CN102649834A - 具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一类具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料的制备方法。本发明以乙酰丙酮铁(Ⅲ)，1，2-十六二醇和油酸等原料通过高温溶剂法制备单分散的磁纳米粒子，采用可逆加成-断裂转移法合成了具有荧光性质的水溶性磁纳米复合粒子。这类磁性纳米复合材料在生物分离、靶向给药、热疗和磁共振成像等生物领域有着广泛的应用前景。磁性纳米复合材料容易制备且稳定性好，我们在聚合物末端引入生物相容性的氨基，氨基可以和异硫氰酸荧光素反应，在磁纳米复合材料表面引入异硫氰酸荧光素以便实现对生物活性物质的荧光标记。

Description

具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料的制备方法

技术领域

本发明属于生物功能化材料技术领域，具体涉及一类具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料的制备方法。 

背景技术

纳米材料是指三维空间中至少有一个维度在1～100 nm尺度范围内的超微颗粒及其致密的聚集体。磁性纳米粒子具有体积效应(纳米粒子晶体周期性的边界条件将被破坏，声、光、力、热、电、内压以及化学活性等与普通粒子均发生了很大变化)，表面效应(纳米微粒由于尺寸小、表面积大、表面能高，位于表面的原子处于严重的缺位状态，活性高，易于其他原子结合)，量子尺度效应(费米能级由准连续态变为分立能级)和宏观量子隧道效应(微观粒子可以贯穿势垒)。当磁性纳米粒子的粒径小于其超顺磁性临界尺寸时，粒子进入超顺磁性状态，无矫顽力和剩磁。在各种磁介质中最重要的是以铁为代表的一类磁性很强的物质，常用的铁磁质是铁和其他金属或非金属组成的合金，以及某些含铁的氧化物(铁氧体)。 

磁性纳米粒子具有良好的生物相容性，在医学领域有着巨大的应用前景，它不仅可以作为核磁共振造影增强剂用于疾病的诊断，还可以作为药物载体用于疾病的治疗。纳米粒子大的比表面积导致纳米粒子表面原子很活泼，纳米颗粒处于热力学不稳定状态，极易与其他原子结合发生团聚；另外，纳米粒子本身的物理化学性质导致其在生物体内有一定的毒性，所以采用传统方法(如共沉淀方法)制备的磁性纳米材料还不能满足它们在生物体内的应用。于是人们开始用无机材料或有机材料修饰纳米粒子表面，改变粒子表面的结构和物理化学性质。为了达到以下目的：(1)保护纳米粒子，经过修饰后的纳米粒子，其表面存在保护膜，阻止其氧化和团聚，改善粒子的分散性；(2)改善纳米粒子的稳定性和生物相容性；(3)通过引入功能化基团，扩大其在细胞成像、纳米传感器、自组装、生物检测以及药物传输等领域的应用。 

表面改性的方法一般分为物理改性和化学改性两大类，其中表面物理改性是指通过吸附、涂敷、包覆等物理手段对微粒表面进行改性，改性剂主要通过物理作用方式来改善纳米粒子表面；而表面化学改性是指修饰剂分子与纳米粒子表面原子或特殊的官能团发生化学反应，与物理改性法相比，修饰剂与纳米粒子结合更紧密，且在调控纳米粒子大小以及功能性方面具有很大的优势。化学改性包括表面活性剂法和表面接枝聚合法：①常用的表面活性剂有：硅烷类偶联剂、硬脂酸和有机硅等，此方法操作简单；②表面接枝聚合法在接枝手段、接枝聚合物的种类以及可控调节性等方面具有不可比拟的优势，因此成为了改性纳米粒子的重要手段。目前，一般通过活性/可控自由基聚合(CRP)来达到表面接枝的目的，活性/可控自由基聚合包括氧氮稳定自由基聚合(NRP )、原子转移自由基聚合(ATRP) 和可逆加成-断裂转移(RAFT)等。 

