激这样进行：提取患者的免疫细胞；使用HBsAg和HBcAg抗原的制剂在体外刺激所述细胞；然后被动转移至同一患者。

在本发明中，对于抗原性刺激，已经获得了HBsAg和HBcAg沉淀物，以及，就它们的物理-化学性质而言，最适用作刺激元件的这些抗原的制剂。已经以核蛋白形式产生了HBcAg，其包含小的但数量明显的Toll样受体(TLR)配体，和脱氧核糖核酸(DNA)及RNA。

在本发明中，通过允许HBsAg与HBcAg物理结合的方法沉淀了这些抗原。该方法使得细胞的刺激水平在转基因小鼠和人类中是最大的，分别诱导HBsAg和病毒载量的下降。通过该方式，证明了这种类型的被动免疫在治疗HBV慢性感染中的功能和重要性。在本发明中，使用外周血单核细胞、B细胞、树突细胞和巨噬细胞证明了被动免疫，显示了其控制患者中的HBsAg水平和病毒载量水平的能力。

本发明提供了解决存在于现有技术中的问题的方法，该方法是通过加强供体中的抗-HBsAg和抗-HBcAg免疫应答，起始于使用包含HBsAg和HBcAg抗原的制剂主动免疫供体，另外，在转移之前在体外激活待转移的细胞，从而使得当细胞被接种于受体生物时，针对这些抗原的应答是最大化的。

通过实施本发明所获得的结果证明了获得具有最佳的同化能力的抗原、APC的激活和成熟、以及用于获得有效免疫应答的方法的重要性。

本发明的目标还在于，由悬浮液中的乙肝病毒(HBV)的表面抗原(HBsAg)的颗粒和核衣壳(HBcAg)的颗粒构成的制剂用于细胞刺激以及同时或不同时主动免疫患有HBC的患者的用途。

附图说明

图1.关于与HBcAg结合的核酸的物理方面、色谱和存在的研究。A.透射电镜，比例尺是200nm。B：通过高效液相色谱(HPLC)研究颗粒的大小和均一性：显示了HBsAg(上面的图板)和HBcAg(下面的图板)的图谱。在TSK-G6000柱中以PBS中的0.25mL/分钟的流速运行，应用100μg每种蛋白。检测在280nm进行。两种颗粒具有73分钟的保留时间。下面的色谱图中的第二个峰对应于溶液的非蛋白成分，其中HBcAg被稀释(乙二胺四乙酸)。C：在琼脂糖电泳中检测与HBcAg结合的核酸的存在。泳道1：DNA分子量模式；2：HBcAg；3：以RNAse(2mg/mL)在37℃处理了6小时的HBcAg。被处理的HBcAg的浓度是0.447mg/mL。

图2.通过流式细胞术研究溶液中的HBsAg-HBcAg复合物的大小的增加。A.1X PBS、pH 7.0中的HBsAg和HBcAg抗原的制剂。B.在pH 4.0以50mm乙酸溶液透析1小时之后的制剂。C.在pH 4.0以50mm乙酸溶液透析2小时之后的制剂。D.在pH 4.0以50mm乙酸溶液透析3小时之后的制剂。E.在pH 4.0以50mm乙酸溶液透析5小时之后的制剂。F.在pH 4.0以50mm乙酸溶液透析8小时之后的制剂。G.在pH 4.0以50mm乙酸溶液透析24小时之后的制剂。H.流式细胞仪校正珠，2.5微米。

图3.转基因小鼠中的被动免疫的研究：从以HBsAg和HBcAg抗原的制剂免疫的供体开始。A.在不同的评价时间点，经处理和未经处理的动物的血清中的抗原血症的动态(HBsAg的浓度以μg/ml表示)。B.小鼠血清中的抗-HBsAg IgG抗体应答。C.通过ELISA测定的血清中的抗-HBcAg IgG抗体应答。

