CN102643220B - 从牛樟芝菌丝体萃取的化合物与其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及来自牛樟芝菌丝体的化合物。本发明还涉及治疗或预防C型肝炎病毒（HCV）感染的组合物。

Description

从牛樟芝菌丝体萃取的化合物与其用途

本申请是针对2008年1月28日提出的PCT/CN2008/000196号国际申请进入中国国家阶段的200880123816.6号发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明提供来自牛樟芝的化合物。本发明也提供一种用于治疗或预防C型肝炎病毒感染的医疗组合物。

背景技术

全球约百分之三的人口被感染C型肝炎病毒，在发展中国家，急性C型肝炎是造成肝硬化、肝癌(hepatocellular carcinoma)与肝移植(transplatation)的主要原因，C型肝炎病毒的蛋白(protease)在成为成熟的病毒前，其需经过病毒非结构多蛋白的切割，故此为发展抗C型肝炎病毒药剂中吸引人的治疗标的之一﹝Liu et al., 2004; Hepatitis C NS3 protease inhibition by peptidyl-a-ketoamide inhibitors: kinetic mechanism and structure. Arch Biochem Biophys  421: 207-216; Kakiuchi et al., 1999 A high throughput assay of the hepatitis C virus nonstructural protein 3 serine proteinase. J Virol  80: 77-84﹞。

在中国草药治疗与民俗医学已有数千年的历史，事实上，草药的使用纪录可追溯至西方圣经的时间；然而，直到近年才有科学家开始探讨草药在病毒感染治疗中可能的角色，例如：Ecballium Elaterium根的萃取物已被用来治疗C型肝炎与B型肝炎﹝EP 0793964和U.S. 5,648,089﹞；目前草药医学领域的研究已增加，然许多关于这些草药疗法的效用仍有待去了解。

在台湾，牛樟芝的子实体有着很高的价值，其被用来当作解毒剂，以及在腹泻、腹部疼痛、高血压、皮肤痒与肝癌时用；一些牛樟芝子实体中的生物活性内含物已被分离，且已被辨识为一系列的多糖体、类固醇、三萜类﹝triterpenoids﹞与倍半萜内酯﹝sesquiterpene lactone﹞(Lin et al., 2007, Factors affecting mycelial biomass and exopolysacharide production in submerged cultivation of Antrodia cinnamomea using complex media. Bioresource Technology  98: 2511-2517)。先前的研究已从牛樟芝菌丝体分离出五个新的顺丁烯二酸与丁烯二酸衍生物(antrodin A-E)(Nakamura et al., 2004, Five new maleic and succinic acid derivatives from the mycelium of Antrodia comphorata and their cytotoxic effects on LLC tumor cell line. J Nat Prod  67: 46-48)。

第7109232号美国专利公开了五个由牛樟芝萃取的化合物，以及其用途﹝如：保护肝、抗发炎与抗肿瘤的活性﹞与制备。

发明内容

因近年研究发现牛樟芝菌丝体对感染C型肝炎的病人具有临床疗效(Akiba T et al. 2007. Clinical study of Shoshi on Japanese hepatitis patients infected with C type hepatitis virus. The second Taiwan and Japan Symposium on Antrodia cinnamomea, Abst. pp. 82-98)，利用SensoLyteTM 520 C型肝炎蛋白分析试剂组(SensoLyteTM 520 HCV protease assay kit)分析分离的antrodins、antrodins C的代谢物与相似代谢物的C型肝炎蛋白抑制活性，此检测方法用自身消灭荧光基因多肽底物(quenched-fluorogenic peptide substrate)测量抑制剂的活性，并持续记录酵素反应的过程，以此分析方法检测，并以双倒数作图法(Lineweaver-Burk plot)方法探讨最有潜力化合物的抑制作用模式。

表1. 对抗C型肝炎病毒蛋白的antrodins与代谢物的半抑制浓度(IC₅₀)

                                                 

^a：牛樟芝子实体的组成成分；

^b：antrodin C的生物体内代谢物；

^c：antrodin C的生物体内代谢物之一的相似物。

如表1所示，从牛樟芝菌丝体来的五个成份(化合物1-5)中，其中有四个(化合物1,3,4与5)显示对C型肝炎蛋白具有抑制的活性；化合物6-8为在生物体新形成的antrodin C代谢物(或代谢相似物)也具有抑制活性；从牛樟芝分离出的化合物1与化合物3主要代谢物之一的化合物两者在生物体内皆可被检测到，其显示最有潜力活性者其半抑制浓度(IC₅₀)少于1微克/毫升。

