CN102660623B

CN102660623B - 混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法

Info

Publication number: CN102660623B
Application number: CN201210154214.5A
Authority: CN
Inventors: 李强; 季更生; 谷绪顶; 费娟娟; 唐玉斌
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Priority date: 2012-05-17
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2032-05-17
Also published as: CN102660623A

Abstract

本发明公开一种混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法。本发明涉及利用植物纤维降解菌和油脂生产菌进行混菌发酵直接利用秸秆等天然植物纤维生产乙醇。首先采用响应面等优化方法设计出混菌发酵的培养基，然后利用正交试验、响应面分析法等方法优化得到最佳的混合发酵温度、菌种混合比例和菌种混合时间等发酵条件。根据优化的发酵条件，利用植物纤维作为碳源，纤维素酶产生菌降解纤维素成为可发酵的糖，在培养体系中加入产油脂微生物进行混合发酵。油脂产生菌利用植物纤维不断酶解产生的糖作为碳源，发酵生产油脂，微生物油脂经过甲酯化反应得到生物柴油。

Description

混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法

技术领域

本发明属于生物能源和生物催化的技术领域，具体涉及生产生物柴油的微生物混合发酵法。

背景技术

生物柴油(Biodiesel)是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂、餐饮垃圾油等为原料油通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。生物柴油是生物质能的一种，它是生物质利用热裂解等技术得到的一种长链脂肪酸的单烷基酯。生物柴油是含氧量极高的复杂有机成分的混合物，这些混合物主要是一些分子量大的有机物，几乎包括所有种类的含氧有机物，如：醚、酯、醛、酮、酚、有机酸、醇等。生物柴油具有如下优良特性：(1)具有优良的环保特性：生物柴油和化石柴油相比含硫量低，使用后可使二氧化硫和硫化物排放大大减少。权威数据显示，二氧化硫和硫化物的排放量可降低约30％。生物柴油不含对环境造成污染的芳香族化合物，燃烧尾气对人体的损害低于化石柴油，同时具有良好的生物降解特性。和化石柴油相比，柴油车尾气中有毒有机物排放量仅为1/10，颗粒物为20％，二氧化碳和一氧化碳的排放量仅为10％，排放尾气指标可达到欧洲Ⅱ号和Ⅲ号排放标准。(2)低温启动性能：和化石柴油相比，生物柴油具有良好的发动机低温启动性能，冷滤点达到-20℃。(3)生物柴油的润滑性能比柴油好：可以降低发动机供油系统和缸套的摩擦损失，增加发动机的使用寿命，从而间接降低发动机的成本。(4)具有良好的安全性能：生物柴油的闪点高于化石柴油，它不属于危险燃料，在运输、储存、使用等方面的优点明显。(5)具有优良的燃烧性能：生物柴油的十六烷值比柴油高，因此燃料在使用时具有更好的燃烧抗暴性能，因此可以采用更高压缩比的发动机以提高其热效率。虽然生物柴油的热值比柴油低，但由于生物柴油中所含的氧元素能促进燃料的燃烧，可以提高发动机的热效率，这对功率的损失会有一定的弥补作用。(6)具有可再生性：生物柴油是一种可再生能源，其资源不会像石油、煤炭那样会枯竭。(7)具有经济性：使用生物柴油的系统投资少，原用柴油的引擎、加油设备、储存设备和保养设备无需改动。(8)可调和性：生物柴油可按一定的比例与化石柴油配合使用，可降低油耗，提高动力，降低尾气污染。(9)可降解性：生物柴油具有良好的生物降解性，在环境中容易被微生物分解利用。

生物柴油的优良性能使得采用生物柴油的发动机废气排放指标不仅满足目前的欧洲II号标准，甚至满足随后即将在欧洲颁布实施的更加严格的欧洲Ⅲ号排放标准。而且由于生物柴油燃烧时排放的二氧化碳远低于该植物生长过程中所吸收的二氧化碳，从而改善由于二氧化碳的排放而导致的全球变暖这一有害于人类的重大环境问题。因而生物柴油是一种真正的绿色柴油。

