CN102657297A - 一种调控高产奶牛围产期氧化应激的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种调控高产奶牛围产期氧化应激的方法。本发明在系统研究高产奶牛围产期氧化应激特征及与围产期疾病关系的基础上，利用硫辛酸的抗氧化性，确定产前10天开始至产后10天连续通过饲喂方式补充硫辛酸10克/头/天，建立了自由基清除技术，清除体内有害自由基的大量产生，激活动物体内的抗氧化防御系统，能显著改善围产期繁殖应激和代谢适应引起的氧化状态失衡及围产期奶牛的脂肪代谢，能有效保护奶牛围产期肝脏的功能损伤，可大大提高奶牛的产奶量，并可通过有效预防围产期生产疾病而延长奶牛的利用寿命。该方法简便易行，成本较低，安全可靠，效果明显，特别适合大中型企业养殖的高产奶牛。

Description

一种调控高产奶牛围产期氧化应激的方法

技术领域

本发明涉及一种调控高产奶牛围产期氧化应激的方法，属奶牛健康保健领域。

技术背景

现代奶牛饲养主要以密集的工厂化为主，为了提高奶牛的生产性能，通过遗传育种、高蛋白饲料和先进技术等将奶牛的生理极限向前推进。据统计，随着科技进步，世界上牛奶产量大幅度提高，20世纪40年代，奶牛的平均单产3000L/头，80年代提高到4940L/头，1995年达到6300L/头，现在平均单产超过8000L/头，发达国家已超过9000L/头。过度的产奶导致奶牛严重的福利问题，大约50％的奶牛在围产期出现异常。我国淘汰牛的25％发生在分娩后60d之内。

奶牛的围产期是指产前3周至产后3周的时期（也有人认为是产前4周至产后4周），这一时期奶牛处于应激状态，机体出现免疫抑制，包括中性粒细胞的功能、淋巴细胞对促细胞分裂剂的反应、抗体应答、免疫细胞产生细胞因子等发生了改变，疾病的易感性增加。研究认为，奶牛围产期容易发生的乳房炎、子宫炎、胎衣滞留、酮病、脂肪肝等均与机体妊娠后期和分娩刺激等所致的氧化应激有关。Sordillo报道，奶牛妊娠末期、分娩及泌乳早期的代谢需要均可使体内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生增加，大大超过了正常水平，而使动物处于氧化应激状态。正常情况下，体内ROS不断产生，也不断被抗氧化系统清除，从而始终保持一种动态平衡状态。ROS对许多生物分子具有强氧化性，除可造成蛋白质、DNA和核苷酸损伤外，主要引起生物膜的脂质过氧化作用。

调查发现，围产期对奶牛的健康十分重要，围产期疾病（如脂肪肝、酮病、生产瘫痪、肥胖母牛综合征、胎衣滞留、乳房炎、皱胃变位等）是造成经济损失和奶牛淘汰的主要原因，同时可降低乳产量、乳汁品质和奶牛的生产寿命，直接影响奶牛的高效清洁生产。据调查和国内的大量报道，奶牛利用年限较短是我国普遍存在的问题，一般平均终生胎次为3胎左右，而奶牛的平均寿命为25年，不能充分发挥产奶性能。奶牛的胎次就是奶牛的利用年限或泌乳周期，而泌乳周期是决定奶牛业经济效益的主要因素。培育1头到投产的奶牛需要27个月，第1~2胎的泌乳周期是回收投入成本阶段，无经济效益，从第3胎以后才有经济效益。胎次越高泌乳周期越多，利用年限越长经济效益越高。3~6胎是奶牛泌乳高峰期，也是创造经济效益的最好时期。我国中小型奶牛场4胎的淘汰率达70%以上。现代奶牛饲养主要以密集的工厂化为主，为了提高奶牛的生产性能，通过遗传育种、高蛋白饲料和先进技术等将奶牛的生理极限向前推进。这样使适合于当地饲养的地方奶牛品种大量消失，取而代之的是高产高饲料消耗的荷斯坦奶牛，奶牛的物种多样性正在消失。