利用不同浓度的底物(10, 50, 100 和200倍稀释的底物标准溶液)以及不同含量的化合物1的条件下(0, 5与10 微克/毫升的二甲基亚砜(DMSO))，动力分析其酵素活性并做出图示，以此探讨抑制的模式，如图2所示，化合物1的C型肝炎PR抑制作用模式为竞争型。

传统上，牛樟芝的子实体已被用在肝癌上(Lin ES, Chen YH. 2007. Factors affecting mycelial biomass and exopolysacharide production in submerged cultivation of Antrodia cinnamomea using complex media. Bioresource Technology  98: 2511-2517)。

牛樟芝的多糖体已被发现具有保护肝的作用(Han et al., 2006b, Protective effects of a neutral polysaccharide isolated from the mycelium of Antrodia cinnamomea on Propionibacterium acnes and lipopolysaccharide induced hepatic injury in mice. Chem Pharm Bull  54: 496-500)与抗B型肝炎的活性(Lee et. al., 2002, Antrodia camphorate polysaccharides exhibit anti-hepatitis B virus effects. FEMS Microbiol Lett  209:63-67)；在顺丁烯二酸与丁烯二酸衍生物中，antrodin C(化合物3)在以疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)与脂多糖(lipopolysaccharide)处理的小鼠上，其显示具有保护的活性(Nakamura N, Five new maleic and succinic acid derivatives from the mycelium of Antrodia comphorata and their cytotoxic effects on LLC tumor cell line. J Nat Prod  67: 46-48)。定量分析显示化合物3为在子实体中，其为此类化学物中最丰富的化合物，其占子实体干重的约5%(Han et al., 2006a, Protective effects of a neutral polysaccharide isolated from the mycelium of Antrodia cinnamomea on Propionibacterium acnes and lipopolysaccharide induced hepatic injury in mice. Chem Pharm Bull  54: 496-500)，生物体内化合物3的代谢研究显示此化合物被代谢为六种代谢物，如：化合物1、化合物2、化合物6、化合物7a、化合物7b与化合物8的相似物。针对药物动力探讨化合物3，其显示此化合物从消化道被快速吸收后，便快速且完全在肝代谢，其代谢的速度快到在吸收后便无法在体内检测到其存在(Masao Hattori, 2007. Metabolism and Disposition of Antrodin C (Hepasim) from the Mycelium of Antrodia cinnamomea in Rats. The second Taiwan and Japan Symposium on Antrodia cinnamomea, Abst. pp. 1-9)，此药物动力特性如表1所示，可看出代谢物为化合物3造成体内药物活性与民俗医学疗效的原因。

牛樟芝中除了化合物2外，其它这些代谢物与组成显示其在C型肝炎病毒蛋白的抑制活性，这些结果大大的支持了民俗医学在肝癌方面的使用，而这些肝癌常由长期C型肝炎病毒感染所造成；本发明中的活性化合物可当作引导研发的化合物，通过对病毒蛋白的抑制机制找出潜力抗C型肝炎的药剂。

因此，本发明提供一种具下式的化合物

                                           式I

或

  

                               式II

其中

表示为单键或双键； 

R₁是(CH₂) _nCOOH或 (CH₂)_nCOOC_mH_2m+1，其中n为0-6且m为1-6；

R₂是无、H或OH；且

R₃是无、H或OH。

在本发明的较佳化合物中，化合物具有式I，其中R₁是-COOH，R₂是无且R₃是OH。

在本发明的其它较佳化合物中，化合物具有式II，其中R₁是-COOCH₃，R₂是OH且R ₃是无。

本发明另提供式III的化合物

                        式Ⅲ

其中

R是(CH₂) _KCOOH或(CH₂)_KCOO(C_mH_2m+1)，其中k为0-6与m为0-6。

在较佳的式III化合物中，R为-CH₂COOH。

这些化合物以一种或更多种特殊几何、光学、镜像、非对应形、立体异构形(stereoisomeric)、互变异构形(tautomeric)、构形(conformational)或变旋异构(anomeric)等的形式存在，包含但不限制于正式与反式、E与Z形式、c、t与r形式、内与外形式、R、S与内消旋型、D与L式、d与l式、(+)或(-)式、酮、烯醇与烯醇盐(酯)形式、顺与反式、顺错(synclinal)与反错式(anticlinal)、α与β 式、垂直与水平式、船形、椅形、扭曲与半椅形式，与其组合物，以下称之为异构物(isomers)或异构形式(isomeric forms)。