发明详述/实施例

实施例1.悬浮液中的HBV表面抗原和核衣壳抗原的酸沉淀物的产生

HBcAg(CIGB，Cuba)表达为183个氨基酸的重组蛋白，纯化自大肠杆菌。在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中产生重组HBsAg，adw2亚型(CIGB，Cuba)。按照之前的描述(Aguilar JC.Immunol CellBiology 2004；82：539-546)进行HBcAg蛋白的发酵和纯化过程。该抗原的纯化过程产生高度纯化的核衣壳抗原(＞95％)，如图1A中可见。该抗原的分子大小与HBsAg相似，这意味着也形成病毒样颗粒(图1B)，并另外包含与其化学结构结合的痕量核酸，其作为TLR刺激物发挥作用，如图1C中可见。这些痕量结合的TLR配体主要可表征为RNA和残余量的DNA，二者都是细菌来源的。

与纯化的HBcAg蛋白结合的核物质的存在可以通过260nm处吸光度相对于其他蛋白(例如HBsAg和牛血清白蛋白)的增加来检测，当它们的浓度与HBcAg相同时，在260nm处具有1/2的吸收值(数据未显示)。然而，为了研究核物质是否与颗粒结合，在存在溴化乙啶的情况下进行了琼脂糖凝胶电泳。该实验证明在检测到蛋白的相同区域存在核物质。

使用RNAse酶的处理允许消除与颗粒结合的多数核物质，这证明RNA构成该核蛋白中较高百分率的核成分(图1C，泳道2和3)。综合起来，这些结果显示了病毒样颗粒的物理方面，以及重组HBcAg蛋白的核蛋白性质，并且核酸的主要部分是RNA，虽然也有与其结合的DNA。

为了产生HBsAg和HBcAg沉淀物悬浮液，进行了针对pH 4.0的50mM乙酸溶液的两种抗原的混合物的透析，蛋白浓度为0.1至2mg/mL。根据颗粒大小选择沉淀物悬浮液，透析时间限定为10分钟至24小时。备选方法是改变HBsAg-HBcAg混合物的缓冲溶液。这可以使用具有小于抗原大小的孔径(＜20nm)的纤维筒，通过渗滤法进行。在该情况下，当调节pH值至4.0时发生酸沉淀过程。在这两种沉淀方法中，暴露于pH变化确定了沉淀物的大小。根据其大小选择沉淀物，取决于该特征的是以这些制剂免疫之后所刺激的细胞的类型。

然后，将这些沉淀物佐剂化或不进行佐剂化，取决于所需的制剂。一种变体进行与氢氧化铝的吸附，但是也进行了与贮库效应佐剂组(盐和油性佐剂)的其他佐剂或免疫刺激剂(脂多糖、皂苷及其衍生物)的吸附。

实施例2.HBsAg和HBcAg抗原悬浮的分子大小的表征和选择用于同化和抗原刺激的最佳大小的方法

为了选择用于刺激专职抗原呈递细胞的最佳大小的沉淀物，选择了4种沉淀物变体。通过实施例1中描述的方法产生沉淀物变体，进行透析和渗滤法，pH调节为4.0，进行预先确定的温育时间。

通过流式细胞术进行大小选择，对于校正，使用2.5μm的大小式样珠子作为上限。在实验中使用50nm至2.5μm，其证明了：一般地，同化和细胞刺激的区别在于沉淀物大小和细胞类型的依赖性。巨噬细胞似乎是更容易同化的细胞，沉淀物大小大于500nm。通过这种方式，选择了沉淀物混合物以增加抗原性混合物的刺激能力。因此，相对于使用非沉淀物颗粒所获得的，使用这些混合物获得了较高水平的刺激和免疫原性。

图2显示了使用不同颗粒进行流式细胞术产生的图像和直方图。显示出“正向散射”水平的偏移，其代表所获得的颗粒的大小的增加。该大小增加的发生与抗原混合物(HBsAg和HBcAg)的温育时间成直接比例关系。还观察到“侧向散射”水平的增加，其是悬浮液中颗粒的内在粗糙性的反映，由大小为22nm的抗原形成，达到2.5μm，如考虑到2.5μm的珠子式样所观察到的，如图2H所示。

