CN102643833B - 晶胞粘连控制基因簇的克隆及在防止晶体降解中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体公开了一种来自于苏云金芽胞杆菌幕虫亚种YBT-020晶胞粘连控制基因簇的分离、克隆及其在防止晶体降解中的作用。本发明从具有典型晶胞粘连表型的苏云金芽胞杆菌YBT-020中克隆得到控制其晶胞粘连表型的基因簇，共有5个基因组成，其编码的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2-6所示。该基因簇和晶体蛋白基因cry26Aa在无晶体突变株BMB171中共表达时，可以使晶体形成在芽胞外壁的内侧；当母细胞裂解后，由于晶体被芽胞外壁包裹，可以有效的抑制晶体蛋白的降解。

Description

晶胞粘连控制基因簇的克隆及在防止晶体降解中的应用

技术领域

本发明属农业微生物基因工程技术领域。具体涉及晶胞粘连表型控制基因簇的分离、克隆以及它编码的产物在防止晶体蛋白降解中的应用，本发明还与微生物农药技术领域相关。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在于各种生态环境中的革兰氏阳性杆状细菌。该物种最大的特点就是在其生长周期中能形成内生芽胞的休眠体，并且在其芽胞形成的同时能产生对许多昆虫具有特异毒性的由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)组成的伴胞晶体。这些杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物门、扁形动物门中某些有害种类也有特异的生物活性(Schnepf H E，Crickmore N，Rie J V，Lereclus D，BaumJ，Feitelson J，Zeigler D R，Dean D H.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.MicrobiolMol Biol Rev，62：775-806)。由于苏云金芽胞杆菌对多种昆虫都有很高的杀虫活性，而且具有对环境和人蓄无损害等优点，因此被广泛地应用于生物农药的开发。目前，基于苏云金芽胞杆菌开发的生物杀虫剂已经成为最成功的一种生物农药，占到了整个生物农药行业90％以上的市场，广泛地应用于农业、林业和仓储等害虫的防治。

B.thuringiensis的伴胞晶体是在芽胞形成期(sporulation)合成并累积而成。芽胞的形成可分为7个时期，一般在芽胞形成的第二期晶体蛋白开始表达，随着芽胞的进一步发育，晶体蛋白逐渐累积，并形成具有晶格结构的伴胞晶体。当芽胞成熟以后，母细胞自溶，释放出芽胞和伴胞晶体。在绝大多数B.thuringiensis中，伴胞晶体是在母细胞中形成的，在空间上与芽胞无关。一旦芽胞成熟并且细胞自溶后，芽胞和伴胞晶体都释放出来，彼此相互独立。在少数B.thuringiensis的亚种中，芽胞成熟母细胞自溶后，伴胞晶体和芽胞彼此不分离，光学显微镜镜下观察两者是粘连在一起的(简称晶胞粘连)，例如幕虫亚种(Ji F，Zhu Y，Ju S，ZhangR，Yu Z，Sun M.2009.Promoters of crystal protein genes do not control crystal formation inside exosporium ofBacillus thuringiensis ssp.finitimus strain YBT-020.FEMS Microbiol Lett，300(1)：11-17)。

蜡状芽胞杆菌群(包括蜡状芽胞杆菌(B.cereus，简称Bc)、炭疽芽胞杆菌(B.anthracis，简称Ba)和苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis，简称Bt))与B.subtilis相比，其芽胞结构有一个明显的差异，前者在芽胞衣(coat)外还有一层芽胞外壁(exosporium)(Henriques A O，Moran C P Jr 2007.Structure，assembly，andfunction of the spore surface layers.Annu Rev Microbiol，61：555-588)。大多数B.thuringiensis的伴胞晶体是在芽胞外壁外侧形成的，而幕虫亚种的伴胞晶体则在芽胞外壁和芽胞衣之间形成，从而导致晶胞粘连表型的产生。