发明内容

技术问题：本发明的目的在于提供涉及荧光性质的水溶性磁纳米复合材料的制备方法。本发明首先合成聚合物/磁纳米粒子，然后利用聚合物末端的环氧基官能团开环反应引入氨基，并进一步引入少量的荧光基团。 

技术方案： 本发明的一类具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料由磁纳米中心核和包覆在中心核外的具有荧光性质的水溶性聚合物组成，发光的荧光素位于水溶性聚合物外表面，磁纳米粒子中心核是 Fe、Co或Mn金属的氧化物或它们的复合材料，磁纳米粒子的粒径在1-100 nm之间，且具有单分散性； 

水溶性聚合物为水溶性高分子链，其分子结构为

  n是聚合度，n为30-70，R是均裂离去基团，羧基基团可以与磁纳米粒子结合；

发光的荧光素分子结构为： 

   

磁纳米粒子核为没有生物毒性的Fe₃O₄粒子，磁纳米粒子表面接枝了聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，聚合物末端通过开环反应引入氨基，氨基再和异硫氰酸荧光素上的异硫氰官能团反应引入异硫氰酸荧光素。

本发明的具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料的合成方法具体步骤如下：

一、磁纳米粒子的合成      

以二苄醚为溶剂，以乙酰丙酮铁(Ⅲ)、1，2-十六二醇、油酸和油胺为原料，采用高温溶剂法制备单分散的磁纳米粒子：

具体步骤如下：

将乙酰丙酮铁(Ⅲ)、1，2-十六二醇、油酸和油胺加入二苄醚，氮气保护中磁力搅拌均匀，混合溶液加热到200 ℃ 持续2小时，然后把温度升到300 ℃再加热1小时，反应物冷却至室温，加入少量乙醇，采用离心-溶解-离心的方法得到油酸包裹的磁纳米粒子沉淀；磁纳米粒子经过减压干燥后，保存在冰箱0-4 ℃中备用；

二、RAFT试剂BSPA的合成

将3-巯基丙酸慢慢滴入氢氧化钾溶液，反应20 min后，缓慢加入二硫化碳，溶液变成橘红色，混合物在室温下反应过夜；加入氯化苄后继续回流12小时，停止加热，让溶液自然冷却到室温后加入氯仿，用稀盐酸中和溶液，溶液由橘红色变为黄色，用氯仿萃取两次后合并有机相，分别用饱和氯化钠溶液和去离子水萃取有机相，得到BSPA氯仿溶液；用无水硫酸钠将其干燥过夜，过柱子分离收集产物BSPA，减压干燥后，保存在棕色真空干燥器里备用；

三、磁纳米粒子表面键接RAFT试剂BSPA

通过置换反应将BSPA键接到磁纳米粒子表面：

具体步骤如下：

将油酸包裹的磁纳米粒子和BSPA溶解在正己烷中，室温下氮气保护中强烈搅拌混合均匀，反应过程中溶液出现了黑色的沉淀，将所得的混合物放进离心机，离心后可得到黑色固体即键接BSPA的磁纳米，将产物减压干燥后保存在冰箱0–4 ℃中；

四、聚合物/磁纳米复合材料的合成

通过可逆加成-断裂转移方法在磁纳米表面引发甲基丙烯酸缩水甘油酯单体：

具体步骤如下：

将键入BSPA的磁性纳米粒子、甲基丙烯酸缩水甘油酯单体和和引发剂溶解在四氢呋喃中，70 ℃下氮气保护中反应2小时，反应过程中发现溶液粘度逐渐增大，说明在磁纳米粒子表面引发了甲基丙烯酸缩水甘油酯单体，以乙醇为沉降溶剂进一步纯化聚合物/磁纳米粒子复合材料；

五、具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料的制备

首先利用聚合物中环氧基的开环反应引入氨基，然后伯胺和异硫氰酸荧光素反应，合成了具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料，