随着世界工业的迅速发展，石油等化石资源的逐渐枯竭，利用可再生资源生产生物能源的研究越来越受到国内外研究者的关注。纤维素是地球上最丰富的可再生资源，具有价廉、可降解和不污染生态环境等优点，因此纤维素的开发与利用对解决人类面临的资源和能源危机具有重要意义。纤维素材料可以通过制备成生物柴油的方式转化成燃料。从生物油脂的元素组成来看，主要是C、H、O元素，与石油基柴油的组成类似，因此生物柴油的开发利用备受关注。

但是，纤维素是以葡萄糖基通过糖苷键连接起来的、具有线性结构的高分子化合物，其结构复杂，内部存在大量的晶区、非晶区结构和氢键，造成了纤维素资源化利用的障碍。纤维素酶酶解纤维素被认为最有效的破坏纤维素的复杂结构，高效利用纤维素材料的方法之一。纤维素酶产生菌能够分泌纤维素酶降解纤维素成为糖，这些糖可以被微生物利用发酵成为生物柴油、生物乙醇等能源产品，有助于解决能源危机。

发明内容：

解决的技术问题：本发明针对纤维素酶产生菌虽然能够高效降解纤维素材料，但是不能用于生产生物柴油等产品；而微生物油脂高产菌不能利用纤维素的技术难题，提供了一种纤维素降解菌和产油微生物混合发酵的方式生产生物柴油的方法。

技术方案：本发明中，构建立了纤维素降解菌和产油微生物混合发酵的模式。利用纤维素材料作为碳源，纤维素酶降解菌在培养体系中分泌纤维素酶降解纤维素成为可发酵的糖，然后在培养体系中加入高产油脂微生物进行混合培养。产油脂微生物利用纤维素酶不断水解产生的糖作为碳源，得出最佳的产油发酵条件，经过发酵制备微生物油脂。然后，利用甲酯化的方法将微生物油脂制备成生物柴油。

本发明涉及的一种纤维素降解菌和产油微生物混合发酵的模式，按照如下步骤进行：

（1）采用单因素实验、正交试验、响应面分析法等方法筛选并且设计出混合发酵的培养基，并且得到最佳的培养条件；

（2）根据前面的发酵优化条件，利用纤维素材料作为碳源，纤维素降解菌降解纤维素成为可发酵的糖，然后在培养体系中加入高产油脂微生物进行混合培养。产油微生物利用纤维素酶不断水解产生的糖作为碳源，得出最佳的产油发酵条件；

（3）将步骤（2）得到的培养物用纱网（或纱布等）进行过滤除去纤维素降解微生物和发酵液中的残渣，得到只含有产油微生物等产油微生物的培养物，再过滤得到产油微生物细胞。得到的产油微生物用高压匀质机将细胞破碎，加入萃取剂，浸提，收集上层有机溶剂层，蒸发回收溶剂，剩余的部分为微生物油脂；

（4）利用甲酯化的方法将微生物油脂制备成生物柴油。

具体步骤为：

混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法，包括如下步骤：

（1）制备微生物种子液：将纤维素降解菌和油脂产生菌分别在PDA培养基中25-30℃培养3-5d后制得；

（2）将油脂产生菌和纤维素降解菌按照细胞重量比2-3∶1添加到混合发酵培养基中，28℃、180r/min摇床培养5-14d；其中所述混合发酵培养基为：

培养基Ⅰ：10-50g纤维素材料；9g Na₂HPO₄·12H₂O；1.5g KH₂PO₄；1.2mg FeNH₄-Citrate；0.34g（NH₄）₂SO₄；0.15g蛋白胨；0.15g Yeast extract；0.3g CaCl₂，0.3g MgSO₄，0.005gFeSO₄·7H₂O；0.0016g MnSO₄·H₂O；0.0014g ZnSO₄·H₂O；0.002g CoCl₂；1000mL H₂O，pH调节为弱酸性pH6.0-6.8；或，

培养基Ⅱ：10-50g纤维素材料；2g KH₂PO₄；1.4g（NH₄）₂SO₄；0.3g MgSO₄；0.3g CaCl₂；0.5g蛋白胨；0.005g FeSO₄·7H₂O；0.0016g MnSO₄·H₂O，0.0014g ZnSO₄·H₂O；0.002g CoCl₂，1000mLH₂O；pH调节为弱酸性pH6.0-6.8；或，

