CN102653797B - 用于检测猪鼻支原体的lamp试剂盒及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于卫生检验领域，涉及一种用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒及其建立的方法和应用。该试剂盒主要包含由四条LAMP引物的LAMP反应液和阳性模板及核酸染料组成。经检测验证，本发明试剂盒具有良好的特异性、灵敏度，扩增快速、高效，且鉴定简便。本发明的检测体系在60℃-62℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏度地检测到猪鼻支原体，不需要复杂仪器，能较好满足对猪鼻支原体的现场检测，为兽医安全卫生的检测提供了新的技术平台，能较好的满足目前对猪场养殖现场检测的迫切需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
Description
技术领域
本发明属卫生检验领域，涉及一种用于检测猪鼻支原体的试剂盒，特别涉及一种用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒及其建立方法和应用。
背景技术
猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis，Mh）是猪呼吸道的常在菌，但病原的全身侵害将导致多浆膜炎、关节炎等疾病的发生。猪鼻支原体除了污染各种细胞，引起猪病，近年来被发现其与人胃癌、大肠癌有高度相关性，已经被认为是一种新的人传染病的病原。与猪肺炎支原体相似，猪鼻支原体能够黏附到猪呼吸道上部和下部有纤毛的上皮细胞上。呼吸道内一些猪鼻支原体的菌株能够引起肺炎。此外，猪鼻支原体感染能够引发中耳炎，当存在于咽鼓管内的支原体黏附到上皮细胞的纤毛上时可能会损害黏液纤毛器官。当其与其它细菌，如多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌共同感染时，可能会使感染上移。呼吸道疾病的发生多是由猪鼻支原体与呼吸道其他病原，如猪繁殖呼吸综合征病毒（PRRSV）协同感引起，偶尔单独由猪鼻支原体感染引起。
在检测方面，国内外已建立了多种血清学检测方法，如免疫琼扩和间接血凝等，但免疫琼扩和间接血凝法存在着灵敏度不高等问题。由于缺乏简单、快速的检测方法，该病原在人群中的感染情况尚不清楚。因此，该病原检测方法的研究将是流行病学研究的关键。
环介导等温扩增技术（LAMP）是由T.Notomi(2000)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。今年来，国外已将该技术广泛应用于病原体的检测。Masaki Imai等人（2007）利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人（2007）针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以用于检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血症（VHS）、巨细胞病毒（CMV）、造血组织坏死病毒（IHHNV）、番茄黄化曲叶病毒等。LAMP还可以用于对动物早期胚胎性别鉴定等。目前国内外均未见有用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒及在猪鼻支原体检测中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用方便、敏感度高、鉴定简便的用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒。
本发明的另一个目的是为检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒提供一种使用方便、敏感度高、鉴定简便的检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒的制备方法。
本发明的再一个目的是为检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒提供一种正确的使用方法。
本发明的主要目的所述的用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒，其结构主要由LAMP反应液、阳性模板和核酸染料组成，具体如下所述：
（1）LAMP反应液：所述LAMP反应液中的每24μl LAMP反应液的配制比例为：10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 0.5～1.5μl、8M Betaine 0.5～2.0μL、10mM dNTPs 2～3.5μL、10μM上游引物 F3 0.25～2μL、10μM下游引物 B3 0.25～2μL、40μM内上游引物 FIP 0.25～2μL、40μM内下游引物 BIP 0.25～2μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段0.5～2.0μL、用灭菌ddH2O补至24μL；