具体步骤如下：

1)将聚合物/磁纳米粒子复合材料溶于四氢呋喃，超声混合均匀，然后将此溶液慢慢滴到过量的乙二胺中，室温下反应24小时后，将混合物缓慢滴入丙酮，得到棕褐色的沉淀即含有氨基的磁纳米粒子，产物用去离子水透析一天，冷冻干燥，

2)将含有氨基的磁纳米粒子溶于水，超声混合均匀，然后加入少量的异硫氰酸荧光素FITC，室温下反应24小时后得到具有荧光性质的水溶性的磁纳米复合材料的水溶液，磁纳米复合材料用去离子水透析一天，然后冷冻干燥，将其保存在冰箱0–4 ℃中备用。

有益效果： 本发明通过高温溶剂法，合成磁纳米粒子，利用可逆加成-断裂转移法在其表面引发甲基丙烯酸甘油酯单体，聚合物末端引入氨基，实现水溶性及生物相容性，进一步引入了少量的荧光基团，以便实现在生物体内的检测。 

合成的这种聚合物/磁纳米复合材料具有良好的生物相容性且具有荧光性质。其表面接枝了聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)，PGMA具有很好的生物相容性。通过均聚合或共聚合可制得带有环氧基团的聚合物大分子，又因为环氧基团是活泼的功能基团，可与羧基、羟基和氨基等多种基团反应，因此被广泛应用于功能性高分子材料及生物检测等领域。 

附图说明

图 1  为BSPA的¹H NMR((CD₃)₂SO，400 MHz)， 

图 2  为Fe₃O₄PGMA的¹H NMR(CDCl₃，400 MHz)，

图 3  为Fe₃O₄PGMA-EDA的1H NMR(D2O，400 MHz)，

图 4  为聚合物/磁纳米粒子的透射电子显微镜图，

图 5  为聚合物/磁纳米粒子的动态粒径散射图，

图 6  为Fe₃O₄PGMA-EDA-FITC水溶液的紫外可见吸收光谱和光致发光光谱，

图7是本发明提供的具有荧光性的水溶性聚合物/磁纳米粒子的结构示意图。

图中，

为磁纳米粒子中心核，

为水溶性高分子链，

为发光的荧光素，

图8是本发明制备方法的示意图。

具体实施方式

采用高温溶剂法制备单分散的磁纳米粒子，用可逆加成-断裂转移(RAFT)法在其表面引发甲基丙烯酸甘油酯(GMA)单体，在聚合物末端引入氨基实现水溶性及生物相容性，并且进一步引入了少量的荧光基团。 

本发明提供的具有荧光性的水溶性聚合物/磁纳米粒子的结构图7中： 

为Fe₃O₄磁纳米粒子中心核，磁纳米粒子的尺寸在1-100nm之间，并且具有很好的单分散性；

为水溶性高分子链，其分子结构为：

n是聚合度,n为30-70，羧基基团可以和磁性纳米粒子核相结合；

为发光的荧光素，其分子结构为： 

。

本发明的上述化合物的合成方法如下： 

一、磁纳米粒子的合成      

 以二苄醚为溶剂，以乙酰丙酮铁(Ⅲ)、1，2-十六二醇、油酸(OA)和油胺为原料，采用高温溶剂法制备单分散的磁纳米粒子：

具体步骤如下：

将乙酰丙酮铁(Ⅲ)、1，2-十六二醇、油酸和油胺加入二苄醚，氮气保护中磁力搅拌均匀，将混合溶液加热到200 ℃ 持续2小时，然后把温度升到300 ℃再加热1小时，冷却至室温，加入少量乙醇，出现黑色的沉淀。采用离心-溶解-离心的方法得到油酸包裹的磁纳米粒子，磁纳米粒子经过减压干燥后，保存在冰箱(0-4 ℃)中备用；

