CN102660607B - 一种β-1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种β-1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法，属于生物工程技术领域。本发明方法以热凝胶为原料，通过β-葡聚糖酶先酸解再酶解，或先酶解再酸解处理后得到寡糖溶液，再用超滤膜进行截留分离和浓缩，获得聚合度为4～15DP的β-1,3葡聚寡糖，可应用于植物抗病疫苗。本发明由于采用温和的酶解和酸解混合法来进行热凝胶的寡聚化，使得酶解反应便于控制，同时由于采用较低温度的水解条件使得在不破坏β-1,3-葡聚寡糖的结构的条件下，能耗得以节约；且由于采用酸解与酶解和膜分离浓缩技术，使得整个生产工艺不产生环境污染，低能耗，低成本。本发明方法具有反应温和，便于控制反应进程，以及能耗低，对环境友好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种β-1,3-葡聚寡糖的制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
寡糖是指聚合度低于20的低聚糖。传统的寡糖制备方法主要是采用酸水解的方法来进行，但是由于酸水解程度极其难于控制，大部分水解成单糖。而对于热凝胶，目前对其进行水解获得聚合度在4-15DP之间的寡糖的方法还没有报道。这主要是由于热凝胶是聚合度为500～800左右的多糖，其螺旋形的刚性三维立体结构使得热凝胶不溶于水，但是溶解于碱性溶液和二甲基亚砜（DMSO）等。虽有报道热凝胶在DMSO溶液中用酸处理的方法来获得寡糖，但是其聚合度主要在7DP以下，同时其需要用丙酮来洗涤水解产物以除去DMSO，而且有机溶剂的使用不利于环保。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备β-1,3葡聚寡糖的方法。该方法具有反应温和，便于控制反应进程，以及能耗低，对环境友好等优点。
本发明的技术方案：一种β-1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法，以热凝胶为原料，通过β-葡聚糖酶对热凝胶进行先酸解再酶解，或先酶解再酸解处理后得到寡糖溶液，再用超滤膜进行截留分离和浓缩，获得聚合度为4～15DP的β-1,3葡聚寡糖，其结构式如下式所示：
β-1,3葡聚寡糖的结构式，n=2～13；
制备步骤为：
（1）先酸解再酶解，或先酶解再酸解，得到寡糖溶液；
所述的先酸解再酶解方法，其反应体系是：热凝胶溶解于0.1M 三氟乙酸溶液中，1～2公斤的热凝胶溶解于8L该三氟乙酸溶液，60℃下水解处理8-24小时，再用氨水调整pH 6.0；然后按照热凝胶︰酶=（10～20）︰（1～2）的质量比例加入β-葡聚糖酶，37℃下水解5-24小时；
所述的先酶解再酸解方法，其反应体系是：热凝胶溶于0.01M Ba(OH)2溶液中，1～2公斤的热凝胶溶解于8L该Ba(OH)2溶液，搅拌直至热凝胶完全溶解，用硫酸调整pH 7.0，按照热凝胶︰酶=（10～20）︰（1～2）的质量比例加入β-葡聚糖酶粉，混合均匀；溶液用无水乙酸调至pH 6.0，在37℃条件下水解2-24小时；然后再用0.1M三氟乙酸调整溶液 pH 2～5，60℃下水解1-16小时；
（2）将所得寡糖溶液用超滤膜进行分离和浓缩：选用截留分子量为15000Da的中空卷式膜来进行分离，操作压为0.5MPa，按照1︰5的体积比来进行超滤，用pH 6.0、5倍于所得寡糖溶液体积的水溶液推动寡糖溶液过膜，超滤时间为25分钟；截留液继续用于酶解或酸解；对透过液的浓缩则采用截留分子量为1000Da的截留膜来进行，操作压为0.5MPa，超滤时间为25分钟；截留的浓缩液经过干燥后即得聚合度为4-15的β-1,3葡聚寡糖产品。
β-1,3葡聚寡糖的制备工艺。
采用先酶解再酸解，或先酸解再酶解的方法来制备β-葡聚寡糖。
路线一：
热凝胶溶于0.1M 三氟乙酸溶液中，60℃水解8-24小时，氨水调pH 6.0，加β-葡聚糖酶，37℃水解5-24小时。将水解液用超滤膜进行分离浓缩，即可获得产品。
路线二：
热凝胶溶于Ba(OH)2溶液中，硫酸调pH 7.0，加β-葡聚糖酶，用无水乙酸调pH 6.0，37℃水解2-24小时，用三氟乙酸调pH 2～5，60℃水解1-16小时。将水解液用超滤膜进行分离浓缩，即可获得产品。
β-1,3葡聚寡糖的聚合度监控分析