（2）阳性模板：猪鼻支原体pMD-18 T/P37核酸；
（3）核酸染料：SYBR Green I。
如上所述的每24μl LAMP反应液的优选配制比例为：10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 1.0μl、8M Betaine 2.0μL、10mM dNTPs 2μL、10μM上游引物 F3 0.5μL、10μM下游引物 B3 0.5μL、40μM内上游引物 FIP 0.5μL、40μM内下游引物 BIP 0.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段1.5μL、用灭菌ddH2O补至24μL；
上述的上游引物F3、下游引物B3、内上游引物FIP、内下游引物BIP分别为1F3、1B3、1FIP、1BIP组成的第一套引物，或2F3、2B3、2FIP、2BIP组成的第二套引物，或3F3、3B3、3FIP、3BIP组成的第三套引物，所述1F3、1B3、1FIP、1BIP或2F3、2B3、2FIP、2BIP或3F3、3B3、3FIP、3BIP的序列分别如下：
下表中的排序序号中的1～4为第一套引物，5～8为第二套引物，9～12为第三套引物。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒的制备方法，其方法的步骤如下：
（1）从基因数据库检索获得猪鼻支原体特异性P37基因序列，通过BLAST软件进行同源性分析，获得猪鼻支原体特异性P37基因序列的保守部分DNA序列；
（2）设计LAMP引物；将所得猪鼻支原体特异性P37基因序列的保守部分DNA序列，依据LAMP引物设计原则筛选设计了3套上游引物F3、下游引物B3、内上游引物FIP、内下游引物BIP组成的LAMP引物，即1F3、1B3、1FIP、1BIP组成的第一套引物，或2F3、2B3、2FIP、2BIP组成的第二套引物，或3F3、3B3、3FIP、3BIP组成的第三套引物；
（3）配置LAMP反应液：所述LAMP反应液中含有：10×ThermoPol buffer、MgSO4、Betaine、dNTPs、上游引物F3、下游引物B3、内上游引物FIP、内下游引物BIP、Bst DNA聚合酶大片段和灭菌ddH2O；其配制比例为：每24μl LAMP反应液中含有：10×ThermoPol buffer 2.5μL；100 mM MgSO4 0.5-1.5μl；8M Betaine 0.5-2.0μL；10mM dNTP 2-3.5μL；10μM上游引物 F3 0.25-2μL；10μM下游引物 B3 0.25-2μL；40μM内上游引物 FIP 0.25-2μL；40μM内下游引物 BIP 0.25-2μL；8U/μL Bst DNA聚合酶大片段0.5-2.0μL；用灭菌ddH2O补至24μL；
所述上游引物F3、下游引物B3、内上游引物FIP、内下游引物BIP分别为1F3、1B3、1FIP、1BIP组成的第一套引物，或2F3、2B3、2FIP、2BIP组成的第二套引物，或3F3、3B3、3FIP、3BIP组成的第三套引物；
（4）制备阳性模板：用第三套上游引物3F3和第一套下游引物1B3为引物，以猪鼻支原体基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆入pMD-18 T载体获得猪鼻支原体pMD-18 T/P37核酸为阳性模板；
（5）用1F3、1B3、1FIP、1BIP组成的第一套引物，或2F3、2B3、2FIP、2BIP组成的第二套引物，或3F3、3B3、3FIP、3BIP组成的第三套引物中的任一套作为上游引物F3、下游引物B3、内上游引物FIP、内下游引物BIP，与10×ThermoPol buffer、MgSO4、Betaine、dNTPs、Bst DNA聚合酶大片段和灭菌ddH2O配制好LAMP反应液，猪鼻支原体pMD-18 T/P37核酸为阳性模板，和商品化的SYBR Green I核酸染料组装成盒即为用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒。
本发明的再一个目的是为用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒提供一种正确的使用方法，其具体步骤如下：
首次使用或间隔时间较长后首次使用检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒时，应先用试剂盒中的阳性模板检验试剂盒中的LAMP反应液的有效性，其检验方法的步骤如下：
（1）取试剂盒中的阳性模板即猪鼻支原体pMD-18 T/P37核酸1μL，再取试剂盒中的24μL LAMP反应液，将1μL阳性模板加入到24μL LAMP反应液中，经瞬时离心混匀得阳性模板反应液；
（2）将阳性模板反应液置60℃～62℃恒温40min进行LAMP扩增，然后经80℃ 5min进行酶的灭活；取出扩增反应管，对阳性模板和LAMP反应液的有效性进行判定；