改造的Mandel培养基：10-50g纤维素材料；1g蛋白胨，2.0g NaNO₃，1.5g K₂HPO₄，0.3g CaCl₂，0.3g MgSO₄，0.005g FeSO₄·7H₂O，0.0016g MnSO₄·H₂O，0.0014g ZnSO₄·H₂O，0.5g CoCl₂，1.5g Yeast extract，H₂O 1000mL，pH7.0；或，

改造的察氏培养基：10g纤维素材料；3g NaNO₃；1gK₂HPO₄；0.5g MgSO₄·7H₂O；0.5gKCl；0.005g FeSO₄·7H₂O，0.0016g MnSO₄·H₂O，0.0014g ZnSO₄·H₂O，0.002g CoCl₂；蒸馏水1000mL，pH调节为弱酸性pH6.0-6.8；

（3）将所得到的培养物过滤除去纤维素降解菌和发酵液中的残渣，得到含有产油微生物的培养液，再过滤得到产油微生物细胞；

（4）产油微生物细胞用高压匀质机将细胞破碎，加入萃取剂，浸提，收集上层有机溶剂层，蒸发回收溶剂，剩余的部分为微生物油脂；

（5）微生物油脂经过甲酯化反应得到生物柴油。

上述纤维素材料为微晶纤维素、秸秆、麦麸或纸。

上述纤维素降解菌为里氏木霉、绿色木霉、康宁木霉、瑞士木霉或黑曲霉；油脂产生菌为红球菌或粘红酵母。

上述高压匀质机的压力为60-80MPa，萃取溶剂与破碎细胞的体积比为2-3∶1，萃取剂为正己烷，浸提温度为40-50℃，浸提2-3次，每次30-40min。

上述甲酯化方法为离子液体甲酯化：将相同摩尔数的微生物油脂、甲醇和[NMP][CH₃SO₃]加入容器中，搅拌4-12h，倒入分液漏斗静置分层成为两层，除去下层得到上层生物柴油。

有益效果：

1、绿色环保的生物柴油生产技术

石油生产柴油需要高温高压，同时其废水、废气造成了环境污染。而微生物转化能在水相、室温和中性pH的环境下进行，无需高压和极端条件，节省了能源，减少了化学合成工艺对环境的污染，是一项相对“绿色”的技术，符合可持续发展的需要。

2、以可再生原料生物合成生物柴油

传统的柴油以石油为原料；而本研究采用可再生的秸秆等富含纤维素的废弃物为原料，原料丰富，再生循环迅速，有助于解决能源短缺问题。总之，本发明针对石油资源短缺和价格飞涨，开发石油替代品，利用可再生资源通过微生物发酵生产生物柴油，实现了秸秆等纤维素废弃物的高值转化。

3、直接高效利用纤维素材料制备生物油脂

本研究直接利用纤维素材料，不需要外加糖类就可以制备生物油脂。纤维素酶产生菌将纤维素水解成糖，混合培养的产油微生物直接利用这些还原糖发酵制备生物油脂，还原糖的消耗解除了糖积累对于纤维素降解的反馈抑制，提高了纤维素的利用效率。

附图说明

图1为红球菌油脂制备的生物柴油气相色谱图。

具体实施方式

实施例1

混合发酵的培养基的确定：

根据纤维素分解微生物和产油微生物的培养特点，利用单因素实验、正交试验、响应面分析等方法将步骤（1）所述的培养基成分进行优化，筛选并且设计出混合发酵培养基如下：

培养基Ⅰ：10g纤维素；9g Na₂HPO₄·12H₂O；1.5g KH₂PO₄；1.2mg FeNH₄-Citrate；0.34g（NH₄）₂SO₄；0.15g Peptone【蛋白胨】；0.15g Yeast extract；0.3g CaCl₂，0.3g MgSO₄，0.005gFeSO₄·7H₂O；0.0016g MnSO₄·H₂O；0.0014g ZnSO₄·H₂O；0.002g CoCl₂；1000mL H₂O，pH调节为弱酸性pH6.0-6.8。

培养基Ⅱ：10g纤维素；2g KH₂PO₄；1.4g（NH₄）₂SO₄；0.3g MgSO₄；0.3g CaCl₂；0.5g蛋白胨；0.005g FeSO₄·7H₂O；0.0016g MnSO₄·H₂O，0.0014g ZnSO₄·H₂O；0.002g CoCl₂，1000mLH₂O；pH调节为弱酸性pH6.0-6.8，121℃灭菌20min。

