CN102650627A

CN102650627A - 一种加压毛细管电色谱检测水产品中三聚氰胺的方法

Info

Publication number: CN102650627A
Application number: CN2011103663667A
Authority: CN
Inventors: 曹国洲; 朱晓艳; 肖道清; 刘在美; 杨文潮; 陈少鸿; 郑琳; 陈建国; 董洁莹
Original assignee: Ningbo Institute of Inspection and Quarantine Science Technology
Current assignee: Ningbo Institute of Inspection and Quarantine Science Technology
Priority date: 2011-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2012-08-29

Abstract

本发明涉及一种加压毛细管电色谱仪检测水产品中三聚氰胺的方法，步骤为：1)样品制备；2)样品预处理：将样品经体积比为1.5～2.5∶1的质量浓度为0.8～1.2％三氯乙酸和乙腈混合液离心提取，MCX固相萃取柱净化，再经0.20～0.24μm滤膜过滤后供毛细管电色谱测定用；3)配制三聚氰胺标准溶液；4)采用加压毛细管电色谱进行分析；5)将样品经检测分析后根据其保留时间进行定量分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。本发明的分析方法高效、准确、灵敏度高，可以满足日常水产品三聚氰胺药物检测的需求。

Description

一种加压毛细管电色谱检测水产品中三聚氰胺的方法

技术领域

本发明食品安全-兽药残留领域，具体是一种采用毛细管电色谱仪检测水产品中三聚氰胺的分析方法。

背景技术

三聚氰胺(Melamine)简称三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，主要用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂。由于其氮的质量分数66％左右，一些不法厂商在饲料中大量添加，以提高产品中粗蛋白含量，水生生物食用含三聚氰胺的饲料后可能会在体内富集，严重损害了消费者的健康和利益。2008年9月“三鹿奶粉事件”引起了人们对三聚氰胺的高度关注。但目前发布的方法只有原料乳和乳制品中三聚氰胺检测方法和饲料中三聚氰胺的检测方法，关于水产品中三聚氰胺检测的方法还未见报道。因此，建立一种快速、准确检测水产品组织中三聚氰胺残留的方法非常必要。

目前用于三聚氰胺的检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法等。液相色谱法的灵敏度较低，且分析时间较长，气质、液质联用仪虽然检测灵敏度和分辨率很高，但一般实验室很难配置这样的仪器。

加压毛细管电色谱(pCEC)是近几年来兴起的一种微分离技术，它结合了电泳的高效性和高效液相色谱的保留机制，通过在填有HPLC填料的毛细管色谱柱的两端施加高压，提高了样品的分离能力和效率，使以前需很长时间才能出现的峰现在只需很短时间就可出现，并且试剂和样品的消耗量减少，近几年开始也用于兽药残留的分离。

发明内容

本发明所要解决技术问题是提供一种加压毛细管电色谱仪检测水产品中三聚氰胺的方法，具有快速、准确、灵敏度高的特点。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种加压毛细管电色谱仪检测水产品中三聚氰胺的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)样品制备：将水产品肌肉组织样品剪碎后均质，冷冻保存；

2)样品预处理：将样品经体积比为1.5～2.5∶1的质量浓度为0.8～1.2％三氯乙酸和乙腈混合液离心提取，MCX固相萃取柱净化，再经0.20～0.24μm滤膜过滤后供毛细管电色谱测定用；

3)配制三聚氰胺标准溶液；

4)采用加压毛细管电色谱进行分析：以反相键和C18为填料的毛细管电色谱柱作为检测柱；流动相采用9～11mmol/L，pH＝2.5～3.5的庚烷磺酸钠-柠檬酸溶液与乙腈的混合液，其体积比为80～70∶20～30；所加电压为-9～-11kv，柱压为9.0～9.2MP，柱温为常温，流动相的流速：40～60μL/min；进样量：0.9～1.1μL的工艺条件下，用紫外检测器在波长240nm处进行检测，同时绘制标准曲线；

5)将样品经检测分析后根据其保留时间进行定量分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。

作为优选，所述步骤2)中的三氯乙酸的质量浓度为1％，混合液中三氯乙酸与乙腈的体积比为2∶1。

作为改进，所述步骤2)中的离心提取的具体过程为：准确称取2±0.01g均质样品置于50mL离心管中，加入1％的三氯乙酸10mL，乙腈5mL，用涡旋混合器充分混匀1～2min，4000～6000r/min离心8～12min，收集上清液，再向原离心管中加入15mL体积比为2∶1的1％三氯乙酸和乙腈混合液重复提取一次，合并两次上清液。