目前，苏云金芽胞杆菌应用主要包括两个途径，一种是将苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因转入植物中，构建转基因植物，用于农业害虫的防治(Pigott CR and Ellar DJ.2007.Role of receptors in Bacillusthuringiensis crystal toxin activity.Microbiol Mol Biol Rev 71：255-281)；另一种是做成可以在环境中释放的生物杀虫剂。在户外使用过程中，由于晶体蛋白本身对紫外线敏感，在环境中容易被降解掉从而降低杀虫的活性。让杀虫晶体蛋白定位于芽胞外壁的内侧，制成生物囊杀虫剂，是一种具有潜力的防止晶体过快降解的方法；当母细胞裂解后形成晶胞粘连，在环境中释放时由于受到芽胞外壁的保护，可以延长作用时间。对于晶胞粘连机制的研究为这种设想可以提供理论基础。

晶胞粘连表型被鉴定出来已有半个世纪之久(Hannay C L.1961.Fowler′s bacillus and its parasporal body.J Biophys Biochem Cytol，9：285-298.)，Debro等通过质粒消除和接合转移实验证明晶胞粘连表型和一个大小约98MDa的质粒紧密连锁，因此他们推测这个质粒包含了控制晶胞粘连表型所需的所有基因，在这个菌株中粘连的晶体主要由大小135kDa的晶体蛋白组成(Debro L，Fitz-James P C，Aronson A.1986.Two differentparasporal inclusions are produced by Bacillus thuringiensis subsp.finitimus.J Bacteriol，165：258-268)。在苏云金芽胞杆菌幕虫亚种B-1166VKPM菌株中共克隆到两类晶体蛋白基因cry26Aa1和cry28Aa1，分别编码大小约1163和1109个氨基酸(Wojciechowska J A，Lewitin E，Revina L P，Zalunin I A，Chestukhina G G.1999.Twonovel delta-endotoxin gene families cry26 and cry28 from Bacillus thuringiensis ssp.finitimus.FEBS Lett，453：46-48)。Vidal-Quist等在对西班牙一个果园生境中分离纯化得到的芽胞杆菌表型镜检观察发现，在分离的376株芽胞杆菌中有25株表象出晶胞粘连表型，这25株菌的晶胞粘连表型可以分成4个类型，通过SDS-PAGE显示每种类型都有不同的晶体蛋白构成(Vidal-Quist J C，Castanera P，Gonzalez-Cabrera J.2009.Diversity of Bacillus thuringiensis strains isolated from citrus orchards in Spain and evaluation of theirinsecticidal activity against Ceratitis capitata.J Microbiol Biotechnol，19：749-759)。这说明晶胞粘连表型涉及的晶体蛋白具有多样性。

Aronson(Aronson A.2002.Sporulation and delta-endotoxin synthesis by Bacillus thuringiensis.Cell MolLife Sci，59：417-425)曾提出两种机制来解释这种现象：第一种假设是晶体和芽胞外壁的表达在时空上的一致性；另一种是在质粒上的基因编码的蛋白质通过蛋白的相互作用将晶体蛋白定位在芽胞外壁的内侧。

到目前为止，控制晶体定位于芽胞外壁内侧的基因还没有被报道。

发明内容

本发明对具有典型晶胞粘连表型的苏云金芽胞杆菌菌株YBT-020为研究对象开展了相关研究，目的在于克服现有技术的不足，获得控制晶胞粘连表型的基因簇。

本发明在异源宿主BMB171中表达晶胞粘连控制基因簇和晶体蛋白基因cry26Aa，使该菌株产生晶胞粘连表型，从而抑制了Cry26Aa形成的晶体的降解。

上述基因簇来源于苏云金芽胞杆菌幕虫亚种菌株YBT-020(菌株来源参见文献：Ji F，Zhu Y，Ju S，Zhang R，Yu Z，Sun M.2009.Promoters of crystal protein genes do not control crystal formation insideexosporium of Bacillus thuringiensis ssp.finitimus strain YBT-020.FEMS Microbiol Lett，300(1)：11-17)，该菌株具有典型晶胞粘连表型，所必需的基因簇定位在内生大质粒pBMB28上，共有5个基因组成。在异源宿主BMB171通过形成晶胞粘连表型使晶体产生于芽胞外壁的内侧，可以有效的防止晶体蛋白Cry26Aa组装形成的伴胞晶体的降解。

