CN102657599A

CN102657599A - 一种用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法

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Publication number: CN102657599A
Application number: CN2012101641827A
Authority: CN
Inventors: 田维明; 闫宏吉; 李钰
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2032-05-24
Also published as: CN102657599B

Abstract

一种用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法，涉及一种可注射生物活性水凝胶材料的制备方法。本发明提供一种可注射生物活性水凝胶材料的制备方法，为肿瘤治疗的研究提供新策略。方法：一、配制透明质酸溶液，加入高碘酸钠和乙二醇，摇床氧化，加入无水乙醇析出沉淀，为氧化的透明质酸；二、向氧化的透明质酸中加水，透析，冻干，酒精消毒，配制氧化的透明质酸溶液；三、配制ADH溶液，过滤后与氧化的透明质酸溶液混合，加入抗Cripto单克隆抗体和活性多肽，混匀后即得水凝胶材料。本发明制备的水凝胶材料具有高的含水量、疏松多孔的结构，方便营养物质的摄入和代谢废物的排除以及气体交换，力学性能可控。用于肿瘤治疗领域。

Description

一种用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种可注射生物活性水凝胶材料的制备方法。

背景技术

目前解释肿瘤发生的机制主要集中在遗传物质改变，氧化应激，以及表观遗传学机制方面。然而，越来越多的人们认识到，肿瘤的发生是一种系统性疾病，即肿瘤系统生物学，除以上机制外，肿瘤的异常生长受到肿瘤细胞间及细胞与细胞外基质间的相互作用。大量的研究结果表明，肿瘤细胞与胚胎干细胞具有相同的多潜能性表型和可塑性，胚胎微环境能逆转肿瘤细胞的恶性表型。肿瘤细胞中高表达在正常组织细胞中不表达的糖基磷酯酰肌醇连接膜蛋白Cripto I，作为形态发生蛋白Nodal的受体，对肿瘤细胞的异常增殖起关键作用。同时，Cripto I，作为Activin的受体，高表达Cripto I能功能封闭Activin的抑癌活性。来源于IV胶原的α3链的185-203位氨基酸组成的19肽(CNYYSNSYSWLASLNPER)，具有抑制肿瘤新生血管生成和抑制肿瘤细胞增殖的双重活性多肽。细胞外基质的力学性能和肿瘤的发生及恶性演进有关。

目前，肿瘤的临床药物化疗，放疗和手术，出现药物治疗敏感性差，毒副作用大，创伤大易复发等缺点，因此研究新的肿瘤治疗策略十分迫切。

发明内容

本发明提供一种用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法，为肿瘤治疗的研究提供新策略。

本发明用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法，按以下步骤进行：一、配制10mL质量浓度为2.5％的透明质酸溶液，静置过夜，然后加入0.25g高碘酸钠，避光、4℃摇床上氧化6h，再加入200μL乙二醇并于摇床上氧化2h，然后加入等体积的无水乙醇，取析出沉淀，即为氧化的透明质酸；二、向氧化的透明质酸中加入等体积的水进行溶解，然后装入40KD的透析袋中，在4℃下透析48～72h，然后用冻干机冻干，再用体积浓度为75％的酒精进行消毒，晾干后配制成质量浓度为8％的氧化的透明质酸溶液；三、配制质量浓度为8％的ADH溶液，用0.2μm的滤膜过滤除菌，然后取1mL过滤后的ADH溶液与1mL质量浓度为8％的氧化的透明质酸溶液混合，再加入1～10mg的抗Cripto单克隆抗体和1～10mg的活性多肽，混匀后即得到可注射生物活性水凝胶材料。

本发明中用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料可用于逆转肿瘤的恶性表型。通过将可注射生物活性水凝胶材料注射到肿瘤组织中，在局部形成一个逆转肿瘤的微环境，将肿瘤组织逆转成为表型正常的良性组织。不会对正常组织产生不良的影响，为肿瘤的治疗提供新方法。

本发明中可注射生物活性水凝胶材料，作为组织工程框架材料使用，是通过共价键、氢键或范德华力将可溶性单体交联在一起形成的不容性的亲水性高分子网络；它在模拟细胞外基质方面具有许多优点如：高的含水量、疏松多孔的结构和与组织相似的力学性能，是具有生物功能的生物学微环境。