二、RAFT试剂BSPA的合成

将3-巯基丙酸慢慢滴入氢氧化钾溶液，反应20 min后，缓慢加入二硫化碳，溶液变成橘红色，混合物在室温下反应过夜。加入氯化苄后继续回流12小时，停止加热，让溶液自然冷却到室温后加入氯仿，用稀盐酸中和溶液，溶液由橘红色变为黄色，用氯仿萃取两次后合并有机相，分别用饱和氯化钠溶液和去离子水萃取有机相，得到BSPA的氯仿溶液。用无水硫酸钠将其干燥过夜，然后过柱子分离收集BSPA，将其减压干燥后，保存在棕色真空干燥器里备用；

三、磁纳米粒子表面键接RAFT试剂BSPA

通过置换反应将RAFT试剂BSPA键接到磁纳米粒子表面：

具体步骤如下：

将油酸包裹的磁纳米粒子和BSPA溶解在正己烷中，室温下氮气保护中强烈搅拌混合均匀，反应过程中溶液出现了黑色的沉淀，将所得的混合物放进离心机，离心后可得到键接BSPA的磁纳米粒子，将产物减压干燥后保存在冰箱(0–4 ℃)中；

四、聚合物/磁纳米复合材料的合成

通过可逆加成-断裂转移方法在磁纳米表面引发甲基丙烯酸缩水甘油酯单体：

具体步骤如下：

将键接BSPA的磁性纳米粒子、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)单体和和引发剂溶解在四氢呋喃中，在70 ℃下氮气保护中反应2小时，反应过程中发现溶液粘度逐渐增大，说明在磁纳米粒子表面引发了甲基丙烯酸缩水甘油酯单体，以乙醇为沉降溶剂进一步纯化聚合物/磁纳米粒子复合材料；

五、具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料的制备

首先利用聚合物中环氧基的开环反应引入氨基，然后伯胺和异硫氰酸荧光素FITC反应，合成了具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料，

具体步骤如下：

1)将聚合物/磁纳米粒子复合材料溶于四氢呋喃，超声混合均匀，然后将此溶液慢慢滴到过量的乙二胺中，室温下反应24小时后，反应完全后将混合物缓慢滴入丙酮，得到棕褐色的沉淀(含有氨基的磁纳米)，产物用去离子水透析一天，冷冻干燥，

2)将引入氨基的磁纳米复合材料溶于水，超声混合均匀，然后加入少量的异硫氰酸荧光素FITC，室温下反应24小时后，混合物用去离子水透析一天，然后冷冻干燥得到具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料，将其保存在冰箱(0–4 ℃)中备用。

为了更好地理解本发明，下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。 

实施例、具有荧光性质的水溶性Fe₃O₄PGMA-EDA-FITC的合成 

一、磁纳米粒子的合成

  具体步骤如下：

将1，2-十六二醇 (6.461 g， 25 mmol)，油酸(4.761 mL，15 mmol)，油胺 (4.012 g，4.935 mL，15 mmol)，乙酰丙酮铁(III) (1.766 g，5 mmol) 和二苄醚 (50 mL) 依次加入到三口烧瓶(250 mL)中，室温下氮气保护中强烈搅拌半小时。把温度升到200 ^oC加热2小时，然后升温到300 ℃再加热1小时。移走加热套后让混合溶液自然冷却到室温，将乙醇(100 mL)加入到混合物中，瞬间产生了黑色沉淀，通过离心-溶解-离心的方法得到油酸包裹的磁纳米粒子(Fe₃O₄OA)，减压干燥后将其保存在冰箱(0–4℃)中。