在确认LAMP反应液有效的情况下，再对待测样品的核酸进行是否含有猪鼻支原体的检测，其检测方法的步骤如下：
（1）提取待测样品的核酸；
（2）取1μL待测样品的核酸，再取试剂盒中的24μL LAMP反应液，将1μL待测样品的核酸加入到24μL LAMP反应液中，经瞬时离心混匀得待测样品反应液；
（3）将待测样品反应液置60℃-62℃恒温40min进行LAMP扩增，然后80℃ 5min进行酶的灭活；取出扩增反应管，对待测样品的核酸进行是否含有猪鼻支原体进行判定；
对上述的检验和检测结果的判定方法为如下方法之一或其结合：
（1）在扩增反应管的LAMP产物中加入试剂盒中的适量的核酸染料1×SYBR Green I，根据反应液的颜色变化的结果判断为：如颜色变绿说明待测样品中存在猪鼻支原体，棕色说明待测样品中不存在猪鼻支原体；
（2）或取5-8μL LAMP产物进行1.5%琼脂糖电泳观察，如观察到梯状条带则说明待测样品中存在猪鼻支原体，没有梯状条带则说明待测样品中不存在猪鼻支原体；
（3）或将LAMP产物进行7000r/min离心5min，观察，如出现沉淀则说明待测样品中存在猪鼻支原体、没有沉淀则说明待测样品中不存在猪鼻支原体。
本发明具有下列突出的优点：
1）高特异性：4条引物对靶序列6个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中，找出相应的靶序列进行扩增（图2）。
2）高敏感度：LAMP灵敏度比PCR高，灵敏度可达10拷贝（图3和图4）。
3）鉴定简便：扩增反应结束后，加入SYBR Green I肉眼就可以根据反应液的颜色变化初步判断结果：绿色说明待测样品中存在猪鼻支原体，橙色则说明待测样品中不存在猪鼻支原体。
4）操作简单：用LAMP试剂盒，只要将检测样品（待测核酸）和试剂混合后一起放入60℃-62℃水浴锅40min，然后放入80℃的水浴锅5分钟就可以利用观察、离心和琼脂糖电泳等简单方法判定结果。
本发明的检测体系可以在等温条件下，快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度地检测到猪鼻支原体，不需要复杂仪器，为公共卫生的检测提供了新的技术平台，能较好的满足目前对医学临床和兽医临床等的现场检测的迫切需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
附图说明
图1为本发明所述试剂盒的构建及使用方法示意图。
图2为猪鼻支原体LAMP检测体系的特异性检测结果电泳图:
其中，M.DNA Marker；1泳道为阴性对照；2泳道为猪鼻支原体质粒；3-12泳道分别为：副猪嗜血杆菌DNA、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌DNA模板、猪链球菌DNA模板、多杀性巴氏杆菌DNA模板、鸡毒支原体DNA模板、猪肺炎支原体DNA模板、絮状支原体DNA模板、蓝耳病毒cDNA模板、圆环病毒DNA模板、猪瘟病毒cDNA模板。
图3和图4为猪鼻支原体LAMP检测体系的敏感度验证电泳图:
图3中，M.DNA Marker；1-6泳道分别为以1012、1010、108、106、104、102稀释度的猪鼻支原体质粒；7泳道为猪鼻支原体DNA；8泳道为阴性对照；9泳道为DNA Marker。
图4中，M.DNA Marker；1泳道为猪鼻支原体DNA；2-8泳道分别为以1011、109、107、105、103、101、100拷贝的猪鼻支原体质粒；9泳道为阴性对照；M泳道为DNA Marker。
具体实施方式
本发明所述试剂盒的构建及使用方法如图1所示。具体的构建和使用方法如下：
实施例1
1.特异性DNA序列查找
从GenBank数据库检索获得多株猪鼻支原体基因租序列，通过BLAST软件进行同源性分析即找到特异性的保守靶序列进行LAMP引物设计。
2.LAMP引物设计
通过专门的LAMP引物设计软件Primer design 4.0 （http://primerexlorer.jp; Eiken Chemical Co. Ltd, Janpan）和Primer Premier 6.0设计引物，设计的具体引物见下表（3套引物，每套4条，排序序列1-4为第一套，5-8为第二套，9-12为第三套）。
3.猪鼻支原体pMD-18 T/P37基因重组质粒构建
用上述的第三套引物中的上游引物3F3和第一套引物中的下游引物1B3为引物，以猪鼻支原体基因组DNA为模板进行PCR扩增，猪鼻支原体基因组DNA可用常用的猪鼻支原体CVCC 361菌株进行提取，扩增产物克隆入pMD-18 T载体，提取质粒经LAMP鉴定阳性，即可作为阳性模板。
4.建立检测体系
主要由LAMP反应液、阳性模板和核酸染料组成，具体如下所述：
（1）调配LAMP反应液：所述LAMP反应液中的每24μl LAMP反应液的配制比例举例如下：