考虑到流式细胞术允许建立象限系统和以直方图表示的范围，根据具有已建立的范围的象限内的坐标或通过直方图中范围的建立而进行沉淀的颗粒的选择。在图2中显示了透析中的抗原性混合物的温育结果，其允许选择不同大小的沉淀物。通过直接沉淀获得了相似的结果，乙酸盐缓冲溶液的pH从pH 7.0降低至pH 4.0，但是时间范围不同。最后的选择通过流式细胞术和免疫原性标准来进行。

实施例3.使用来自之前以包含HBsAg和HBcAg抗原的制剂免疫的Balb/c小鼠的细胞过继转移至表达HBsAg的转基因Balb/c小鼠而进行的被动免疫的研究

基于开发疫苗候选物而进行的免疫治疗，构成了慢性乙肝治疗的策略之一。候选物的有效性取决于能够克服对于病毒抗原的耐受态(这是该疾病的特征)的强有力的体液和细胞免疫应答的产生。

在本发明中，通过使用包含HBsAg和HBcAg的制剂进行的主动免疫加强了供体中的抗-HBsAg和抗-HBcAg免疫应答。另外，在转移之前，在体外激活待转移的细胞，从而当细胞被接种于受体生物时，针对这些抗原的应答是最佳的。通过这种人工方式，产生了在人类中不存在的应答类型，其允许增加具有相似单体型(haplotype)的供体(包括人类)的边缘，与他们是否被HBV感染无关。

在本实施例中，通过过继转移细胞的方式测评了通过使用包含HBsAg和HBcAg抗原的疫苗候选物(通过鼻子/胃肠外途径施用)进行疫苗接种而产生的免疫应答在表达HBsAg的转基因小鼠(作为HBV持续感染的模型)中的效应。该研究的目标之一是测评转移的免疫应答对于转基因小鼠的血清中的HBsAg浓度(抗原血症)的效应。另外，将通过鼻子/胃肠外途径施用所描述的制剂进行的主动免疫所诱导的应答的效应与通过过继转移经HBsAg刺激(体内和体外)的细胞而产生的效应进行了比较。另外，在转基因小鼠中就该抗原研究了所转移的抗-HBsAg抗体应答的动力学。测定了免疫力的过继转移对于血液化学和组织学参数的影响，作为通过鼻子/胃肠外途径施用的疫苗候选物的安全性的度量。在本研究中，使用了Balb/c小鼠(H-2d单体型，其来自CENPALAB，Cuba)和HBsAg(+)转基因小鼠(具有Balb/c遗传基础，获自CIGB)。

Balb/c小鼠中抗-HBsAg免疫力的产生

在雌性、8-12周龄的Balb/c小鼠中进行免疫方案。使用包含HBsAg和HBcAg抗原的疫苗候选物免疫小鼠，同时通过鼻内(IN)和胃肠外途径进行，在后一种情况下，测定了肌内(IM)、皮下(SC)和真皮内(ID)途径。在第0天和第14天施药(体积为100μL)，在第100天施用加强剂量，此后进行转移。在第-2、10和25天通过眶后网状组织取血。表1显示了免疫方案设计。

表1.在非转基因Balb/c小鼠中进行的免疫方案

通过ELISA测定通过这些处理产生的体液免疫应答。测定了每次给药后的抗-HBsAg IgG和IgG亚类。在第一次给药10天之后，通过ELISPOT技术测定了细胞免疫应答。将所使用的ELISPOT设计为测定由CD8+脾细胞分泌的抗-HBsAg特异性γ-IFN。这些测定结果表明第5组免疫产生了最高的细胞应答和类似于其余研究组的体液应答。据此，选择了该组的动物作为用于过继转移的脾细胞供体。所选的免疫剂量是1∶1的比例(HBsAg∶HBcAg)，悬浮液中沉淀的抗原的量是10％至50％。也测定了其他比例。