改造的Mandel培养基：10g纤维素；1gPeptone【蛋白胨】，2.0g NaNO₃，1.5g K₂HPO₄，0.3g CaCl₂，0.3g MgSO₄，0.005g FeSO₄·7H₂O，0.0016g MnSO₄·H₂O，0.0014g ZnSO₄·H₂O，0.5g CoCl₂，1.5gYeast extract，H₂O 1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min。

改造的察氏培养基：10g纤维素；3g NaNO₃；1gK₂HPO₄；0.5g MgSO₄·7H₂O；0.5gKCl；0.005g FeSO₄·7H₂O，0.0016g MnSO₄·H₂O，0.0014g ZnSO₄·H₂O，0.002g CoCl₂；蒸馏水1000mL，pH调节为弱酸性pH6.0-6.8。

混合发酵模式的建立：

(1)菌种的活化

制备微生物种子液的方法如下：将纤维素降解菌（里氏木霉、绿色木霉、康宁木霉、瑞士木霉或黑曲霉）和油脂产生菌（红球菌或粘红酵母）分别在PDA培养基中25-30℃培养3-5d后制得。

(2)培养模式

活化完毕的纤维素降解菌菌液按照5％wt的比例接入培养基，以活化的油脂产生菌推迟接入0(同时接入)、1、2、3、4、5d的组合形式接入混合培养基，30℃、180r/min摇床培养。从第二天开始每天取样，在5000r/min、4℃条件下离心10min取上清液（粗酶液）测定滤纸酶活力(FPA)和β-葡萄糖苷酶活力(β-GA)，同时测定3组平行样，取平均值。

（3）产生物柴油方法

活化后的产油微生物，与产酶菌液以不同的推迟接种时间(因素A)、不同的初始pH(因素B)、不同的培养温度(因素C)混合，做三因素四水平的正交试验。从2d开始每天取样，测定产油微生物的生物量和微生物油脂的产量。

混合发酵生产生物油脂：

确定了混合培养的最佳条件，纤维素酶产生菌和产油微生物培养的pH6.5、温度30℃，在相同培养条件下可以较好的混合发酵。

混合发酵培养在5L发酵罐中，发酵培养基3.5L，121℃灭菌25min，冷却至30℃时按2％wt的接种量进行无菌接种。通过温度电极和pH电极感应，自动调节发酵液的温度和pH，使其保持在合适的参数，培养温度30℃发酵培养5-8d，培养物用纱网（或8层纱布）过滤除去大部分丝状真菌（纤维素降解菌）和发酵液中的残渣，得到只含有产油微生物的培养液，再滤纸过滤或离心得到产油微生物细胞。得到的产油微生物细胞用高压匀质机将细胞破碎，加入萃取剂正己烷，浸提，收集上层有机溶剂层，蒸发回收溶剂，剩余的部分为微生物油脂，利用甲酯化的方法将微生物油脂制备成生物柴油。其中，高压匀质机的压力为60-80MPa，萃取剂与破碎细胞的体积比为2-3∶1，萃取溶剂为正己烷，浸提温度为40-50℃，浸提2-3次，每次30-40min。

微生物油脂制备生物柴油：

（1）BF3甲酯化：大量样品制备：取50mL的菌液，离心取沉淀，用10mL提取剂（氯仿∶甲醇体积比为2∶1）抽提沉淀过夜。离心除去沉淀，氮吹（氮气保护）浓缩上清液至2mL，加内标二十烷酸(2mL，1mg/mL)。加入5mL皂化试剂为甲醇水溶液（甲醇∶水体积比为4∶1，含6％wtNaOH）70℃皂化4h。加入5mL的甲酯化剂（BF₃∶甲醇质量比为1∶4）70℃甲酯化4h。用10mL正己烷萃取浓缩到2mL。得到的脂肪酸甲酯（生物柴油）直接用GC-MS和NaOH滴定的方法检测确定含量，计算产率。

（2）离子液体甲酯化：采用离子液体[NMP][CH₃SO₃]作为催化剂催化合成脂肪酸甲酯（生物柴油），将相同摩尔数的微生物油脂、甲醇和[NMP][CH₃SO₃]加入圆底烧瓶，二十烷酸作为内标加入各个样品当中，配合磁力搅拌4-12h，加入分液漏斗静置分层成为两层，除去下层得到上层即是脂肪酸甲酯（生物柴油），得到的脂肪酸甲酯直接GC-MS检测确定含量，得到的脂肪酸采用NaOH滴定的方法确定浓度，计算产率。