研究认为，奶牛从妊娠到泌乳要经历巨大的代谢和生理适应性，临产阶段ROS生成增加和抗氧化防御能力之间的不平衡使奶牛处于氧化应激状态，导致机体免疫功能和炎症应答能力下降，机体对疾病的易感性增强，是围产期疾病发生的主要原因。研究表明，奶牛围产期血清脂质过氧化指标在干乳后期和泌乳早期发生明显的变化，表明奶牛围产期繁殖应激和代谢适应引起氧化状态失衡。因此，改善围产期奶牛的氧化失衡状态，对预防围产期疾病的发生具有重要意义。

近年来发现，硫辛酸是一种机体理想的生物抗氧化剂，能有效对抗多种自由基，并可调节其他抗氧化剂，对机体有重要的保护作用。硫辛酸被机体吸收后，体内以硫辛酸和二氢硫辛酸两种形式存在，硫辛酸能捕捉羟自由基、次氯酸和单线态氧，但不能捕捉过氧化氢和超氧自由基；而二氢硫辛酸能捕捉过氧自由基、羟自由基和次氯酸，但不能捕捉过氧化氢和单线态氧。由于体内硫辛酸和二氢硫辛酸同时存在，因此它们之间相互补充、相互协调，在体内可清除各种自由基和活性氧，共同组成了一种“万能抗氧化剂”。Mehmet等认为，硫辛酸可使大鼠限制应激所致的肾脏MDA含量降低，肝脏、肾脏和心脏GSH-Px活性升高，表明硫辛酸可有效改善限制应激所致的脂质过氧化。另外，硫辛酸也可降低糖尿病、庆大霉素、环磷酰胺等通过氧化应激所致的机体损伤。Savitha等研究发现，随着年龄的增长，中老年（13～24月龄）鼠机体的抗氧化能力降低，脂质过氧化物水平升高，通过补饲硫辛酸和肉碱，均可以使中老年鼠心肌和骨骼肌线粒体SOD、GSH-Px活性及GSH、维生素C、维生素E含量明显升高，脂质过氧化水平显著降低，认为可能与降低自由基生成和提高抗氧化能力有关。

关于硫辛酸抗氧化作用的机理已有许多报道。硫辛酸具有脂质二聚体的特殊分子结构，可以进入细胞的脂相和水相部分，具有脂溶和水溶的双重特性，容易吸收。同时，这一特性决定了硫辛酸在体内存在的多部位性，既可以存在于细胞内、细胞外和细胞膜上，也可以自由地通过血脑屏障，在大脑内发挥抗氧化和清除自由基的功能。目前的研究认为，硫辛酸的抗氧化能力与它的浓度和4个抗氧化特性有关，即螯合金属的能力、再生内源性抗氧化剂的能力、清除ROS的能力、修复氧化损伤的能力，其中后两者主要是通过硫辛酸的还原形式来完成。进入机体的硫辛酸极易被还原成还原型硫辛酸（dH-La），而后者又易被氧化成硫辛酸（La），这两种形式可以通过与其他抗氧化剂（如维生素C或维生素E）的氧化还原循环再生，并同时可提高细胞内谷胱甘肽（GSH）的水平。硫辛酸能与维生素C和维生素E的氧化还原发生耦联，使氧化型维生素C和维生素E重新恢复成维生素C和维生素E，从而再次发挥抗氧化作用。另外，硫辛酸可能是迄今发现的体内唯一可以使GSH再生的物质，二氢硫辛酸可使GSH浓度提高30％～70％。GSH-Px的高度特异性底物为还原型GSH，它能催化GSH将体内代谢产生的脂质氢过氧化物（或H₂O₂）还原成无害的醇类（或H₂O）。因此，本发明建立了通过硫辛酸调控高产奶牛围产期氧化应激的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是利用硫辛酸的抗氧化性，选择高产奶牛围产期发生氧化应激前的时间点通过补充最佳剂量的硫辛酸，建立自由基清除技术，清除体内有害自由基的大量产生，激活动物体内的抗氧化防御系统，可大大提高奶牛的抗应激能力、产奶量，并可通过有效预防围产期生产疾病而延长奶牛的利用寿命，以达到调控奶牛高效清洁生产的目的。