免疫脾细胞的获得

接受加强剂量后15天，杀死第5组的2只小鼠和第7组的3只小鼠(安慰剂)并提取脾。将第5组和第7组的脾分别归组。按照通常方法处理脾以进行脾细胞的纯化。将脾细胞分离为30x10⁶个细胞的等份(在100μL磷酸盐缓冲溶液(1XPBS)中)，以转移至受体小鼠。这些等份中的2个在转移之前接受重新刺激，为此，将它们各与500μL包含HBsAg和HBcAg抗原的制剂和500μL RPMI补充培养基一起温育。温育在15ml的管中在37℃和5％CO₂中进行1小时。样品各搅拌15分钟。温育之后，洗涤这两个细胞等份并分别悬浮于100μL 1XPBS中以用于转移。

免疫力的过继转移

表达HBsAg的转基因小鼠用作受体。所用的转基因小鼠是两种性别的，16-20周龄。它们按照表2所示分为不同的处理组。在脾细胞转移之前，进行部分血液提取以检测血清中的基础HBsAg水平。2天后，通过腹膜内(IP)方式施用30x10⁶个脾细胞(在体积为100μL的1XPBS中)。在5周的时间内，通过眶后网状组织每周进行血液提取，以测定免疫力的过继转移之效应。在转移后第8周，测定动物并称重，然后将它们放血并杀死。对主要的器官进行称重并保存于甲醛中以进行组织学分析。该实验点所提取的血液的一部分用于测定血液化学参数，例如肝转氨酶(ALT)，碱性磷酸酶和肌酸酐。

表2.免疫力的过继性转移的实验设计

HBsAg转基因小鼠的血清中的HBsAg的定量

在我们自己的实验室中开发了用于测定血清中的HBsAg水平的ELISA程序。使用被称作Hep4的抗-HBsAg单克隆抗体(CIGB，Cuba)在50℃涂覆ELISA平板20分钟。然后，使用PBS 1X-0.05％Tween 20进行一系列洗涤，将平板与血清样品在50℃温育1小时，所述血清样品在含有2％脱脂牛奶的1X PBS中按照1/200稀释。在该步骤中，在每个平板中加入已知浓度的HBsAg(CIGB，Cuba)标准曲线。标准物从141ng/ml浓度开始进行连续稀释。

作为阴性对照，使用了非转基因Balb/c小鼠的预免疫血清的混合物。一旦过了温育时间，进行洗涤，将平板与缀合于过氧化物酶的抗-HBsAg单克隆抗体Hep1[在缓冲液(0.44g脱脂牛奶，220μL Tween20，在11ml蒸馏水中)中稀释]在50℃温育30分钟。经过一系列洗涤之后，将平板与底物(柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液；1mg/mL邻苯二胺；0.1％H₂O₂)在室温温育10分钟。最后，通过加入50μL/孔的3M H₂SO₄而终止反应。使用平板读数器(Sensident Scan，Merck)在492nm读取所产生的光密度(O.D)。

所有接受了具有先前的HBsAg免疫力的细胞的小鼠都显示出血清中的HBsAg的明显下降，因为转移后1周时的评估发现在时间零点与第二和第三周之间有显著性差异(p＜0.05)。从第4周(第35天)开始，观察到血清中的HBsAg开始升高，这表明经转移的小鼠中的抗原血症的控制开始消失。从该时间点开始直到第8周(第63天)，未观察到相对于时间零点的抗原血症上的统计上的差异(图3A)。

如图3A所示，在接受了具有HBsAg特异性免疫力的脾细胞的小鼠中，检测到血清中的HBsAg浓度的明显下降，在第7天至28天更为明显。然而，对于接受安慰剂脾细胞或以盐水免疫的小鼠而言，虽然检测到了血清中的HBsAg浓度的波动，但是数值与时间零点相比无显著差异，并且从未检测到低于5μg/ml的值。