作为改进，所述步骤2)的MCX固相萃取柱净化的具体过程为：用2～4mL甲醇活化MCX固相萃取小柱，再用4～6mL去离子水冲洗小柱，转移过多的甲醇，然后将提取液分次转移上柱，保持1.5～2.5mL/min的流速过柱，待上样液全部完成后，再依次用4～6mL水、2～4mL甲醇淋洗近干，最后用5～7mL4～6(v体积)％氨化甲醇溶液洗脱固相萃取小柱，分步洗脱，收集滤液并用氮吹仪吹干，用0.9～1.1mL流动相定容。

再改进，所述步骤3)的配制三聚氰胺标准溶液的步骤为：称取三聚氰胺标准品10.0mg±0.01g，用50％甲醇水溶液溶解并定容于100ml容量瓶中，配成质量浓度为100mg/L标准储备溶液。

再改进，所述步骤4)中庚烷磺酸钠-柠檬酸溶液的浓度为10mmol/L，pH＝3，流动相的配制过程为：取乙腈、重蒸水、20mmol/L庚烷磺酸钠-柠檬酸溶液按体积比为25∶25∶50的比列配成流动相，超声波脱气20～40min。

进一步改进，所述三聚氰胺标准溶液在检测前需用流动相稀释成0.2～5μg/mL的标准工作液。

优选，所述毛细管电色谱柱选用规格为EP-100-20/45-3-C18，内径100μm，有效柱长20cm，填料粒径3μm ODS。

最后，所述步骤4)的电压优选为-10kv，柱压优选为9.1MP，流动相的流速：50μL/min；进样量：1.0μL。

与现有技术相比，本发明的优点在于：采用三氯乙酸和乙腈混合液作为提取剂，可以有效沉淀鱼肉组织中的蛋白质和去除脂肪，采用固相萃取对样品进行预处理，可以有效减少杂质的含量和基质干扰；采用庚烷磺酸钠-柠檬酸与乙腈的混合液为流动相，由于三聚氰胺具有较强的极性，在反向色谱柱上不易保留，故采用离子对试剂与三聚氰胺形成离子对以延长其在色谱柱上的保留；庚烷磺酸钠-柠檬酸溶液具有一定的pH缓冲能力，使pH不易变化，从而保证了流动相的pH稳定性；采用毛细管电色谱进行分析检测，有机试剂消耗少，通过施加外电压，可以三聚氰胺的保留时间，并且灵敏度得到提高，本发明的分析方法高效、准确，有机试剂消耗少，有较高的灵敏度，可用于水产品中三聚氰胺的检测。

附图说明

图1是加-10kV电压时三聚氰胺药物标准品的毛细管电色谱图；

图2是不加电压的uHPLC图；

图3是市售鱼肉样品的检测电色谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本实施例以秋刀鱼为例，采用毛细管电色谱仪检测秋刀鱼中残留的三聚氰胺，具体步骤为：

1、样品制备：将秋刀鱼肌肉组织样品，用剪刀剪碎后均质，冷冻保存；

2、样品预处理：

(1)提取：将样品解冻，准确称取2±0.01g(精确至0.01g)均质样品置于50mL离心管中，加入1％的三氯乙酸10mL，乙腈5mL，用涡旋混合器充分混匀1～2min，5000r/min离心10min，收集上清液，再向原离心管中加入15mL体积比为2∶1的1％三氯乙酸和乙腈混合液重复提取一次，合并两次上清液。

(2)净化：用3mL甲醇活化MCX固相萃取小柱，再用5mL去离子水冲洗小柱，转移过多的甲醇，然后将提取液分次转移上柱，待上样液全部完成后，再依次用5mL水、3mL甲醇淋洗近干，最后用6mL5％氨化甲醇溶液洗脱固相萃取小柱，分步洗脱，收集滤液并用氮吹仪吹干，用1mL流动相定容。经0.22μm滤膜过滤后，供毛细管电色谱测定。

3、配制三聚氰胺标准溶液；称取三聚氰胺标准品10.0mg±0.01g，用50％甲醇水溶液溶解并定容于100ml容量瓶中，配成质量浓度为100mg/L标准储备溶液，避光冷藏保存。临用前用流动相稀释成标准工作液。