若化合物为结晶形态，其可能存在为数种不同的多形态的形式。

本发明的化合物包含所有异构形式(异构物)，包含(全部或部分的)变旋(racemic)与其的其它混合物。这些异构形式的制备(如：不对称合成)与分离(如：分段结晶(fractional crystallization)与层析方法)方法不是已为此领域已知的方法，就是通过此所述的方法、已知方法或方式得以容易地取得推知。

本发明的化合物还包含离子、盐、溶剂化物与其被保护的形式，活性化合物的盐类化物，其可方便制备、纯化与/或处理，例如：一个医药上可接受的盐类(pharmaceutically-acceptable salt)。可被医药接受的盐类的例子已被讨论过(Berge et al., 1977, "Pharmaceutically Acceptable Salts," J. Pharm. Sci., Vol. 66, pp. 1-19)，而制备这些化合物的可被医药接受的盐类的步骤为所属技术领域的技术人员所熟悉的。

本发明提供一种治疗或预防C型肝炎病毒感染的医药组合物，包含有效量的式I、II或III化合物，及医药上可接受的载剂。

本发明提供一种治疗或预防C型肝炎病毒感染的医药组合物，包含：(1)有效量的式IV化合物

                           式 IV

其中

R₁是C_1-10羧酸或C_1-10酯；

R₂是C_1-10 羧酸或C_1-10酯；

R₃是氢, C_1-10烷基, C_2-10烯基或C_2-10 炔基；且

R₄是氢, C_1-10烷基, C_2-10 烯基或C_2-10炔基； 

或

(2) 有效量的式V化合物

 

式V

其中

X是N或O； 

R₁是C_1-10烷氧基、C_2-10烯氧基或C_2-10炔氧基； 

R₂是H, C_1-10烷基、C_2-10烯基或C_2-10炔基；

R₃ 是无、H或OH；

若X是O，则R₃为无，及医药上可接受的载剂。

在本发明的医药组合物中，较佳的化合物是选自

3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮；

3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮； 

3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮； 

3R*,4S*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮； 

3R*,4R*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮；

(2Z)-2-异丁基-3-{4-[(3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基]苯基}-2-丁烯二酸；

(2Z)-2-异丁基-3-{4-[(3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基]苯基}-2-丁烯二酸-4-甲酯；或

(2Z)-2-异丁基-3-{4-[(3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基]苯基}-2-丁烯二酸-1-甲酯。

本发明的组合物可以制备成不同投药的形式，包含药片、药锭、药丸或糖衣锭，也可填至适合的容器(如：囊剂)或悬浮体，可装入瓶中。

在本发明所述的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)，其包含任何与所有的溶剂、稀释剂、其它液体媒介、分散或悬浮辅助剂、固体黏合剂、润滑剂…等，且适合特定所需药量，在Remington's Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975)中已公开用在制备医药组合物上的许多不同载剂，其制备为已知的技术。除了目前不适用的任何传统的载剂基质外，例如：产生任何不欲产生的生物作用或与本发明的医药组合物的其它化合物产生有害的交互作用，其它载剂的使用皆属本发明的范围。

本发明的医药组合物中，其活性药剂占组合物总重量0.5到90%，其包含载剂基质与/或辅助的药剂。

该活性药剂占此组合物的总重较佳为5%-50%，医药有机或无机、固体或液体的载剂基质，适合口服或非口服的皆可用在组成此组合物。

本发明还提供一种用于治疗或预防C型肝炎病毒感染的方法，其特征在于，包含对对象投予药学上有效量的活性药剂，其选自于下述化合物：

（1）具有式I或式 II的化合物

                                      式I

 或

                                      式 II 

 其中

    为单键或双键； 

R₁为(CH₂) _nCOOH或(CH₂)_nCOOC_mH_2m+1，其中n为0-6且m为1-6；

R₂为无、H或OH；及

R₃为无、H或OH；

（2）具有式Ⅲ的化合物

 式Ⅲ

 其中 

R是-(CH₂)_kCOOH或-(CH₂)_kCOO(C _mH_2m+1)，其 k为0-6 且m为0-6；

（3）具有式IV的化合物

   式IV

其中

R₁是C_1-10羧酸或 C_1-10酯；

R₂是C_1-10 羧酸或C_1-10酯；

R₃是H, C_1-10烷基, C_2-10烯或C_2-10 炔基；且

R₄是H, C_1-10烷基, C_2-10 烯基或 C_2-10炔基； 

（4）具有式V的化合物

 