这些结果说明：有可能通过细胞免疫力的过继转移有效降低转基因动物的血清中的循环HBsAg水平。由于转移的免疫应答而在抗原血症上建立的控制是有效的，在单次细胞转移后持续大约3周。

随后进行的另一项实验证明：该效应与HBsAg上的HBcAg的刺激相关，因为以只包含HBsAg的制剂刺激的供体动物未产生对于抗原载量的任何控制，并且，相对于以HBsAg与HBcAg组合制剂而言，在这些小鼠中产生较低的应答。

血清中的抗-HBsAgIgG应答

除了79号小鼠之外，在所有接受了具有先前的针对HBsAg的免疫力的脾细胞的小鼠中都检测到了HBsAg特异性IgG抗体应答(图3B)。这与在该特定动物中获得的抗原血症结果是一致的，在该动物中，HBsAg的浓度仅有轻微下降。在具有阳性抗-HBsAg应答的动物中，检测到的效价是高水平的(＞10⁴)，从第3周开始下降。这可能与在第4周左右时(第35天)在这些动物中观察到的抗原血症的增加相关。接受安慰剂细胞或盐水的转移的组未显示出HBsAg特异性抗体效价。

血液化学参数的测评

在研究的末尾，第8周的时候，测定了数项血液化学参数。将血液化学研究设计为：目标是测定由于HBsAg免疫脾细胞向转基因小鼠(在肝、肾和其它器官中组成型表达HBsAg)的过继转移而造成的潜在的器官损伤，测定了肝功能的两个标志物：ALT和碱性磷酸酶，和作为肾功能标志物的肌酸酐。所有的小鼠(处理的和安慰剂)的ALT和肌酸酐的测量值都在这些动物的正常数值范围内。

对于所测定的任何参数，经处理的(接受具有抗-HBsAg免疫力的脾细胞)和未经处理的(接受安慰剂脾细胞或1X PBS溶液)之间的统计学比较未显示出显著性差异。按照性别进行的比较仅仅在碱性磷酸酶的情况下显示出差异：对于雄性获得了较高的数值。

组织学分析

在转移后第8周(第63天)，将本研究中的所有动物杀死，提取并称重所有的相关器官。动物的数据包括：处理开始时的年龄，结束时的重量和大小，数据显示：不存在由于处理造成的任何显著性差异。将提取的器官放入甲醛中以进行组织学分析。进行了所测定的参数之间的一些统计学比较；结果表明：在经处理的和未经处理的动物之间，就动物和器官而言，不存在差异。发现性别之间的一些差异。对于雄性病例中的一些器官获得了较高的数值。

体外重新刺激增强了接受免疫脾细胞过继转移的小鼠中的血清抗-HBcAg免疫应答

考虑到转移至Balb/c转基因小鼠的免疫脾细胞来自具有强有力的抗-HBs和抗HBc免疫应答的小鼠，我们决定评估在受体小鼠的血清中是否可以检测到抗-HBc应答。如图3C所示，只有那些被转移和接受了之前经过组合制剂的体外重新刺激的小鼠(第69和71号小鼠)保留了针对HBcAg的高IgG抗体应答。

接受了具有先前的抗-HBcAg免疫力但是未在体外重新刺激的脾细胞的动物(第29、35和79号小鼠)未显示出血清中的HBcAg特异性IgG应答，类似于在转移了安慰剂脾细胞或以1X PBS免疫的小鼠中所观察到的。该结果证明，当进行这种类型的免疫时，可以加强抗-HBcAg免疫应答。

虽然在本研究中，选择了具有不同大小的沉淀物混合物的特定变体(50％的沉淀物具有小于500nm的大小，其余50％具有大于500nm的大小)，所使用的HBsAg和HBcAg的悬浮液中沉淀物的比例具有差别化的有效性，不同大小的沉淀物的混合物的测定结果允许将免疫原引向不同的抗原呈递细胞群体，这对于同化、细胞激活能力和最终制剂的免疫原性具有影响。