本发明中可注射生物活性水凝胶材料的优点：

1、具有高的含水量、疏松多孔的结构，方便营养物质的摄入和代谢废物的排除以及气体交换；

2、力学性能可控，能够体外以及体内肿瘤类组织及肿瘤组织周围固化形成不同力学性能的水凝胶，用于模拟逆转肿瘤恶性表型的胚胎微环境中细胞外基质的力学性能；

3、在接枝抗体过程中，采用NH₂交联法，避免了常规接枝抗体过程中抗体氧化造成的抗体活性的丧失；

4、采用的小分子量的透明质酸本身是胚胎组织中的成分，具有良好的生物相容性和生物安全性；

5、采用接枝Cripto单克隆抗体封闭和抑制血管生成的活性多肽的生物学疗法，避免传统抗癌药物在癌症治疗过程中本身所具有的毒副作用；

6、能够通过体外注射的方法，注射到体内实体瘤部位，固化形成不溶性水凝胶，具有创伤小等优点，并能提供一个较长时间的逆转肿瘤的微环境。

7、在体内具有可生物降解性。

本发明解决长期以来肿瘤研究中关于肿瘤发生机制氧化应激，基因突变，染色体异常，以及大量的表遗传学机制方面的局限性，从肿瘤系统生物学的角度，利用造成肿瘤异常生长的肿瘤细胞间及细胞与不断改变的细胞外基质的相互作用的原理，在体外构建一种三维环境模拟胚胎微环境(既可注射生物活性水凝胶材料)并用于肿瘤恶性表型的逆转。该凝胶材料可以解决临床药物化疗，放疗和手术，出现药物治疗敏感性差，毒副作用大，创伤大易复发等严峻问题。该凝胶材料凝胶可以注射到肿瘤部位，固化形成不溶的胶体，在局部形成逆转肿瘤的微环境。

附图说明

图1为具体实施方式六中用于肿瘤逆转的可注射生物活性水凝胶材料的SEM照片；图2为具体实施方式六中Western杂交检测蛋白结果；图3为具体实施方式六中细胞中Caspase3/7活性检测结果；图4为具体实施方式六中肿瘤体积变化曲线图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法，按以下步骤进行：一、配制10mL质量浓度为2.5％的透明质酸溶液，静置过夜，然后加入0.25g高碘酸钠，避光、4℃摇床上氧化6h，再加入200μL乙二醇并于摇床上氧化2h，然后加入等体积的无水乙醇，取析出沉淀，即为氧化的透明质酸；二、向氧化的透明质酸中加入等体积的水进行溶解，然后装入40KD的透析袋中，在4℃下透析48～72h，然后用冻干机冻干，再用体积浓度为75％的酒精进行消毒，晾干后配制成质量浓度为8％的氧化的透明质酸溶液；三、配制质量浓度为8％的ADH溶液，用0.2μm的滤膜过滤除菌，然后取1mL过滤后的ADH溶液与1mL质量浓度为8％的氧化的透明质酸溶液混合，再加入1～10mg的抗Cripto单克隆抗体和1～10mg的活性多肽，混匀后即得到用于肿瘤逆转的可注射生物活性水凝胶材料。

步骤三中ADH为己二酸二酰肼。

步骤三中抗Cripto单克隆抗体购买自北京博奥森生物技术有限公司；活性多肽抗体购买自北京博奥森生物技术有限公司。

本实施方式的可注射生物活性水凝胶材料源自于人体胚胎细胞外基质的主要成分，具有良好的生物安全性、生物相容性、可生物降解性等优点；对于不能用手术治疗的肿瘤更有优势；微创，减轻患者痛苦和治疗费用。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中摇床转速为30r/min。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中透明质酸的分子量为10000～100000道尔顿。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中在4℃下透析55～65h。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中在4℃下透析60h。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式六：本实施方式用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法，按以下步骤进行：一、配制10mL质量浓度为2.5％的透明质酸溶液，静置过夜，然后加入0.25g高碘酸钠，避光、4℃摇床上氧化6h，再加入200μL乙二醇并于摇床上氧化2h，然后加入等体积的无水乙醇，取析出沉淀，即为氧化的透明质酸；二、向氧化的透明质酸中加入等体积的水进行溶解，然后装入40KD的透析袋中，在4℃下透析50h，然后用冻干机冻干，再用体积浓度为75％的酒精进行消毒，晾干后配制成质量浓度为8％的氧化的透明质酸溶液；三、配制质量浓度为8％的ADH溶液，用0.2μm的滤膜过滤除菌，然后取1mL过滤后的ADH溶液与1mL质量浓度为8％的氧化的透明质酸溶液混合，再加入1mg的抗Cripto单克隆抗体和1mg的活性多肽，混匀后即得到用于肿瘤逆转的可注射生物活性水凝胶材料。

本实施方式中制备所得可注射生物活性水凝胶材料，具有类似体内细胞外基质的结构，形成基质凝胶后可模拟体内的细胞微环境，用于细胞的三维培养，水凝胶材料的SEM照片如图1所示。水凝胶材料的固有模量为120Pa，改变剪切力的频率，水凝胶的固有模量和损耗模量不随频率发生变化，说明水凝胶形成了均一稳定的结构。水凝胶材料的孔径大多分布在70～100μm。