本发明的技术方案是这样的：

申请人通过质粒消除方法证明晶胞粘连表型和内生质粒pBMB28连锁关系，通过片段互补实验，从构建的YBT-020穿梭基因组BAC文库中筛选到一个35kb片段可以在质粒突变株BMB1150中恢复晶胞粘连表型。通过片段缺失，最终找到一个7kb的片段是控制晶胞粘连的必需区域，申请人将这个片段命名为pBMB251B2。该片段包含一个由5个基因组成的基因簇，申请人将其分别命名为orf1，orf2，orf3，orf4和orf5基因，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。该基因簇编码的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQID NO：2-6所示。其大小和编码蛋白质的性质如下：控制基因orf1编码300个氨基酸，orf2编码268个氨基酸，这两个蛋白分别于晶体蛋白ND40KD和ND32KD有比较低的序列一致性；orf3编码480个氨基酸，orf4编码367个氨基酸，or5编码376个氨基酸，这三个蛋白和芽胞萌发蛋白有一定的一致性；orf1和orf2组成一个操纵子共表达，orf3，orf4和orf5组成一个操纵子共表达。

晶体蛋白Cry26Aa在异源宿主BMB171中组装形成的游离伴胞晶体容易被降解，本发明提供的上述5个基因与cry26Aa共转化BMB171中可以使形成的伴胞晶体定位于芽胞外壁内侧，当母细胞裂解后，由于受到芽胞外壁的保护，可以有效的防止伴胞晶体降解。为通过改造构建工程菌，将其他种类的杀虫晶体蛋白定位于芽胞外壁内侧，制成生物囊杀虫剂，提供了理论基础和很好的范例。

本发明还提供了利用穿梭BAC文库筛选控制晶胞粘连表型基因簇的方法，本方法具有一定的示范性。

更详细的技术方案参考实施例部分的描述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离和克隆的晶胞粘连控制基因簇的核苷酸序列(基因orf1的核苷酸序列为703-1605bp；基因orf2的核苷酸序列为1707-2513bp；基因orf3的核苷酸序列为2878-4320bp；基因orf4的核苷酸序列为4313-5416bp；基因orf5的核苷酸序列为5413-6543bp)，本基因簇序列全长为7006bp。

序列表SEQ ID NO：2-6是晶胞粘连控制基因簇中5个基因编码的氨基酸序列。其中：控制基因orf1编码300个氨基酸，其如序列表SEQ ID NO：2所示；基因orf2编码268个氨基酸，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：3所示；基因orf3编码480个氨基酸，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示；基因orf4编码367个氨基酸，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示；基因or5编码376个氨基酸，其核苷酸序列如序列表SEQID NO：6所示。

图1：本发明的技术流程图

图2：本发明实施例中质粒消除突变株的镜检表型；其中图2A：质粒突变株BMB1150；图2B：质粒突变株BMB1151；图2C：菌株YBT-020。

图3：是本发明实施例中质粒pBMB251B2的构建过程。

图4：是本发明实施例中控制晶胞粘连必需基因簇的结构图。

图5：是本发明实施例中显微观察Cry26Aa在BMB171的形成晶体及恢复晶胞粘连的表型；其中

图5A和图5B：BMB171中含有cry26Aa基因，培养36h和120h；图5C：BMBSCA(BMB171中含有晶胞粘连基因簇和cry26Aa基因)培养时间为120h。

图6：是本发明实施例中cry26Aa在BMB171中表达SDS-PAGE检测；其中泳道1-6分别是培养24h，48h，72h，94h和120h提取晶体蛋白；M为200kDa蛋白Marker。

具体实施方案

以下叙述是根据本发明实施方案的实施例，详细实验流程参照图1。应当说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。有关DNA的标准操作方法和所使用的药品或试剂均参考J.萨姆布鲁克等著的《分子克隆实验指南》所描述的内容(参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