4、流动相配制及色谱条件：

取乙腈、重蒸水、20mmol/L庚烷磺酸钠-柠檬酸溶液按体积比为25∶25∶50的比列配成流动相，超声波脱气30min后备用。

所用色谱条件：

(1)色谱柱选用规格EP-100-20/45-3-C18，内径100μm，有效柱长20cm，填料粒径3μmODS柱；

(2)紫外检测：波长240nm；

(3)流动相：乙腈：庚烷磺酸钠-柠檬酸溶液(10mmol/L，pH 3)＝25∶75(V/V)，

(4)流速：50μL/min；进样量：1μL；

(5)柱压：电压-10kV，柱压为9.1MP，柱温为常温。

5、工作曲线和检出限：

用流动相稀释标准储备溶液为0.2～5μg/mL混合标准工作溶液，按试验条件进行检测，绘制标准曲线。求得标准曲线回归方程Y＝686.4X+1.8539，相关系数R²＝0.9993，结果表明三聚氰胺在0.2～5μg/mL的浓度范围内其峰面积(Y)与三聚氰胺浓度(X)呈良好的线性关系。按3倍信噪比得出方法检出限为0.2μg/mL。

6、回收率和精密度试验：

分别选取秋刀鱼样品，添加三聚氰胺标准溶液，考察方法的回收率。每一添加浓度重复测定6次，考察方法的精密度，结果见表1.

表1样品加标平均回收率(n＝6)

从上述结果可知本实验建立的秋刀鱼中三聚氰胺药物残留分析的固相萃取-毛细管电色谱法，用2∶1比例的1％三氯乙酸和乙腈混合液作为提取剂，可以有效沉淀鱼肉组织中的蛋白质和去除脂肪，采用固相萃取对样品进行预处理，可以有效减少杂质的含量和基质干扰；采用流动相为10mmol/L，pH＝3的庚烷磺酸钠-柠檬酸与乙腈的混合液，其体积比为75∶25，由于三聚氰胺具有较强的极性，在反向色谱柱上不易保留，故采用离子对试剂与三聚氰胺形成离子对以延长其在色谱柱上的保留；10mmol/L庚烷磺酸钠-柠檬酸溶液具有一定的pH缓冲能力，使pH不易变化，从而保证了流动相的pH稳定性；采用毛细管电色谱进行分析检测，有机试剂消耗少，通过施加外电压，可以三聚氰胺的保留时间，并且灵敏度得到提高，该方法不仅能满足秋刀鱼中三聚氰胺残留量的常规检测，也可以用于其它水产品样品中的三聚氰胺的测定。

在本发明所建立的分析条件下，得到三聚氰胺药物标准品的毛细管电色谱(图1)和不加电压的uHPLC图(图2)及市售鱼肉样品的检测谱图(图3)从这些色谱图的分离效果可见，可以有效解决基质中大部分干扰物质的影响，样品中杂质对三聚氰胺也没有干扰，也并且能有效缩短分析时间。

Claims

1.一种加压毛细管电色谱仪检测水产品中三聚氰胺的方法，其特征在于包括以下步骤：

3)配制三聚氰胺标准溶液；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的三氯乙酸的质量浓度为1％，混合液中三氯乙酸与乙腈的体积比为2：1。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的离心提取的具体过程为：准确称取2±0.01g均质样品置于50mL离心管中，加入1％的三氯乙酸10mL，乙腈5mL，用涡旋混合器充分混匀1～2min，4000～6000r/min离心8～12min，收集上清液，再向原离心管中加入15mL体积比为2∶1的1％三氯乙酸和乙腈混合液重复提取一次，合并两次上清液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)的MCX固相萃取柱净化的具体过程为：用2～4mL甲醇活化MCX固相萃取小柱，再用4～6mL去离子水冲洗小柱，转移过多的甲醇，然后将提取液分次转移上柱，保持1.5～2.5mL/min的流速过柱，待上样液全部完成后，再依次用4～6mL水、2～4mL甲醇淋洗近干，最后用5～7mL4～6(v)％氨化甲醇溶液洗脱固相萃取小柱，分步洗脱，收集滤液并用氮吹仪吹干，用0.9～1.1mL流动相定容。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤3)的配制三聚氰胺标准溶液的步骤为：称取三聚氰胺标准品10.0mg±0.01g，用50％甲醇水溶液溶解并定容于100ml容量瓶中，配成质量浓度为100mg/L标准储备溶液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤4)中庚烷磺酸钠-柠檬酸溶液的浓度为10mmol/L，pH＝3，流动相的配制过程为：取乙腈、重蒸水、20mmol/L庚烷磺酸钠-柠檬酸溶液按体积比为25∶25∶50的比列配成流动相，超声波脱气20～40min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述三聚氰胺标准溶液在检测前需用流动相稀释成0.2～5μg/mL的标准工作液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述毛细管电色谱柱选用规格为EP-100-20/45-3-C18，内径100μm，有效柱长20cm，填料粒径3μm ODS。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤4)的电压为-10kv，柱压为9.1MP，流动相的流速：50μL/min；进样量：1.0μL。