相对于未经处理的相同制剂而言，当使用悬浮液中的抗原制剂时，所获得的抗原呈递细胞激活结果令人惊奇地好。

综合以上获得的所有结果，可以得出结论：免疫力的过继转移是有效的，因为其降低了血清中的循环HBsAg的水平，使用HBsAg和HBcAg组合制剂进行的主动免疫未达到此效果。同样，以上描述的免疫力的过继转移是安全的，因为在所研究的器官中未显示出组织学破坏。这些结果证明了免疫治疗的安全性，因为转移免疫力能够抑制2周以上，在一些病例中，所测定的模型中的血清HBsAg浓度甚至变得检测不到。另外证明了在转移之前使用HBsAg和HBcAg在体外进行重新刺激的益处，促进了抗-HBcAg免疫应答的存在，这在人类中是至关重要的。

实施例4.使用HBsAg和HBcAg抗原的制剂在体外进行脉冲化处理的非免疫小鼠的异源细胞的转移

为了证明在体外使用HBsAg和HBcAg抗原的混合物进行刺激或脉冲化处理的异源细胞诱导针对这些抗原的强烈的免疫应答，在Balb/c小鼠(HBsAg转基因和非转基因的)中进行了实验。非转基因Balb/c小鼠用作供体。

杀死8只Balb/c小鼠，提取它们的脾。根据实施例3中描述的方法纯化脾细胞。使用抗原的不同制剂和比例，在不同的上清液浓度，在体外刺激总脾细胞或从这些脾细胞获得的特定细胞群体(B细胞、树突细胞和巨噬细胞)。刺激之后，洗涤细胞3次并转移至HBsAg转基因和非转基因小鼠。

所有的经转移的Balb/c小鼠(转基因的和非转基因的)都产生可检测的免疫应答。该应答能够在那些HBsAg转基因组受体小鼠中诱导HBsAg水平的显著下降，在1-20周的时间内是可检测的，在一些情况下是持久性的。通过使用相同制剂进行主动免疫未达到该结果(数据未显示)。

实施例5.使用HBsAg和HBcAg抗原的制剂在体外进行脉冲化处理的非免疫小鼠的同源细胞的转移

为了证明在体外使用HBsAg和HBcAg抗原的混合物进行刺激的同源细胞诱导针对这些抗原的强烈的免疫应答，在Balb/c小鼠(HBsAg转基因和非转基因的)中进行了实验。非转基因Balb/c小鼠用作脾细胞供体。

杀死8只Balb/c小鼠，提取它们的脾。根据实施例3中描述的方法纯化脾细胞。使用抗原的不同制剂和比例，在不同的上清液浓度，在体外刺激总脾细胞或特定脾细胞群体(B细胞、树突细胞和巨噬细胞)。刺激之后，洗涤细胞3次并转移至HBsAg转基因和非转基因小鼠。

所有的经转移的Balb/c小鼠(转基因的和非转基因的)都产生可检测的免疫应答。该应答能够在那些HBsAg转基因组受体小鼠中诱导HBsAg水平的显著下降。血清中的HBsAg浓度的降低在1-20周的时间内是可检测的，在一些情况下是持久性的。通过使用相同制剂进行主动免疫未达到该结果(数据未显示)。

实施例6.使用不同抗原和不同颗粒大小和比例的抗原性混合物研究树突细胞的抗原性刺激

在转基因小鼠中进行的实验证明抗原对细胞的刺激效应与HBsAg上的HBcAg产生的刺激相关，并与HBcAg与HBsAg之间的相互作用的性质相关，后者与混合物中的颗粒大小和不同颗粒大小的比例相关。