实施例1 晶胞粘连控制基因簇的定位

1、苏云金芽胞杆菌YBT-020菌株质粒消除突变株的筛选

苏云金芽胞杆菌YBT-020菌株共包含两个质粒，命名为pBMB26和pBMB28(质粒来源参见文献：Ji F，Zhu Y，Ju S，Zhang R，Yu Z，Sun M.2009.Promoters of crystal protein genes do not control crystal formationinside exosporium of Bacillus thuringiensis ssp.finitimus strain YBT-020.FEMS Microbiol Lett，300(1)：11-17)。利用逐级升温培养的方法消除质粒共获得了2株质粒消除的突变株：其中消除质粒pBMB26的突变株命名为BMB1151(菌株来源参见文献：Jv S Y，Ji F，Zhu Z M，Yu Z N，Sun M，Tang Z G，Zhang R.2007.Theplasmid harboring cry26Aa may contribute to the phenomenon of spore-crystal connection in Bacillusthuringiensis subsp.finitimus.Wei Sheng Wu Xue Bao，47(1)：88-91)；消除了质粒pBMB28的突变株命名为BMB1150。对这两株突变株镜检观察发现BMB1150产生游离的晶体，晶胞粘连表型丢失(图2A)；而BMB1151由于没有晶体产生(图2B)。质粒消除实验证明晶胞粘连控制基因位于pBMB28上。

质粒消除的具体操作方法是：将苏云金芽胞杆菌菌株YBT-020在LB(1L LB培养基配制：蛋白胨10g；酵母粉5g；NaCl 10g；pH 7.0-7.2)平板上划线分离单菌落。取单菌落接种于LB培养液，在30℃培养至对数生长中期，以1/100接种量(v/v)转接于SCG培养液(1L SCG培养基配制：酸水解酪素1g；葡萄糖5g；(NH₄)₂SO₄ 2g；K₂HPO₄ 1.4g；KH₂PO₄ 5g；柠檬酸钠1g；MgSO₄ 0.2g；pH 7.0-7.2)中，在42℃以200r/min的转速培养，每隔12h转接1次，连续转接10次后，梯度稀释涂布SCG平板，置42℃培养。从中取单菌落点种于SCG平板上，在42℃温箱中培养。每隔48h取其菌落的边缘部分点种于下一个SCG平板。将部分经过42℃处理后的菌株，点种于SCG平板上继续升温至44℃培养，每隔48h取其菌落的边缘部分点种于下一个SCG平板，抽提质粒并用电泳检测质粒是否消除。

实施例2 晶胞粘连控制基因簇的克隆

1.苏云金芽胞杆菌菌株YBT-020基因组穿梭BAC文库的构建

(1)外源DNA片段的制备

挑取苏云金芽胞杆菌菌株YBT-020单菌落接于5mL灭过菌的LB培养基中，28℃培养过夜。次日按1％体积的接种量转接于100mL去离子水配的灭菌的LB培养基中，于28℃培养3-4h，使OD₆₀₀达到0.2。在10,000rpm离心，收集菌体于无菌的50mL离心管中，用等体积的TE缓冲液洗涤2次。TE25S缓冲液配制1％的低熔点琼脂糖凝胶，冷却至50℃，将菌体重悬于2mL凝胶中。用50℃凝胶将凝胶菌悬液按照2倍，4倍，6倍，8倍，10倍分别稀释。各个稀释度分别浇灌模具，制备菌体凝胶包埋块。

将包埋块浸在TE25S缓冲液(1L缓冲液配制：蔗糖，102.7g；0.5M EDTA，50mL；1M Tris-Cl，5mL，pH 8.0)中，加终浓度2mg/mL的溶菌酶，于4℃处理24h，去细胞壁。除掉TE25S缓冲液，用NDS缓冲液(1L缓冲液配制：0.5M EDTA，100mL；1M Tris-Cl，10mL；十二烷基硫酸钠(SDS)，10g，pH 8.0)洗涤包埋块，10mL/次，洗涤3次。将包埋块浸在NDS缓冲液中，加入终浓度1mg/mL的蛋白酶K，放于50℃水浴锅中处理48h，去蛋白。除掉NDS缓冲液，用T₁₀E₁₀缓冲液(1L缓冲液配制：0.5M EDTA，20mL；1M Tris-Cl，10mL，pH 8.0；在121℃高压蒸汽灭菌30min)洗涤3次，然后将包埋块转入另一个50mL的离心管中，用含0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的T₁₀E₁₀缓冲液洗涤5次，每次10mL、1h，并置冰上操作。洗涤好的包埋块可以直接酶切，或置于4℃下保存7天以上，或浸泡于70％浓度的乙醇中置-20℃保存2个月以上。