取10μL水解液，用HPLC-ELSD 系统进行分析，柱子采用Click mail柱，流动相为含有0.5mM KH2PO4 的80%乙腈作为流动相，流速为1mL/min。确定4-15DP聚合度的β-1,3葡聚寡糖所对应色谱峰，并根据色谱峰面积计算水解靶标产物的得率。
热凝胶产品由上海福乐贸易有限公司提供，热凝胶水解使用的β-葡聚糖酶由宁夏夏盛实业公司提供。
本发明的有益效果：其一，由于采用温和的酶解和酸解混合法来进行热凝胶的寡聚化，使得酶解反应便于控制，同时由于采用较低温度的水解条件使得在不破坏β-1,3-葡聚寡糖的结构的条件下，能耗得以节约；其二，由于采用酸解与酶解和膜分离浓缩技术，使得整个生产工艺不产生环境污染，低能耗，低成本。
附图说明
图1β-1,3葡聚寡糖的制备流程示意图。
具体实施方式
本发明由以下的实施例进一步说明。这些实施例只是为了说明目的，而不是用来限制本发明的范围。
实施例1：热凝胶先酸解再酶解
取10～20公斤的热凝胶溶解于80L、0.1M 三氟乙酸溶液中，60℃下水解处理8-24小时，加入氨水调整pH 6.0，然后按照热凝胶︰酶=（10～20）︰（1～2）的重量比例加入β-葡聚糖酶粉，37℃下水解5-24小时。
实施例2：热凝胶先酶解再酸解
取10～20公斤的热凝胶置于100℃、80L的0.01M 的Ba(OH)2溶液中，并进行搅拌直至热凝胶完全溶解后，用硫酸调整pH 7.0后加入1～2公斤β-葡聚糖酶粉，混合均匀。溶液用无水乙酸调至pH 6.0，在37℃条件下水解2-24小时。然后再用三氟乙酸（0.1M）调整溶液 pH 2～5，60℃下水解1-16小时。
实施例3：β-1,3葡聚寡糖的提取
选用截留分子量为15000Da的中空卷式膜分离方法来进行分离，操作压为0.5MPa，按照1︰5的体积比来进行超滤，用pH6.0、5倍于实施例1或实施例2所得的水解后寡糖溶液体积的水溶液推动反应混合液过膜，超滤时间为25分钟。截留液继续用于酶解或酸解。对透过液的浓缩则采用截留分子量为1000Da的截留膜来进行，操作压为0.5MPa，超滤时间为25分钟。截留的浓缩液经过干燥后即为聚合度为4-15的β-1,3葡聚寡糖产品，产品得率为70%。
实施例4：β-1,3葡聚寡糖植物抗病疫苗在农作物抗真菌病害中的应用
将β-1,3葡聚寡糖（聚合度在4-15）溶解于水，调整浓度为1‰-10‰，在农作物早苗出土3周龄时，开始用喷雾器喷洒。以后每隔40天喷洒一次，结实后停止喷洒。根据参照对比，β-1,3葡聚寡糖对小麦赤霉病防效达60％，棉花黄萎病防效达80％，大豆花叶病防效达71％，对辣椒病毒病防效达75％，番茄晚疫病防效达70％，白菜软腐病防效达85％，苹果黑星病防效达57％，木瓜花叶病防效达96％。
Claims (1)
1.一种β-1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法，其特征在于以热凝胶为原料，通过β-葡聚糖酶对热凝胶进行先酸解再酶解，或先酶解再酸解处理后得到寡糖溶液，再用超滤膜进行截留分离和浓缩，获得聚合度为4～15的β-1,3葡聚寡糖，其结构式如下式所示：
β-1,3葡聚寡糖的结构式，n=2～13；
制备步骤为：
（1）先酸解再酶解，或先酶解再酸解，得到寡糖溶液；
所述的先酸解再酶解方法，其反应体系是：热凝胶溶解于0.1M三氟乙酸溶液中，1～2公斤的热凝胶溶解于8L该三氟乙酸溶液，60℃下水解处理8-24小时，再用氨水调整pH6.0；然后按照热凝胶 : 酶=（10～20） :（1～2）的质量比例加入β-葡聚糖酶，37℃下水解5-24小时；
所述的先酶解再酸解方法，其反应体系是：热凝胶溶于0.01M Ba(OH)2溶液中，1～2公斤的热凝胶溶解于8L该Ba(OH)2溶液，搅拌直至热凝胶完全溶解，用硫酸调整pH7.0，按照热凝胶 : 酶=（10～20） :（1～2）的质量比例加入β-葡聚糖酶粉，混合均匀；溶液用无水乙酸调至pH6.0，在37℃条件下水解2-24小时；然后再用0.1M三氟乙酸调整溶液pH2～5，60℃下水解1-16小时；
（2）将所得寡糖溶液用超滤膜进行分离和浓缩：选用截留分子量为15000Da的中空卷式膜来进行分离，操作压为0.5MPa，按照1 : 5的体积比来进行超滤，用pH6.0、5倍于所得寡糖溶液体积的水溶液推动寡糖溶液过膜，超滤时间为25分钟；截留液继续用于酶解或酸解；对透过液的浓缩则采用截留分子量为1000Da的截留膜来进行，操作压为0.5MPa，超滤时间为25分钟；截留的浓缩液经过干燥后即得聚合度为4-15的β-1,3葡聚寡糖产品。
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