（3）脂肪酸甲酯成分分析：用正己烷溶解得到的脂肪酸甲酯，离心后取上清夜，用气相色谱-质谱连用仪分析油脂的含量和组成。30m HP-5气相色谱柱(30×0.32×0.25)。检测器为氢火焰离子检测器(FID)。进样口温度225℃，检测器温度250℃，分流比10∶1，线速30cm/min，衰减16。程序升温条件为：柱温100℃，维持5min，15min升至250℃，再以4℃/min升至250℃，维持10min。

实施例2

采用产油微生物浑浊红球菌（Rhodococcus opacus ACCC41043）与纤维素降解菌里氏木霉（Trichoderma reesei ATCC 26921）作为混合菌种进行混合发酵。混合发酵培养基采用培养基Ⅰ：15g纤维素；9g Na₂HPO₄·12H₂O；1.5g KH₂PO₄；1.2mg FeNH₄-Citrate；0.34g（NH₄）₂SO₄；0.15g Peptone；0.15g Yeast extract；0.3g CaCl₂，0.3g MgSO₄，0.005g FeSO₄·7H₂O；0.0016gMnSO₄·H₂O；0.0014g ZnSO₄·H₂O；0.002g CoCl₂；1000mL H₂O，pH调节到pH6.8。发酵罐为5L发酵罐，培养温度为28℃，里氏木霉按照2％v/v接种量接种，培养12h后浑浊红球菌按照2％v/v接种量接种进入发酵罐进行混菌发酵。

脂肪酸的提取：发酵5d，取2L的菌液，离心取沉淀，用500mL提取剂（体积比：氯仿∶甲醇=2∶1）抽提沉淀过夜。离心除去沉淀，用氮吹仪氮吹浓缩，加入500mL皂化试剂为甲醇水溶液（体积比：甲醇∶水=4∶1，含6％wtNaOH）60℃皂化1h。

生物柴油的制备：用离子液体N-methyl-2-pyrrolidonium methyl sulfonate([NMP][CH₃SO₃])作为催化剂进行甲酯化，在70℃条件下，甲醇∶菌产脂肪酸∶离子液体（[NMP][CH₃SO₃]）按体积比=1∶1∶0.3，反应6h将皂化的脂肪酸甲酯化成为生物柴油。用气质联用仪检测生物柴油的成分和含量（见图1）。结果表明生产的生物柴油主要成分为C18和C16的脂肪酸甲酯占总量的81.11％，其余18.89％为十七烷酸和二十烷酸，是性质较优良的生物柴油。

表1.产生的生物柴油主要成分

	十六烷酸	十六烯酸	十八烷酸	十八烯酸
					百分比％	23.26	18.12	16.72	23.01

实施例3

采用产油微生物浑浊红球菌（Rhodococcus opacus ACCC41043）与纤维素降解菌黑曲霉(Aspergillus niger DSMZ 821)作为混合菌种进行混合发酵。培养基Ⅱ：18g甘蔗渣；2g KH₂PO₄；1.4g（NH₄）₂SO₄；0.3g MgSO₄；0.3g CaCl₂；0.5g Peptone；0.005g FeSO₄·7H₂O；0.0016gMnSO₄·H₂O，0.0014g ZnSO₄·H₂O；0.002g CoCl₂，1000mL H₂O；pH调节为pH 6.8；发酵容器为250mL锥形瓶，培养温度为28℃，黑曲霉按照2％v/v接种量接种，培养12h后浑浊红球菌按照2％v/v接种量接种进入进行混菌发酵。

脂肪酸的提取：发酵5d，取50mL的菌液，离心取沉淀，用500mL提取剂（体积比：氯仿∶甲醇=2∶1）抽提沉淀过夜。离心除去沉淀，用氮吹仪氮吹浓缩，加入500mL皂化试剂为甲醇水溶液（体积比：甲醇∶水=4∶1，含6％wtNaOH）60℃皂化1h。