脉冲电泳(1％凝胶，起始脉冲1，终止脉冲25，电压6V/cm，转换角度120°，电泳时间24h)检测包埋块DNA的含量，选取稀释度合适的包埋块。每个包埋块用500μL Buffer M(1L缓冲液配制：1M Tris-Cl，100mL；1M MgCl₂ 100mL；0.1M二硫苏糖醇(DTT)，100mL；5M NaCl 100mL)浸泡，置冰上2h。除掉Buffer M，更换新鲜的Buffer M，每块包埋块分别用0.2U、0.5U、1U、2U、5U、10U HindIII的酶量设置500μL的酶切体系，置冰上30min，然后于37℃温育30min。酶切后用0.5M的EDTA终止反应。脉冲电泳检测酶切产物的大小，确定反应体系及目标片段(75-100kb)的泳动位置。放大反应体系，脉冲电泳，在凝胶上对应的位置切取目标片段。将含有目标片段的凝胶通过透析袋电泳(TAE缓冲液，电压6V/cm，电泳时间2h)回收目标DNA，存于-20℃保存待用。

(2)穿梭BAC载体的制备

接种含有穿梭BAC质粒pEMB0557的大肠杆菌(菌株来源参见文献：Liu X，Peng D，Luo Y，Ruan L，YuZ，Sun M.2009.Construction of an Escherichia coli to Bacillus thuringiensis shuttle vector for large DNAfragments.Appl Microbiol Biotechnol，82(4)：765-772)于LB培养基中，加终浓度25μg/mL的氯霉素，37℃培养过夜。收集菌体，利用小量碱法抽取质粒(质粒抽提方法参见文献：Andrup L，Damgaard J，WassermannK.1993.Mobilization of small plasmids in Bacillus thuringiensis subsp.israelensis is accompanied by specificaggregation.J Bacteriol，175(20)：6530-6536)。抽提的pEMB0557载体用限制性内切酶HindIII完全酶切(酶切位点见图3)。酶切后的反应体系于65℃处理10min，使酶失活。在已有的体系中按照1μg质粒加5U CIAP的酶量添加碱性磷酸酶，于37℃温育1h，然后用苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25∶24∶1)抽提两次。

脉冲电泳(1％凝胶，起始脉冲1，终止脉冲15，电压4.5V/cm，转换角度120°，电泳时间18h)检测去磷酸化后的载体。用溴化乙啶(EB)染色的时候只切取一部分凝胶染色，用干净的刀片在凝胶上切刻，标下载体(11.4kb)的位置。在另外没有染色的凝胶上对应位置切下含有载体的凝胶，通过透析袋电泳(TAE缓冲液，电压6V/cm，电泳时间2h)回收载体。回收的载体按照1μgDNA用1U T4DNA连接酶的量设置连接体系，16℃连接过夜。脉冲电泳分离样品，切取含有载体(11.4-kb线状DNA)的凝胶，透析袋电泳回收，存于-20℃待用。

(3)大肠杆菌电转化感受态细胞的制备

接种大肠杆菌菌株DH10B单菌落于5mL SOB培养基(1L SOB培养基配制：蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl 0.5g，0.25M KCl，10mL；2M MgCl₂，5mL)中，37℃培养过夜。按1％体积的接种量将培养好的大肠杆菌DH10B菌株转接于100mL SOB培养基中，37℃培养3h左右，使OD600值达到0.6。将培养液迅速置冰上冷却，然后4℃，4000rpm离心10min收集菌体。用10％浓度的预冷的甘油洗涤菌体3次，第一次用与培养基等体积的甘油，后两次用与培养基一半体积的甘油。菌体重悬于2mL 10％浓度预冷的甘油中，分装成50μL每管，速冻，保藏于-70℃备用。以上操作需在严格无菌条件的下于4℃恒温室完成。感受态细胞涂布含有终浓度12.5μg/mL氯霉素的LB平板，检测细胞是否被污染。