10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 0.5μl、8M Betaine 0.5μL、10mM dNTPs 2μL、10μM上游引物 F3 μL、10μM下游引物 B3 0.25μL、40μM内上游引物 FIP 0.25μL、40μM内下游引物 BIP 0.25μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段0.5μL、用灭菌ddH2O补至24μL；
或：10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 1.5μl、8M Betaine 2.0μL、10mM dNTPs 3.5μL、10μM上游引物 F3 2μL、10μM下游引物 B3 2μL、40μM内上游引物 FIP 2μL、40μM内下游引物 BIP 2μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段2.0μL、用灭菌ddH2O补至24μL；
或：10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 1.0μl、8M Betaine 1.0μL、10mM dNTPs 3μL、10μM上游引物 F3 1μL、10μM下游引物 B3 1μL、40μM内上游引物 FIP 1μL、40μM内下游引物 BIP 1μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段1μL、用灭菌ddH2O补至24μL；
或：10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 0.5μl、8M Betaine 0.5μL、10mM dNTPs 2μL、10μM上游引物 F3 2μL、10μM下游引物 B3 2μL、40μM内上游引物 FIP 2μL、40μM内下游引物 BIP 2μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段2.0μL、用灭菌ddH2O补至24μL；
或：10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 1.5μl、8M Betaine 2.0μL、10mM dNTPs 3.5μL、10μM上游引物 F3 0.25μL、10μM下游引物 B3 0.25μL、40μM内上游引物 FIP 0.25μL、40μM内下游引物 BIP 0.25μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段0.5μL、用灭菌ddH2O补至24μL；
或：10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 1.5μl、8M Betaine 2.0μL、10mM dNTPs 3.5μL、10μM上游引物 F3 1μL、10μM下游引物 B3 1μL、40μM内上游引物 FIP 1μL、40μM内下游引物 BIP 1μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段1.0μL、用灭菌ddH2O补至24μL；
或：10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 1.0μl、8M Betaine 2.0μL、10mM dNTPs 2μL、10μM上游引物 F3 0.5μL、10μM下游引物 B3 0.5μL、40μM内上游引物 FIP 0.5μL、40μM内下游引物 BIP 0.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段1.5μL、用灭菌ddH2O补至24μL；
或：10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 1.5μl、8M Betaine 0.5μL、10mM dNTPs 2μL、10μM上游引物 F3 0.5μL、10μM下游引物 B3 0.5μL、40μM内上游引物 FIP 0.5μL、40μM内下游引物 BIP 0.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段2.0μL、用灭菌ddH2O补至24μL；
或：10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 1.5μl、8M Betaine 0.5μL、10mM dNTPs 3.5μL、10μM上游引物 F3 0.5μL、10μM下游引物 B3 0.5μL、40μM内上游引物 FIP 0.5μL、40μM内下游引物 BIP 0.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段0.5μL、用灭菌ddH2O补至24μL；
总之：在10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 0.5～1.5μl、8M Betaine 0.5～2.0μL、10mM dNTPs 2～3.5μL、10μM上游引物 F3 0.25～2μL、10μM下游引物 B3 0.25～2μL、40μM内上游引物 FIP 0.25～2μL、40μM内下游引物 BIP 0.25～2μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段0.5～2.0μL范围内均可调配，最后用灭菌ddH2O补至24μL即可。