本实施方式用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料可用于逆转肿瘤的恶性表型。

按照本实施方式方法，在步骤三中不加入抗Cripto单克隆抗体和活性多肽，其他步骤与本实施方式相同，制成无抗体水凝胶，用于对比实验。

实验1：将MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞分别培养在本实施方式制备的生物活性水凝胶材料和无抗体水凝胶中，培养7天，然后分别提取细胞的蛋白质，用Western杂交技术检测蛋白表达情况，结果如图2所示，图中A组表示MCF-7细胞在无抗体水凝胶中培养的结果，B组表示MCF-7细胞在本实施方式制备的生物活性水凝胶材料中培养的结果，C组表示MDA-MB-231细胞在无抗体水凝胶中培养的结果，D组表示MDA-MB-231细胞在本实施方式制备的生物活性水凝胶材料中培养的结果，α-Actin为内参。

PCNA为增殖细胞核抗原，PCNA与细胞DNA的合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，其量的变化与DNA的合成一致，检测其在细胞中的表达，可作为评价细胞增殖状态的一个指标。

Caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡的过程中起着关键性作用。其中Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，也是凋亡的关键酶和执行者。Caspase-3的表达不仅反映细胞的凋亡水平，而且反映凋亡启动因素的存在。抑制Caspase-3的表达对于抑制细胞异常凋亡有主要意义。

Nodal是一个在胚胎发生中正常表达的形态发生因子，能够诱导上皮-间质转化现象，是引起肿瘤转移与复发的基础因素之一。

结果可见：快速增殖的乳腺癌细胞系MCF-7中PCNA表达量明显高于恶性程度较高的MDA-MB-231细胞，本实施方式制备的生物活性水凝胶材料能够抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞中PCNA的表达，并且显著促进MDA-MB-231细胞中Caspase-3的表达，但对MCF-7细胞中Caspase-3表达水平无影响，同时，本实施方式制备的生物活性水凝胶材料使细胞内Nodal表达水平明显降低，说明用其处理细胞后，显著抑制乳腺细胞系MDA-MB-231和MCF-7的增殖，并促进恶性程度较高的MDA-MB-231的细胞凋亡，导致Nodal表达水平显著降低，说明利用本实施方式制备的水凝胶材料模拟胚胎组织微环境科逆转肿瘤细胞的恶性表性，对恶性程度较高的细胞系效果尤为显著。

实验2：将MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞分别培养在本实施方式制备的生物活性水凝胶材料和无抗体水凝胶中，培养72h，然后通过Caspase3/7活性试剂盒(Apo-ONEHomogeneous Caspase-3/7Assay，购买自promega公司)检测细胞中Caspase3/7活性，Caspase3/7为半胱氨酸蛋白酶家族成员，可促进细胞凋亡。检测结果如图3所示，图中

表示细胞在无抗体水凝胶中的培养结果，

表示细胞在本实施方式制备的生物活性水凝胶材料中的培养结果。

结果表明：与对照组无抗体水凝胶相比，本实施方式制备的生物活性水凝胶材料能增强乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231的Caspase3/7活性，表明其能够促进肿瘤细胞凋亡。

实验3：选择4周雌性裸鼠，分别注射黑色素瘤细胞B16(购买自中科院上海细胞库)，待裸鼠成瘤后，选择瘤体大小相近的裸鼠，分为两组：第一组注射生理盐水、第二组注射本实施方式制备的生物活性水凝胶材料。注射17天后，肿瘤体积变化曲线如图4所示。

图中-▲-表示第一组，-●-表示第二组。

结果表明：与第一组相比，第二组可显著抑制肿瘤的生长。

Claims

1.一种用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法，其特征在于用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法，按以下步骤进行：一、配制10mL质量浓度为2.5％的透明质酸溶液，静置过夜，然后加入0.25g高碘酸钠，避光、4℃摇床上氧化6h，再加入200μL乙二醇并于摇床上氧化2h，然后加入等体积的无水乙醇，取析出沉淀，即为氧化的透明质酸；二、向氧化的透明质酸中加入等体积的水进行溶解，然后装入40KD的透析袋中，在4℃下透析48～72h，然后用冻干机冻干，再用体积浓度为75％的酒精进行消毒，晾干后配制成质量浓度为8％的氧化的透明质酸溶液；三、配制质量浓度为8％的ADH溶液，用0.2μm的滤膜过滤除菌，然后取1mL过滤后的ADH溶液与1mL质量浓度为8％的氧化的透明质酸溶液混合，再加入1～10mg的抗Cripto单克隆抗体和1～10mg的活性多肽，混匀后即得到可注射生物活性水凝胶材料。

2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法，其特征在于步骤一中摇床转速为30r/min。

3.根据权利要求1或2所述的一种用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法，其特征在于步骤一中透明质酸的分子量为10000～100000道尔顿。

4.根据权利要求3所述的一种用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法，其特征在于步骤二中在4℃下透析55～65h。

5.根据权利要求3所述的一种用于肿瘤治疗的可注射生物活性水凝胶材料的制备方法，其特征在于步骤二中在4℃下透析60h。