                             式V

其中

X是N或O； 

R₁是C_1-10烷氧基、C_2-10烯氧基或C_2-10炔氧基； 

R₂是H, C_1-10烷基、C_2-10烯基或C_2-10炔基；且

R₃ 是无、H或OH；

若X是O，则 R₃无。

本发明的较佳实施例，活化药剂选自以下十种化合物：

 

 

 

 

 。

 本发明的化合物可被以任何数量与任何投予方式，以降低C型肝炎病毒的感染力，本发明所述的“有效量”是指非毒性的，但在所欲治疗的病毒感染上提供足够量的可抗病毒药物，此确切的用量会随对象而不同，取决于对象的人种、年纪、一般条件、感染的严重性、特殊的抗病毒药物、投予的方式…等因素。

此抗C型肝炎化合物可以服用的单位配置，可易于投予与统一药量；“药量单位”在此是指适合患者治疗的抗病毒药物的有形分离单位(physically discrete unit)，每个药量应包含活性物质的量计算至可产生所欲达到的治疗效果，亦或是选择的药物载剂基质(carrier medium)。

本发明的化合物投予方式可用口服、非口服(如：肌肉注射、腹膜注射、静脉注射…等)，取决于治疗时感染的严重程度。

尽管本发明的化合物可以投予任何对C型肝炎感染敏感的病患，这些化合物能够用于治疗哺乳动物对象，尤其是人类。

从本发明的化合物对酵素活性的抑制作用的角度来看，可预期这些化合物也适用于C型肝炎预防上，而不只是在感染的治疗处理。上述的药量不论是用在治疗或预防C型肝炎的感染上，药量皆相同。

在本发明所述的“有机溶剂”是指包含但不局限于醇类(如：甲醇、乙醇与丙醇)、酯类(如：乙酸乙酰(acetyl acetate))、烷类(如：己烷)与卤烷类(如：氯化甲烷与二氯乙烯(C₂H₂Cl₂)，较佳的有机溶剂为乙醇或醇类溶剂，其对人类不会有副作用产生。尤其是化合物9与化合物10，其是以有机溶剂从牛樟芝萃取而来。

下述的实施例提供本发明更进一步细节的说明，这些实施例为本发明最佳的实施例，其用以说明此发明，然非限制本发明的范围。

附图说明

图1表示从牛樟芝萃取的化合物1-10的结构。

图2表示在不同浓度的底物下(◇:10μg/ml, □:5μg/ml 及○:0μ)，以双倒数作图法(Lineweaver-Burk plot )(1/Vi v.s. 1/[S])表示化合物1抑制C型肝炎NS3蛋白(HCV-NS3 蛋白酶)的结果。

图3表示此发明的化合物9的分析数据。

图4表示此发明的化合物10的分析数据。

具体实施方式

下列实施例仅代表本发明的各种实施方式与特征，并非限制本发明的范围。

仪器

利用光谱仪(Varian Unity Plus 500 ¹H, 500 MHz; ¹³C, 125 MHz)测量NMR光谱；利用电洒法质谱仪测量MS光谱(ESI-MS, Esquire 3000^Plus, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)。 

C型肝炎病毒蛋白分析的材料

C型肝炎病毒蛋白分析利用以下数种材料：HCV NS3/4A蛋白(摘选是用lot# Lot 046-047以及机制探讨是用lot# Lot 046-079) 以及SensoLyte^TM 520 HCV蛋白分析组(Protease Assay Kit*Fluorimetric*) (lot# AK 71147-1005从AnaSpec, San Jose, CA, USA购得)底物为5-FAM/QXL^TM520的荧光共振能量转移肽(FRET peptide)，其序列含Ac-Asp-Glu-Asp(EDANS)-Glu-Glu-Abu-Ψ-[COO]Ala-Ser-Lys(DABCYL)-NH2。

此分析利用BD Falcon^TMMicrotest^TM384-well的120毫升分析盘(lot#05391155)，以及以测光仪(TECAN GENios plate reader)用485nm波长激发检测化合物发出的530 nm荧光波长，Antrodins A-E(化合物1-5)以先前的方法从牛樟芝菌丝体分离(Nakamura et al., 2004. Five new maleic and succinic acid derivatives from the mycelium of Antrodia comphorata and their cytotoxic effects on LLC tumor cell line. J Nat Prod  67: 46-48)。

以恩贝酸(Embelin)为正控制组，其为本实验室以先前的方法分离出来(Hussein et al., 2000, Inhibitory effects of Sudanese medicinal plant extracts on hepatitis C virus (HCV) Protease. Phytother Res  14: 510–516)。