如果使用仅包含HBsAg的制剂刺激用作供体的动物，则不产生对于抗原载量的控制。相对于以HBsAg和HBcAg组合制剂刺激的动物而言，这些动物产生较低的应答。不同大小的沉淀物的混合物在不同的抗原呈递细胞类型中产生最强烈的刺激。该结果来自于控制转基因小鼠中的循环HBsAg的能力的测定。

总之，较高的刺激效力变体由下列比例组成：50％-80％的尺寸小于500nm和20％-50％的尺寸大于500nm。研究了该范围，刺激包含B细胞、巨噬细胞和树突细胞的抗原呈递细胞混合物，并转移这些细胞混合物至HBsAg转基因小鼠模型，其中显示出控制HBsAg的能力上的差异(表3)。如可认识到的，变体E和F显示出最佳的刺激范围。

表3.使用经不同处理刺激的细胞转移的转基因小鼠中的血清HBsAg浓度

通过研究细胞表面的激活标志物的表达来表征巨噬细胞、树突细胞和B细胞中的每种处理的刺激能力。对于使用混合物E和F的处理，刺激能力较高。该结果与混合物中涉及的每种细胞群体的较高的抗原同化能力是一致的。

值得着重指出的是：包含溶液中的HBsAg和HBcAg混合物的制剂(非沉淀物制剂，其平均颗粒大小为小于50nm)的制剂B能够产生免疫应答：在转移至转基因小鼠之后，产生血清HBsAg浓度的显著下降。然而，多数的HBsAg浓度的大大降低是由C和D沉淀物混合物产生的：在一些情况下显示出持续的不可检出的水平。相对于混合物E和F，混合物G产生较低的刺激水平和HBsAg浓度下降，这证明了在通过过继转移免疫力方法产生强有力的免疫应答中建立的这些制剂和比例的特异性。

实施例7.慢性乙肝患者中的被动免疫治疗研究

对于该研究，将患有慢性HBV感染的患者分成4组，每组10个患者。第一组以半相和(haploidentical)的供体的外周血单核细胞处理。第二组接受纯化自先前自体供给的细胞(同源细胞)。在这两种情况下，以HBsAg和HBcAg制剂刺激细胞。另外两组接受相同处理，但是重移植的细胞不经过抗原刺激。

可以证明：输入了经刺激的细胞的患者产生免疫应答，在接受未经刺激的细胞的患者中则没有。与此相一致，相对于第3、第4组，并且相对于处理之前获取的数值，在第1和第2组中见到了HBsAg水平和病毒载量的显著下降。

实施例8.使用脉冲化处理的巨噬细胞、B细胞和树突细胞在慢性乙肝患者中进行被动免疫研究

对于该研究，将患有慢性HBV感染的患者分成6组，每组20个患者。第一组以分离自半相和的供体的外周血单核细胞的树突细胞处理。第二组接受纯化自先前自体供给的细胞(同源细胞)。

这两组进一步分为2个亚组，各10个患者，接受经HBsAg和HBcAg制剂刺激的细胞或未经刺激的细胞。另外两组接受相同处理，但是使用B细胞。其余两组以富含巨噬细胞的黏附细胞处理。

输入了经刺激的细胞的患者产生免疫应答，在接受未经刺激的细胞的患者中则没有。与此相一致，在接受脉冲化处理的细胞的组中见到了HBsAg水平和病毒载量的显著下降，证明了使用HBsAg和HBcAg抗原对于不同细胞类型进行的抗原性刺激的有效性。

这种类型的研究在在转基因小鼠模型中是优化的，选择了悬浮液中沉淀的抗原群体(以不同的比例或不以)。最佳刺激变体的获得允许所产生的免疫应答增大。

Claims (26)