本发明调控高产奶牛围产期氧化应激的方法，在高产奶牛产前10天开始至产后10天连续通过饲喂方式补充硫辛酸类物质8－10克/头/天。

本发明中硫辛酸类物质的补充方法为奶牛饲喂精料前先取500－1000克精料将准确称取的硫辛酸类物质混合在其中，先行饲喂，采食干净后再提供剩余的精料。

上述方法中补充剂量为成年高产荷斯坦奶牛10克/头/天。

本发明的技术方案是在连续系统检测高产奶牛围产期（产前40至产后40天）氧化应激指标的基础上，确定在产前10天开始补充硫辛酸效果最好。

通过连续系统检测高产奶牛围产期（产前40至产后40天）氧化应激指标，发现血清过氧化氢酶（CAT）活性在产前5天降低，血清丙二醛（MDA）含量在产前5天开始升高，血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）在产前30天开始逐渐降低，产前5天低于正常水平，而且这些指标在产犊当天变化非常明显，机体表现严重的氧化应激状态（图1－3）。因此，选择高产奶牛在产前20天、15天和10天分别每天补充硫辛酸8－10克，通过定期检测上述指标的动态变化，发现产前10天开始补充即可达到良好的效果（表1）。

表1奶牛产前不同时间补充硫辛酸对血清抗氧化指标变化的影响

本发明的另一个关键是补充硫辛酸的剂量和方式，选择口服和混在饲料中补充进行比较，口服投服剂量准确，但每天对每头牛投服比较繁琐，操作者需要花费大量的时间和精力。通过不断的摸索，发现在奶牛饲喂精料前先取少量精料（500－1000克）将准确称取的硫辛酸混合在其中，先行饲喂，采食干净后再提供剩余的精料。

本发明确定了硫辛酸调控高产奶牛围产期氧化应激的最佳剂量。选择产前20天左右的荷斯坦奶牛，分别补充3、5、8、10、15、20、25、30克/头/天进行试验，通过观察补充后的临床表现（包括食欲、精神状态、粪便、泌乳等）和补充后10天和20天分别采集血液测定血清MDA含量，发现8克/头/天即有良好的调控效果，3-15克/头/天范围内调控效果呈剂量－效应关系（图4），考虑奶牛补充硫辛酸的成本，确定成年高产荷斯坦奶牛（体重约650kg）10克/头/天为最佳剂量。

本发明确定了高产奶牛围产期补充硫辛酸的持续时间，在确定产前10天开始补充硫辛酸的基础上，选择产后继续补充不同天数，确定持续补充的时间。选择产前10天左右的围产期奶牛25头，分为5组，每天补充硫辛酸10g/头，产后分别继续补充5天、10天、15天、20天和30天，通过观察补充后的临床表现（包括食欲、精神状态、粪便、泌乳等）和采集血液测定血清MDA含量，发现持续补充至产后10天以上效果相似（图5），考虑奶牛补充硫辛酸的成本，确定高产奶牛围产期补充硫辛酸的时间为产前第10天至产后10天，共连续补充20天。