（2）以猪鼻支原体pMD-18 T/P37核酸基因重组质粒为阳性模板；
（3）选用SYBR Green I作核酸染料。
5.分析检测体系的灵敏性、特异性
其检测程序为：
（1）取试剂盒中的阳性模板即猪鼻支原体pMD-18 T/P37核酸1μL，再取试剂盒中的24μL LAMP反应液，将1μL阳性模板加入到24μL LAMP反应液中，经瞬时离心混匀得阳性模板反应液；
（2）将阳性模板反应液置60℃～62℃恒温40min进行LAMP扩增，然后经80℃ 5min进行酶的灭活；取出扩增反应管，对阳性模板和LAMP反应液的有效性进行判定；
在确认LAMP反应液有效的情况下，再对待测样品的核酸进行是否含有猪鼻支原体的检测，其检测方法的步骤如下：
（1）提取待测样品的核酸；
（2）取1μL待测样品的核酸，再取试剂盒中的24μL LAMP反应液，将1μL待测样品的核酸加入到24μL LAMP反应液中，经瞬时离心混匀得待测样品反应液；
（3）将待测样品反应液置60℃-62℃恒温40min进行LAMP扩增，然后80℃ 5min进行酶的灭活；取出扩增反应管，对待测样品的核酸进行是否含有猪鼻支原体进行判定；
对上述的检验和检测结果的判定方法为如下方法之一或其结合：
（1）在扩增反应管的LAMP产物中加入试剂盒中的适量的核酸染料1×SYBR Green I，根据反应液的颜色变化的结果判断为：如颜色变绿说明待测样品中存在猪鼻支原体，棕色说明待测样品中不存在猪鼻支原体；
（2）或取5-8μL LAMP产物进行1.5%琼脂糖电泳观察，如观察到梯状条带则说明待测样品中存在猪鼻支原体，没有梯状条带则说明待测样品中不存在猪鼻支原体；
（3）或将LAMP产物进行7000r/min离心5min，观察，如出现沉淀则说明待测样品中存在猪鼻支原体、没有沉淀则说明待测样品中不存在猪鼻支原体。
本发明的用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒，以副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、鸡毒支原体、猪肺炎支原体、絮状支原体、蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒等十种与猪鼻支原体相近的细菌、病毒的DNA或cDNA为模板检测体系的特异性，由图2结果显示。本发明方法只能扩增猪鼻支原体而不能检测到其他非目标细菌、病毒的DNA或cDNA，证实所建立的LAMP具有良好的特异性；以1012、1011……100拷贝的猪鼻支原体为模板进行LAMP敏感性试验，由图3和图4结果显示，本发明的LAMP检测试剂盒的灵敏度为101拷贝，证实所建立的LAMP具有良好的灵敏度；比较LAMP检测方法与套式PCR检测方法的符合率，用LAMP检测方法将23份临床样品进行检测，同时与套式PCR检测结果相比较，结果表明LAMP检测阳性符合率为100%。
序列表：
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒及其制备方法
<130> 说明书
<140> 00
<141> 2012-04-09
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cttctttgtt aacttcttta tctcc 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ttttaaagct atctctgtca caa 23
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aggatgtatc agttagtcaa ggtcaaccaa gcttctgaaa cacc 44
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
catgatatag caaatgctat tggcggaggt agcttttttg ctcaa 45
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
aaacactcca acatcatacg 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cgcacatcca aacgcata 18
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tcagcaacaa aaccttttga aactagaatt ggattagtta ctataagtgc 50
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gttatgtgtt caagcaaaag aacctctgca gatacattgg gaactt 46