1.乙肝病毒(HBV)的表面(HBsAg)和核衣壳(HBcAg)抗原的制剂，其特征在于，其包含所述抗原的悬浮液中的沉淀物。

2.权利要求1的制剂，其中悬浮液中的沉淀物构成大小小于500nm和大于500nm的颗粒的混合物。

3.权利要求2的制剂，其中大小小于500nm和大于500nm的颗粒的比例分别为50％-50％至80％-20％。

4.权利要求1的制剂，其中悬浮液中的沉淀物通过使这些抗原的混合物经历酸沉淀而获得。

5.权利要求4的制剂，其中通过以酸溶液进行透析或渗滤而进行酸沉淀。

6.获得乙肝病毒(HBV)的表面(HBsAg)和核衣壳(HBcAg)抗原的制剂的方法，所述制剂由这些抗原的悬浮液中的沉淀物构成，所述方法的特征在于：a)制备HBsAg和HBcAg抗原的混合物；b)使该混合物经历酸沉淀；和c)根据它们的大小、按照它们对于异源或自体抗原呈递细胞产生最大的体内或体外刺激的方式选择沉淀物。

7.权利要求6的方法，其中经历酸沉淀的混合物中的HBsAg和HBcAg抗原的浓度是0.1-2mg/mL蛋白。

8.权利要求6的方法，其中通过以酸溶液进行透析或渗滤而进行酸沉淀。

9.权利要求8的方法，其中用于透析或渗滤的酸溶液是乙酸，优选为pH 4.0的50mM的乙酸。

10.权利要求8的方法，其中酸沉淀持续10分钟至24小时。

11.权利要求6的方法，其中沉淀物的颗粒的大小按照如下方式选择：使得那些大小小于500nm和大于500nm的颗粒的比例分别为50％-50％至80％-20％。

12.用于被动免疫治疗的细胞刺激方法，其特征在于刺激剂是由乙肝病毒(HBV)的HBsAg和HBcAg抗原的悬浮液中的沉淀物构成的制剂。

13.权利要求12的方法，其中悬浮液中的沉淀物构成大小小于500nm和大于500nm的颗粒的混合物。

14.权利要求12的方法，其中待刺激的细胞群体来自选自下列的个体：未被感染的个体，对HBV无免疫的个体，和慢性乙肝(CHB)患者。

15.权利要求12的方法，其中待刺激的细胞群体选自：外周血单核细胞、树突细胞、B细胞和巨噬细胞。

16.权利要求12的方法，其中通过体外刺激分离自个体的细胞、体内免疫所述个体，或这两种刺激策略的组合来产生细胞的刺激。

17.被动免疫CHB患者的方法，其特征在于：a)使用由乙肝病毒(HBV)的HBsAg和HBcAg抗原的悬浮液中的沉淀物构成的制剂刺激细胞；和b)将经刺激的细胞转移至患有CHB的患者。

18.权利要求17的方法，其中悬浮液中的沉淀物构成大小小于500nm和大于500nm的颗粒的混合物。

19.权利要求17的方法，其中待刺激的细胞群体来自选自下列的个体：未被感染的个体，对HBV无免疫的个体，和慢性乙肝(CHB)患者。

20.权利要求17的方法，其中待刺激的细胞群体选自：外周血单核细胞、树突细胞、B细胞和巨噬细胞。

21.权利要求17的方法，其中通过体外刺激分离自个体的细胞、体内免疫所述个体，或这两种刺激策略的组合来产生细胞的刺激。

22.由乙肝病毒(HBV)的表面(HBsAg)和核衣壳(HBcAg)抗原的悬浮液中的沉淀物构成的制剂用于细胞刺激和同时或不同时主动免疫CHB患者的用途。

23.权利要求22的方法，其中悬浮液中的沉淀物构成大小小于500nm和大于500nm的颗粒的混合物。

24.权利要求22的方法，其中待刺激的细胞群体选自：外周血单核细胞、树突细胞、B细胞和巨噬细胞。

25.权利要求22的方法，其中通过体外刺激分离自个体的细胞、体内免疫所述个体，或这两种刺激策略的组合来产生细胞的刺激。

26.权利要求22的方法，其中待刺激的细胞群体来自选自下列的个体：未被感染的个体，对HBV无免疫的个体，和慢性乙肝(CHB)患者。

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