本发明根据确定的补充时间和剂量，选择高产荷斯坦奶牛（体重约650kg），从产前开始补充硫辛酸10克/头/天，连续补充至产后10天，每天观察临床表现，并采集血液测定与氧化应激有关的指标，发现补充后第5天开始血清SOD、GSH-Px和CAT活性显著高于对照组（P<0.05），MDA含量下降，并维持在较低的水平；与肝脏、肾脏功能相关的生化指标均差异不显著（P>0.05）；补充硫辛酸未表现临床异常现象。表明该剂量的硫辛酸能清除围产期奶牛体内有害自由基的大量产生，激活动物体内的抗氧化防御系统，可大大提高奶牛的抗应激能力。同时，围产期疾病（如脂肪肝、酮病、生产瘫痪、肥胖母牛综合征、胎衣滞留、乳房炎、皱胃变位等）的发病率明显降低，产奶量有所升高。

本发明所述的硫辛酸类物质包括硫辛酸或其盐，例如α-硫辛酸，硫辛酸的外消旋混合物，硫辛酸盐、酯、酰胺或其衍生物等。本发明选择α-硫辛酸和硫辛酸盐进行比较，选择产前10天左右的奶牛10头，分为2组，分别补充α-硫辛酸和硫辛酸盐，剂量为10g/d/头，连续补充至产后10天，血清MDA含量见图6，表明硫辛酸不同的化合物形式效果相似。

本发明还确定了硫辛酸对奶牛的毒性剂量，选择成年荷斯坦奶牛10头分为二组，一次口服硫辛酸50克/头或100克/头，并每天观察临床表现，并采集血液测定血清生化指标（表2）。结果表明，口服硫辛酸50g/头，观察5d未出现任何不良反应，所测血清生化指标均无明显变化；而口服100g/头则在服用后精神沉郁，食欲降低，有的卧地不起，其中的2头在第3天死亡。表明单剂量50g/头硫辛酸对奶牛是安全的；按照成年牛500～650kg体重计算，硫辛酸对奶牛的安全剂量≤77～100mg/kg体重，154～200mg/kg体重可因急性中毒而导致死亡。Fuke等（1972）认为，硫辛酸对SD大鼠雄性和雌性的急性口服LD₅₀分别为1320和1130mg/kg BW；Cremer等对大鼠灌服硫辛酸175和550mg/kg/d两周无死亡；Packer等报道，犬口服硫辛酸的LD₅₀为400－500mg/kg体重；Hill（2004）对猫的研究发现，逐渐增加硫辛酸的剂量，可使猫血清氨和氨基酸水平显著改变，提示有明显的肝脏毒性，表明猫对硫辛酸比较敏感，毒性范围比人、犬和鼠高10倍以上，原因不清楚。由此可见，硫辛酸对实验动物的毒性极低，口服补充几乎认为无毒性，但未见硫辛酸对家畜安全性评价的报道。由此可见，硫辛酸对奶牛的安全剂量范围低于大鼠和犬，结合猫对硫辛酸比较敏感的报道，认为硫辛酸对动物的安全剂量范围存在明显的种属差异，在奶牛作为生物抗氧化剂应用时剂量10g/头（15～20mg/kg体重）无任何毒副作用。

表2奶牛口服硫辛酸50g/头对血清生化指标的影响

附图说明

图1奶牛围产期血清CAT活性的变化。

图2奶牛围产期血清GSH-Px活性的变化。

图3奶牛围产期血清MDA含量的变化。

图4不同剂量硫辛酸对奶牛围产期血清MDA含量的影响。

图5不同补充时间对产后奶牛血清MDA含量的影响。

图6不同的硫辛酸化合物对奶牛血清MDA含量的影响。

具体实施方式

实施例1：

选择围产期荷斯坦奶牛63头，常规饲养管理，日粮按照NRC（2001）配制全混合日粮（TMR），自由采食。其中33头在产前10天开始至产后10天连续通过饲喂补充硫辛酸10克/头/天，另30头对照。每天观察临床表现（包括食欲、精神状态、粪便、泌乳等），每隔5天采集血液测定血清生化指标，包括：血清肌酸磷酸激酶（CK）、碱性磷酸酶（AKP）、γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性及血清总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、甘油三酯（GT）、总胆固醇（Chol）、非酯化脂肪酸（NEFA）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）含量用全自动生化分析仪测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量用722光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。产后通过自动挤奶机记录每天的产奶量，并统计围产期疾病的发生率。