二、RAFT试剂BSPA的合成 

具体步骤如下：

将氢氧化钾(2.6 g)溶于水(25 mL)配成氢氧化钾溶液，3-巯基丙酸(2 mL，23mmol)慢慢滴入氢氧化钾溶液中，反应20 min后，加入二硫化碳(3 mL，31 mmol)溶液变成橘红色，混合物在室温下反应过夜。向反应物中加入氯化苄(3.96 g，23 mmol)后继续回流12 小时，停止加热，当溶液温度降到室温时加入氯仿(30 mL)，用稀盐酸中和溶液，溶液由橘红色变为黄色。用氯仿(20 mL)萃取水相两次合并有机相，再分别用饱和氯化钠溶液(20 mL)和去离子水(20 mL)萃取有机相，得到了BSPA的氯仿溶液。用无水硫酸钠将其干燥过夜，过柱子淋洗剂为正己烷/乙酸乙酯(v：v=3:1)，分离收集RAFT试剂BSPA。将其真空干燥后，保存在棕色真空干燥器里备用。¹H NMR((CD₃)₂SO，400 MHz)： δ (ppm) = 7.29-7.38 (5H)， δ (ppm) = 4.66 (2H)， δ (ppm) =3.52 (2H)，δ (ppm) =2.66(2H)。

三、磁纳米表面键接RAFT试剂BSPA 

具体步骤如下：

将油酸包裹的磁纳米粒子(100 mg)和BSPA(50 mg )溶解在正己烷(2 mL)中，室温下氮气保护中反应24小时，溶液中出现了黑色的沉淀，由此可知通过简单的配体交换成功地将RAFT剂BSPA键接到磁纳米粒子表面。将所得的混合物放进离心机，转速为6000 r/min，离心4 min，可以得到黑色固体。然后用正己烷淋洗，此过程重复三遍，可以除掉多余的RAFT剂BSPA和其他杂质，将键接RAFT试剂的磁纳米复合材料(Fe₃O₄BSPA)减压干燥后保存在冰箱(0–4℃)中。

四、用RAFT法在磁纳米粒子表面引发甲基丙烯酸缩水甘油酯单体 

具体步骤如下：

将Fe₃O₄BSPA(100 mg)和GMA(32.7 mg，0.2 mmol)和V-501(6.44 mg，0.023 mmol)溶解在四氢呋喃(5 mL)中，于70 ℃氮气保护中反应2小时，反应过程中发现溶液粘度逐渐增大，现象表明用RAFT法可以在磁纳米粒子表面引发甲基丙烯酸缩水甘油酯单体(Fe₃O₄PGMA)，并用乙醇溶剂沉降进一步纯化聚合物。¹H NMR(CDCl₃，400 MHz)：δ (ppm) =3.80-4.31 (2H)，δ (ppm) =3.24(1H), δ (ppm) =2.64-2.85 (2H)，δ (ppm) = 1.90(1H)，δ (ppm) = 0.94-1.10 (2H)。

五、具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料的制备 

具体步骤如下：

1)首先将Fe₃O₄PGMA (100 mg) 加入到四氢呋喃(5 mL)中且超声2 min，此溶液慢慢滴入乙二胺(EDA，5 mL)中，室温下反应24小时，反应完全后将混合物慢慢滴入丙酮 (50 mL) 中，得到棕褐色的沉淀(Fe₃O₄PGMA-EDA)。产物用去离子水透析一天，冷冻干燥后保存在冰箱(0–4℃)中备用。¹H NMR(D₂O，400 MHz)：δ (ppm) =3.91 (3H)，δ (ppm) =2.73-2.91(6H), δ (ppm) =0.70-1.10 (3H)， 

2)将Fe₃O₄PGMA-EDA(100 mg)溶于水(5 mL)且超声2 min，然后加入异硫氰酸荧光素(20 mg) ，室温下反应24 小时 ，用去离子水将所得的混合物透析一天，冷冻干燥得到棕褐色的沉淀(Fe₃O₄PGMA-EDA-FITC)，将其保存在冰箱(0–4℃)中。

Claims (3)

1.一类具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料，其特征在于该复合材料由磁纳米中心核和包覆在中心核外的具有荧光性质的水溶性聚合物组成，发光的荧光素位于水溶性聚合物外表面，磁纳米粒子中心核是 Fe、Co或Mn金属的氧化物或它们的复合材料，磁纳米粒子的粒径在1-100 nm之间，且具有单分散性；