化合物6、7a与7b可在生物体中被检测出来，其为antrodin C在生物体内代谢所产生，化合物7a与7b无法从化合物1分离，因此分析时，以化合物1、7a与7b的混合物进行分析；化合物8为一个代谢物的相似物，其化学结构的甘氨酸基(glycine group)应接到其它的羧基(carboxyl group)上。

实施例1：化合物8的合成

将化合物1(314毫克/1毫摩尔)、4-(二甲氨基) 吡啶(122毫克/毫摩尔)与甘氨酸(113毫克/1.5毫摩尔)的5毫升吡啶溶液以40℃加热12小时后，维持室温至隔天。产品混合物以乙酸乙酯(EtOAc)与0.2当量浓度的盐酸(0.2N HC1)溶液分离，乙酸乙酯(EtOAc)层以水冲洗后，浓缩干燥，残留物用ODS层析以CH₃CN-H₂O(30-100%)冲提，如此从60%乙氰(CH₃CN)抽提部分(200毫克, 51%)中获得化合物8。

¹H NMR (DMSO-d ₆ , 500MHz): δ0.81, 0.82 (各3H, s, H-3',4'), 1.71, 1.75 (各3H, s, H-4'",5'"), 1.93(1H, m, H-2'), 2.50 (overlapped with NMR solvent, H-l'), 4.20(2H, s, H-a), 4.58 (2H, d. ^=6.5Hz, H-l'"), 5.45 (1H, m, H-2'"), 7.07 (2H, d, J=9.0Hz, H-3", 5"), 7.52 (2H, d, J=9.0Hz, H-2", 6"). ₁₃C NMR (DMSO- d ₆ , 125MHz): δ18.1(5'"), 22.5(3',4'), 25.5(4'"), 27.5(2'), 32.2(1'), 39.5(a), 64.5(1'"), 114.9(3",5"), 119.6(2'"), 120.9(1"), 130.9(2", 6"), 137.4(3), 137.6(3'"), 137.9(2), 159.5(4"), 169.1(4), 170.4(β), 171.1(1). ESI-MS (negative): m/z 370.0 ([M-H₂0-H]-, 100%). 

分析步骤

分析时，化合物6溶于水中，其它化合物溶于二甲基亚砜(DMSO)中，将2微升的化合物溶液与8微升新稀释的酵素(0.5微克/毫升)加入每个槽(well)中，当加入10微升的新稀释的底物(100倍稀释的二甲基亚砜(DMSO)标准溶液)时，即开始反应，此反应在室温下(28 ℃)进行30分钟后，测量其以波长485nm激发的波长535nm的荧光强度，而抑制百分比的计算以此公式换算：(F_vehicle- F_sample) / F_vehicle = 抑制百分比 (inhibition %)，其中，F为控制组的荧光值或化合物的荧光值减去底物控制组的荧光值。

实施例2：化合物9与10的合成

从善生生物科技股份有限公司取得的200克的牛樟芝菌丝体的粉末(ACM)，以温热的乙醇萃取四次，过滤去除残留物后，将该萃取物移至分离的漏斗，加入1：1的水与二氯甲烷，混合1至5分钟，加入水与二氯甲烷并混合的步骤重复四次，水层分离，二氯甲烷的部分利用管柱层析(Diaion HP20 column chromatography)，以70%、80%、90%、100%的甲醇抽提出，得到14种物质(馏份1-14(fractions 1-14))。

馏份3(Fraction 3)用管柱层析(OPN-75 Packing Column (resin, Merck))，以甲醇抽提出三种物质(馏份15-17 (fractions 15-17))，馏份16(Fraction 16)利用管柱层析(Sephadex LH20 column)，以100%的甲醇抽提出六种物质(馏份18-23 (fractions 18-23))，馏份(Fraction 20)以高压液相层析法﹝HPLC [column: Cosmosil 5C18-AR-II (20 x 250 mm)]﹞分离出化合物9。

表2：化合物9的质子核磁共振光谱数值(¹H-NMR Spectral Data) 