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ggttaacact ttttctaaac actc 24
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
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aagacagaag cgcacatc 18
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
tcagcaacaa aaccttttga aactacaaca tcatacggaa ttggatt 47
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
atgtgttcaa gcaaaagaac cttctctgca gatacattgg gaac 44
Claims (2)
1.一种用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒，其特征在于包含如下组分：
（1）LAMP反应液：所述LAMP反应液中的每24μl LAMP反应液的配制比例为：10×ThermoPol buffer 2.5μL、100 mM MgSO4 0.5～1.5μl、8M Betaine 0.5～2.0μL、10mM dNTPs 2～3.5μL、10μM上游引物 F3 0.25～2μL、10μM下游引物 B3 0.25～2μL、40μM内上游引物 FIP 0.25～2μL、40μM内下游引物 BIP 0.25～2μL、8U/μL Bst DNA聚合酶大片段0.5～2.0μL、用灭菌ddH2O补至24μL；
其中所述上游引物、下游引物、内上游引物、内下游引物为如下表三套引物中的任意一套，下表中的排序序号中的1～4为第一套引物，5～8为第二套引物，9～12为第三套引物，序列分别如下：
（2）阳性模板：猪鼻支原体pMD-18 T/P37核酸；
（3）核酸染料：SYBR Green I。
2.如权利要求1所述的用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒的制备方法，其特征在于其方法的步骤如下：
（1）从基因数据库检索获得猪鼻支原体特异性P37基因序列，通过BLAST软件进行同源性分析，获得猪鼻支原体特异性P37基因序列的保守部分DNA序列；
（2）设计LAMP引物；将所得猪鼻支原体特异性P37基因序列的保守部分DNA序列，依据LAMP引物设计原则筛选设计了3套上游引物F3、下游引物B3、内上游引物FIP、内下游引物BIP组成的LAMP引物，即1F3、1B3、1FIP、1BIP组成的第一套引物，或2F3、2B3、2FIP、2BIP组成的第二套引物，或3F3、3B3、3FIP、3BIP组成的第三套引物；
（3）配置LAMP反应液：所述LAMP反应液中含有：10×ThermoPol buffer、MgSO4、Betaine、dNTPs、上游引物F3、下游引物B3、内上游引物FIP、内下游引物BIP、Bst DNA聚合酶大片段和灭菌ddH2O；其配制比例为：每24μl LAMP反应液中含有：10×ThermoPol buffer 2.5μL；100 mM MgSO4 0.5-1.5μl；8M Betaine 0.5-2.0μL；10mM dNTP 2-3.5μL；10μM上游引物 F3 0.25-2μL；10μM下游引物 B3 0.25-2μL；40μM内上游引物 FIP 0.25-2μL；40μM内下游引物 BIP 0.25-2μL；8U/μL Bst DNA聚合酶大片段0.5-2.0μL；用灭菌ddH2O补至24μL；
所述上游引物F3、下游引物B3、内上游引物FIP、内下游引物BIP分别为1F3、1B3、1FIP、1BIP组成的第一套引物，或2F3、2B3、2FIP、2BIP组成的第二套引物，或3F3、3B3、3FIP、3BIP组成的第三套引物；
（4）制备阳性模板：用第三套上游引物3F3和第一套下游引物1B3为引物，以猪鼻支原体基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆入pMD-18 T载体获得猪鼻支原体pMD-18 T/P37核酸为阳性模板；
（5）用1F3、1B3、1FIP、1BIP组成的第一套引物，或2F3、2B3、2FIP、2BIP组成的第二套引物，或3F3、3B3、3FIP、3BIP组成的第三套引物中的任一套作为上游引物F3、下游引物B3、内上游引物FIP、内下游引物BIP，与10×ThermoPol buffer、MgSO4、Betaine、dNTPs、Bst DNA聚合酶大片段和灭菌ddH2O配制好LAMP反应液，猪鼻支原体pMD-18 T/P37核酸为阳性模板，和商品化的SYBR Green I核酸染料组装成盒即为用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒。
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