结果表明（表3-5），补充硫辛酸后第5天开始血清SOD、GSH-Px和CAT活性显著升高，与对照组差异显著或极显著；MDA含量下降，并维持在较低的水平；血清NEFA含量显著低于对照组，明显低于公认的妊娠末期和泌乳早期血清NEFA含量的极限值0.4mmol/L和0.7mmol/L，表明硫辛酸可降低血清脂肪代谢指标，泌乳早期血清NEFA含量的最高值仅为极限值的60％左右，表明硫辛酸可明显改善围产期奶牛的脂肪代谢，缓解泌乳早期的能量负平衡状况，使脂肪肝、酮病等围产期疾病发生的可能性降低；对照牛血清AST活性高于补充硫辛酸组，其余生化指标均变化不明显；补充硫辛酸未表现临床异常现象。统计产后20天的产奶量，补充硫辛酸比对照平均提高奶产量9.8%。统计围产期疾病的发生率，补充硫辛酸组仅发生1例胎衣滞留，发病率为3%；而对照组发生2例酮病、1例胎衣滞留和1例真胃左方变位，发病率为13%，其中1例真胃变位因术后感染而淘汰。

表3硫辛酸对奶牛血清生化指标变化的影响

表4硫辛酸对奶牛血清过氧化指标的影响

表5硫辛酸对奶牛血清脂肪代谢指标的影响

实施例2：

选择围产期荷斯坦高产奶牛133头，常规饲养管理，日粮按照NRC（2001）配制全混合日粮（TMR），自由采食，分为3组，其中Ⅰ组28头为对照，Ⅱ组50头在产前10天开始至产后10天连续通过饲喂补充硫辛酸8克/头/天，Ⅲ组55头在产前10天开始至产后10天连续通过饲喂补充硫辛酸10克/头/天。每天观察临床表现（包括食欲、精神状态、粪便、泌乳等），每隔5天采集血液测定血清生化指标，包括：碱性磷酸酶（AKP）、γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性及甘油三酯（GT）、非酯化脂肪酸（NEFA）含量用全自动生化分析仪测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量用722光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。产后通过自动挤奶机记录每天的产奶量，并统计围产期疾病的发生率。

生化指标测定结果基本与实施例1相一致，与对照组相比，补充硫辛酸组血清SOD、GSH-Px和CAT活性显著升高，血清MDA和NEFA含量下降，血清AST活性降低。表明高产奶牛产前10天补充硫辛酸能显著改善围产期繁殖应激和代谢适应引起的氧化状态失衡，明显改善围产期奶牛的脂肪代谢，能有效保护奶牛围产期肝脏的功能损伤。奶牛补充硫辛酸未表现临床异常现象。统计产后20天的产奶量，Ⅱ组和Ⅲ组分别比对照平均提高奶产量8.5%和10.9%。统计围产期疾病的发生率，Ⅱ组未发病，Ⅲ组仅发生1例酮病，平均发病率低于1%；而对照组发生2例酮病、1例产后瘫痪，发病率为11%。

Claims (4)

1. 一种调控高产奶牛围产期氧化应激的方法，其特征是在奶牛产前10天开始至产后10天连续通过饲喂方式补充硫辛酸类物质8－10克/头/天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的硫辛酸类物质是α-硫辛酸、硫辛酸的外消旋混合物、硫辛酸盐、酯、酰胺或其衍生物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是硫辛酸类物质的补充方法为奶牛饲喂精料前先取500－1000克精料将准确称取的硫辛酸类物质混合在其中，先行饲喂，采食干净后再提供剩余的精料。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是补充剂量为成年高产荷斯坦奶牛10克/头/天。

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