2	166.2(s)		2.07;2.35(weak)	2
					3	88.4(s)		1.67;2.07;2.35	11
4	131.8(s)		2.07(weak);2.35;8.01	5
					5	135.6(s)			6
1’	43.9(t)	2.07(1H,m); 2.35(1H,m)	0.82;0.84;1.67	13
					2’	24.1(d)	1.67(1H,m)	0.82;0.84;2.07;2.35	16
3’	24.1 (q)	0.82(3H,d,6.5Hz)	0.84;1.67;2.07;2.35	15
					4’	23.5.5(q)	0.84(3H,d,6.5Hz)	0.82;1.67	17
1’’	121 (s)		6.92	8
					2’’,6’’	130.9 (d)	8.01(2H,d,9.0Hz)	8.01	7
3’’,5’’	114.6 (d)	6.92(2H,d,9.0Hz)	6.92	10
					4’’	159.7(s)		4.51;6.92;8.01	3
1’’’	64.8(t)	4.51(2H,d,7.0Hz)		12
					2’’’	119.2(d)	5.46(1H,bro,6.5Hz)	1.72;1.78;4.51	9
3’’’	138.7(s)		1.72;1.78;4.51	4
					4’’’	25.8(q)	1.78(3H,s)	1.72	14
5’’’	18.2(q)	1.72(3H,s)	1.78;5.46	18
					-COOCH2	168.9(s)			1

馏份21(Fraction 21) 接着以高效液相层析法(HPLC) [column: Cosmosil 5C18-AR-II (20 x 250毫米(mm))]分离，可得到化合物10。

 表2：化合物10的质子核磁共振光谱数值(¹H-NMR Spectral Data) 

2	172.1(s)		2.33	1
					3	133.7(s)		2.00;2.33	6
4	148.5(s)		2.33;7.22	4
					5	90.4(s)			11
1’	33.1(t)	2.33(2H,d,1.5;7.0Hz)	0.79;0.81;2.00	14
					2’	27.2(d)	2.00(1H,m)	0.79;0.81;2.33	15
3’	22.5(q)	0.81(3H,d,6.5Hz)	0.79;2.00;2.33	17
					4’	22.3(q)	0.79(3H,d,6.5Hz)	0.81;2.00;2.33	18
1’’	123.1(s)		6.89	8
					2’’,6’’	129.9(d)	7.22(2H,d,8.5Hz)	7.22	7
3’’,5’’	114.8(d)	6.89(2H,d,8.5Hz)	6.89	10
					4’’	159.6(s)		4.50;6.89;7.22	3
1’’’	64.79(t)	4.50(2H,d,6.5Hz)		12
					2’’’	119.2(d)	5.46(1H,tt,,1.5;5.5Hz)	1.72;1.78;4.50	9
3’’’	138.7(s)		1.72;1.78;4.50	5
					4’’’	25.8(q)	1.78(3H,s)	1.72;5.46	16
5’’’	18.2(q)	1.72(3H,s)	1.78;5.46	19
					-COOCH2	169.2(s)		4.29	2
-OCH2CH3	64.0(t)	4.29(2H,m)	1.22	13
					-OCH2CH3	14.0(q)	1.22(3H,t,7.5Hz)	4.29	20

高效液相层析法(HPLC)分析的样品前处理。

1. 将0.2217克的牛樟芝菌丝体粉末溶于5毫升的乙醇；

2. 超音波振动萃取30分钟后，以9500 rpm的转速离心5分钟，将上层悬浮液以0.45毫米筛滤膜过滤；

3. 高效液相层析法(HPLC)分析

高效液相层析法(HPLC)分析条件：

1. 移动相：0.1% 磷酸(H₃PO₄)、乙氰(CH₃CN)与甲醇

2. 管柱：Agilent，Zorbax SB-C18，4.6 x 250毫米(mm)

3. 速率：1 毫升/分钟(mL/min)

4. 波长：254纳米(nm)

5. 温度：30 ℃

6. 注入体积：20 毫升

高效液相层析法(HPLC)分析结果   (请参照图3与图4)。

本发明以详细说明及实施例，以使所属技术领域的技术人员能施行并加以利用，为任何替代、变更或修改均应在不脱离本发明的精神与范围内进行。

所属技术领域的技术人员可从本发明得到本文所述的结果及优点；动物、制造过程与方法以仅为示范性的较佳实施例代表，并非欲限制本发明的范围。所属技术领域的技术人员会对本发明做修正、变更及其它用途，唯这些修正与变更均应包含在本发明的精神内，并应当在本发明所附的权利要求保护的范围内。

Claims (3)

1.下述化合物在制造治疗或预防C型肝炎病毒感染的医药组合物中的用途，其中该医药组合物包含有效量的化合物1、3、4或5，以及医药上可接受载剂：

                                                、 、

 、。

2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述医药组合物的施用对象为哺乳动物。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物为人类。