(4)连接与转化

用制备的穿梭BAC载体pEMB0557连接λDNA HindIII酶切片段，电击转化(电压12.5kv/cm)制备的大肠杆菌菌株DH10B感受态细胞，检测载体和感受态细胞的效率。按照外源(λDNA HindIII酶切片段)与载体摩尔比为10∶1的比例设置连接体系，于16℃连接过夜。用去离子水配制含有0.1M葡萄糖的1％的凝胶，熔胶，制备带有可容纳50μL液体的凹槽的凝胶柱。将连接体系置于凹槽中，4℃放置2h，除去连接体系中的盐份。取2μL的连接产物与50μL感受态细胞混合，电击转化(电压2.5kv/cm)，然后迅速加入预热的SOC培养基(100ml SOB培养基中加入1M葡萄糖20ml；Luo M Z，Wing R A.An improvedmethod for plant BAC library construction.In：Grotewold E eds.，Methods in Molecular Biology.Totowa，NJ：Humana Press，2003)，37℃恢复培养40min。在含有12.5μg/mL氯霉素的LB平板表面涂布5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(每个直径9cm的平皿涂布和)，将恢复培养液涂布平板，37℃培养16h。挑取白色单菌落，保存。

(5)文库的筛选与保存

随机挑取白色单菌落，接种于5mL LB培养基中，添加终浓度12.5μg/mL的氯霉素，37℃培养过夜。收集菌体，用小量减法(文献同前)提取质粒。用限制性内切酶NotI和HindIII分别酶切BAC转化子，脉冲电泳检测插入片段的长度。将插入片段大小合适，阳性率高的批次的转化子大量挑取，于含有20％浓度的甘油和12.5μg/mL的氯霉素的LB培养基中，用细胞培养板96孔板(200μL培养液/孔)静置培养24h。培养好的菌悬液用液氮速冻，然后置-80℃保存。

2.覆盖pBMB28全长克隆子的筛选

从苏云金芽胞杆菌YBT-020中克隆到晶体蛋白基因cry28Aa，经过southern杂交证明cry28Aa定位在约140kb质粒pBMB28上(参见：Ji F，Zhu Y，Ju S，Zhang R，Yu Z，Sun M.2009.Promoters of crystal proteingenes do not control crystal formation inside exosporium of Bacillus thuringiensis ssp.finitimus strain YBT-020.FEMS Microbiol Lett，300(1)：11-17)。设计引物：PL-t28：GGCGAATTTATCACTCAC；PR-t28；CGCGAATTTAATAGCATGGA，从文库中筛选出含有cry28Aa基因的BAC克隆子进行末端测序，用测序获得的末端序列设计如下的引物对，该引物对的核苷酸序列如下所示：

引物p28-1：GGGATAAGCTCACCCTAACA；

引物p28-2：TTCCTGAGCTTTTGAGGTGG。

引物p28-3：GCCAACTCTGTAAGGAAGC；

引物p28-4：CATCTATTTGTTCCGCCAATG。

在文库中进行第二轮筛选，筛选能覆盖第一轮末端序列的BAC克隆子，以此继续，通过几个BAC克隆子就可以获得覆盖质粒全长。最终，筛选到4个穿梭BAC克隆子覆盖pBMB28全长。

3.在BMB1150中恢复表达晶胞粘连表型

质粒消除实验证明控制晶胞粘连的基因位于质粒pBMB28上，在质粒消除实验中获得了质粒pBMB28消除突变株BMB1150，以该菌株BMB1150为受体菌，将覆盖pBMB28的4个克隆子分别电转化BMB1150，寻找pBMB28上控制晶胞粘连的区域。

具体方法是：

(1)质粒pBMB28中控制晶胞粘连区域的确定

将4个覆盖pBMB28的克隆子分别电转入BMB1150中，镜检观测表型显示只有一个克隆子包含约35kb的片段可以恢复晶胞粘连表型，申请人将该含有该片段的重组质粒命名为pBMB251(物理图谱见图3)。通过片段互补实验，确定了pBMB28上决定晶胞粘连的区域。电转化苏云金芽胞杆菌的方法参考Peng D等发表的文献报道的方法(Peng D，Luo Y，Guo S，Zeng H，Ju S，Yu Z，Sun M.2009.Elaboration of anelectroporation protocol for large plasmids and wild-type strains of Bacillus thuringiensis.J Appl Microbiol，106(6)：1849-1858)