水溶性聚合物为水溶性高分子链，其分子结构为

  n是聚合度，n为30-70，R是均裂离去基团，羧基基团可以与磁纳米粒子结合；

发光的荧光素分子结构为： 

   。

2.根据权利要求1所述的具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料，其特征在于：

磁纳米粒子核为没有生物毒性的Fe₃O₄粒子，磁纳米粒子表面接枝了聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，聚合物末端通过开环反应引入氨基，氨基再和异硫氰酸荧光素上的异硫氰

官能团反应引入异硫氰酸荧光素。

3.一种如权利要求1所述的具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料的合成方法，其特征在于具体步骤如下：

一. 磁纳米粒子的合成   

以二苄醚为溶剂，以乙酰丙酮铁(Ⅲ)、1，2-十六二醇、油酸和油胺为原料，采用高温溶剂法制备单分散的磁纳米粒子：

具体步骤如下：

将乙酰丙酮铁(Ⅲ)、1，2-十六二醇、油酸和油胺加入二苄醚，氮气保护中磁力搅拌均匀，混合溶液加热到200 ℃ 持续2小时，然后把温度升到300 ℃再加热1小时，反应物冷却至室温，加入少量乙醇，采用离心-溶解-离心的方法得到油酸包裹的磁纳米粒子沉淀；磁纳米粒子经过减压干燥后，保存在冰箱0-4 ℃中备用；

二.  RAFT试剂BSPA的合成

将3-巯基丙酸慢慢滴入氢氧化钾溶液，反应20 min后，缓慢加入二硫化碳，溶液变成橘红色，混合物在室温下反应过夜；加入氯化苄后继续回流12小时，停止加热，让溶液自然冷却到室温后加入氯仿，用稀盐酸中和溶液，溶液由橘红色变为黄色，用氯仿萃取两次后合并有机相，分别用饱和氯化钠溶液和去离子水萃取有机相，得到BSPA氯仿溶液；用无水硫酸钠将其干燥过夜，过柱子分离收集产物BSPA，减压干燥后，保存在棕色真空干燥器里备用；

三. 磁纳米粒子表面键接RAFT试剂BSPA

通过置换反应将BSPA键接到磁纳米粒子表面：

具体步骤如下：

将油酸包裹的磁纳米粒子和BSPA溶解在正己烷中，室温下氮气保护中强烈搅拌混合均匀，反应过程中溶液出现了黑色的沉淀，将所得的混合物放进离心机，离心后可得到黑色固体即键接BSPA的磁纳米，将产物减压干燥后保存在冰箱0–4 ℃中；

四.  聚合物/磁纳米复合材料的合成

通过可逆加成-断裂转移方法在磁纳米表面引发甲基丙烯酸缩水甘油酯单体：

具体步骤如下：

将键入BSPA的磁性纳米粒子、甲基丙烯酸缩水甘油酯单体和和引发剂溶解在四氢呋喃中，70 ℃下氮气保护中反应2小时，反应过程中发现溶液粘度逐渐增大，说明在磁纳米粒子表面引发了甲基丙烯酸缩水甘油酯单体，以乙醇为沉降溶剂进一步纯化聚合物/磁纳米粒子复合材料；

五.  具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料的制备

首先利用聚合物中环氧基的开环反应引入氨基，然后伯胺和异硫氰酸荧光素反应，合成了具有荧光性质的水溶性磁纳米复合材料，

具体步骤如下：

1)将聚合物/磁纳米粒子复合材料溶于四氢呋喃，超声混合均匀，然后将此溶液慢慢滴到过量的乙二胺中，室温下反应24小时后，将混合物缓慢滴入丙酮，得到棕褐色的沉淀即含有氨基的磁纳米粒子，产物用去离子水透析一天，冷冻干燥，

2)将含有氨基的磁纳米粒子溶于水，超声混合均匀，然后加入少量的异硫氰酸荧光素FITC，室温下反应24小时后得到具有荧光性质的水溶性的磁纳米复合材料的水溶液，磁纳米复合材料用去离子水透析一天，然后冷冻干燥，将其保存在冰箱0–4 ℃中备用。

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