生物柴油的制备：用离子液体N-methyl-2-pyrrolidonium methyl sulfonate([NMP][CH₃SO₃])作为催化剂进行甲酯化，在70℃条件下，甲醇∶菌产脂肪酸∶离子液体（[NMP][CH₃SO₃]）按体积比=1∶1∶0.3，反应6h将皂化的脂肪酸甲酯化成为生物柴油。用气质联用仪检测生物柴油的成分和含量（见图1）。结果表明生产的生物柴油主要成分为C18和C16的脂肪酸甲酯占总量的84.29％，其余15.89％为十七烷酸和二十烷酸，是性质较优良的生物柴油。

表2.产生的生物柴油主要成分

	十六烷酸	十六烯酸	十八烷酸	十八烯酸
					百分比％	24.80	19.31	15.25	24.93

Claims

1.混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）制备微生物种子液：将纤维素降解菌和油脂产生菌分别在PDA培养基中25-30℃培养3-5d后制得；所述纤维素降解菌和油脂产生菌组合为：浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）ACCC 41043与里氏木霉（Trichoderma reesei）ATCC 26921，或浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）ACCC 41043与黑曲霉(Aspergillus niger ) DSMZ 821；

（2）将油脂产生菌和纤维素降解菌按照细胞重量比2-3:1添加到混合发酵培养基中，28℃、180r/min摇床培养5-14d；其中所述混合发酵培养基为：

培养基Ⅰ：10-50g 纤维素材料；9g Na₂HPO₄·12H₂O； 1.5g KH₂PO₄； 1.2mg FeNH₄-Citrate；0.34g（NH₄）₂SO₄；0.15g Peptone；0.15g Yeast extract；0.3 g CaCl₂，0.3g MgSO₄，0.005g FeSO₄·7H₂O；0.0016g MnSO₄·H₂O；0.0014g ZnSO₄·H₂O；0.002g CoCl₂；1000mL H₂O，pH调节为弱酸性pH6.0-6.8；或，

培养基Ⅱ：10-50g 纤维素材料；2g KH₂PO₄；1.4g（NH₄）₂SO₄；0.3g MgSO₄；0.3g CaCl₂；0.5g蛋白胨；0.005g FeSO₄·7H₂O；0.0016g MnSO₄·H₂O，0.0014g ZnSO₄·H₂O；0.002g CoCl₂，1000mL H₂O； pH调节为弱酸性pH6.0-6.8；或，

改造的Mandel培养基： 10-50g 纤维素材料； 1g Peptone， 2.0g NaNO₃，1.5g K₂HPO₄，0.3 g CaCl₂，0.3g MgSO₄，0.005g FeSO₄·7H₂O，0.0016g MnSO₄·H₂O，0.0014g ZnSO₄·H₂O，0.5g CoCl₂，1.5g Yeast extract，H₂O 1000mL，pH7.0；或，

改造的察氏培养基：10g 纤维素材料； 3g NaNO₃； 1g K₂HPO₄； 0.5g MgSO₄·7H₂O； 0.5g KCl；0.005g FeSO₄·7H₂O，0.0016g MnSO₄·H₂O，0.0014g ZnSO₄·H₂O，0.002g CoCl₂；蒸馏水　1000mL，pH调节为弱酸性pH6.0-6.8；

所述纤维素材料为微晶纤维素、秸秆、麦麸或纸；

（3）将所得到的培养物过滤除去纤维素降解菌和发酵液中的残渣，得到含有油脂产生菌的培养液，再过滤得到油脂产生菌细胞；

（4）油脂产生菌细胞用高压匀质机将细胞破碎，加入萃取剂，浸提，收集上层有机溶剂层，蒸发回收溶剂，剩余的部分为微生物油脂；

（5）微生物油脂经过甲酯化反应得到生物柴油。

2.根据权利要求1所述的混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法，其特征在于所述高压匀质机的压力为60-80MPa，萃取剂与破碎细胞的体积比为2-3:1，萃取剂为正己烷，浸提温度为40-50℃，浸提2-3次，每次30-40min。

3.根据权利要求1所述的混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法，其特征在于所述甲酯化方法为离子液体甲酯化：将相同摩尔数的微生物油脂、甲醇和 [NMP][CH₃SO₃]加入容器中，搅拌4-12h，倒入分液漏斗静置分层成为两层，除去下层得到上层生物柴油。