(2)控制晶胞粘连表型必需基因的确定

为了确定控制晶胞粘连表型的必需基因，对35kb进行截短，连接到载体pHT304上(质粒来源参见文献：Arantes O，Lereclus D.1991.Construction of cloning vectors for Bacillus thuringiensis.Gene.108(1)：115-119)最终确定一个约7kb的片段为控制晶胞粘连的最小区域，申请人将包含该片段的重组质粒命名为pBMB251B2(质粒构建过程及物理图谱见图3)。该片段包含5个必需基因，申请人将其命名为orf1-orf5，基因组成见图4。其中orf1和orf2和晶体蛋白基因有较低的序列一致性，orf3-orf5和芽胞萌发基因有序列一致性。各基因具体序列信息见表1所述。

表1 本发明的晶胞粘连必需基因比对分析

实施例3 在异源宿主BMB171验证晶胞粘连基因簇的功能

将克隆到的晶体蛋白基因cry26Aa在BMB171中可以表达形成伴胞晶体，但镜检发现其晶体容易降解。将控制晶胞粘连的基因簇和cry26Aa基因在BMB171中共表达，可以使形成的晶体位于芽胞外壁的内侧，形成晶胞粘连现象，从而抑制了晶体的降解。具体的方法是：

(1)在BMB171中异源表达晶体蛋白基因Cry26Aa。

将克隆到的晶体蛋白基因cry26Aa电转入无晶体突变株BMB171(菌株来源参见文献：He J，Shao X，Zheng H，Li M，Wang J，Zhang Q，Li L，Liu Z，Sun M，Wang S，Yu Z.2010.Complete genome sequence ofBacillus thuringiensis mutant strain BMB171.J Bacteriol，192(15)：4074-4075)，镜检观察其编码的蛋白组装形成游离的晶体(图5A)，而随着培养时间的延长，晶体逐渐被降解，到120h后基本看不到晶体的存在(图5B)。SDS-PAGE检测显示，随着培养时间的推移，晶体蛋白逐渐被降解成85kDa左右的蛋白条带(见图6)。由此可见，Cry26Aa形成的蛋白易被蛋白酶降解是其产生的晶体不稳定的原因。

(2)晶胞粘连必需基因簇和cry26Aa在BMB171中共表达

由于Cry26Aa形成晶体的不稳定是由于蛋白容易被蛋白酶降解造成的，当晶体以晶胞粘连的形式存在，受到芽胞外壁的保护就有可能免受蛋白酶的降解，可以长期稳定存在。为了验证这种想发的可行性，将从YBT-020中克隆到的的晶胞粘连必需的5个基因(orf1-orf5)和cry26Aa基因共转化BMB171，申请人将获得的该重组菌株命名为BMBSCA(该菌株已于2011年1月24日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2011036)。镜检表明当晶胞粘连必需基因即orf1-orf5和cry26Aa共表达后，本发明的重组菌株BMBSCA形成晶胞粘连表型。由于伴胞晶体受到芽胞外壁的保护，免受蛋白酶的降解，经过120h培养后，与晶体蛋白基因cry26Aa单独在BMB171菌株中表达比较，本发明的重组菌株BMBSCA伴胞晶体仍然已稳定的状态存在(见图5C)。

总而言之，本发明克隆的控制晶胞粘连基因，可以在外源宿主中重现晶胞粘连现象，由于伴胞晶体被定位在芽胞外壁的内侧，当母细胞裂解后，由于受到芽胞外壁的保护，可以免受蛋白酶的降解，从而可以维持晶体的稳定。本发明为制备微生物杀虫剂例如生物囊杀虫剂提供理想的范例，展现出广泛的应用前景。

Claims (4)

1.晶胞粘连表型控制的基因簇，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其中：

orf1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中第703-1605位所示；

orf2基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中第1707-2513位所示；

orf3基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中第2878-4320位所示；

orf4基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中第4313-5416位所示；

orf5基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中第5413-6543位所示。

2.晶胞粘连表型控制的基因簇编码的蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2-6所示。

3.权利要求2所述的基因簇编码的蛋白在制备防治农业害虫的微生物制剂中的应用。

4.权利要求2所述的基因簇编码的蛋白在防止苏云金芽胞杆菌晶体降解中的应用。

Images