CN102640024A - 可变穿透深度的生物传感器和方法 - Google Patents

Abstract

一种表面等离子体共振传感器系统，其包括高折射率棱镜、传感器芯片、具有涵盖广泛波长的多个波长的光源、光学透镜、光电探测器、数据获取单元，如本文所定义。所述传感器芯片可包括例如透光性基材一面上的薄层硅和金以及所述透光性基材另一面附近的棱镜。这种设置提供多至约1.5微米的可变穿透深度，感测样品内折射率变化的动态范围比常规SPR传感器高数倍。本公开提供使用表面等离子体共振传感器系统用于细胞试验或化学试验相关应用的方法。

Description

可变穿透深度的生物传感器和方法

要求享有在先美国专利申请的优先权

本申请要求2009年11月30日提交的美国申请系列号12/627,515和2009年11月30日提交的美国申请系列号12/627,463的权益。

技术领域

本公开一般涉及生物传感器、生物传感器设备和生物传感器使用方法。

发明概述

本公开提供用于表面等离子体共振(SPR)传感器系统的传感器芯片，其具有可变穿透深度分辨能力。本公开还提供包括所述传感器芯片的表面等离子体共振传感器系统。本公开还提供使用所述表面等离子体共振芯片和所述传感器系统用于化学和生物试验相关应用的方法。

附图简要说明

在本公开的实施方式中：

图1显示采用所述传感器芯片的多波长SPR感测系统的示例性示意图。

图2显示对于所述SPR感测系统样本穿透深度随着波长变化的关系。

图3显示供对比度现有技术SPR芯片(300)结构，该芯片由玻璃基材上的薄金属涂层组成，所述基材的未包覆表面接触耦合棱镜。

图4显示所述基于玻璃基硅(SiOG)的SPR传感器芯片的一般结构。

图5显示常规芯片的SPR响应，反射率随着入射角(AoI)而变化。

图6显示SiOG芯片的SPR响应，反射率随着入射角(AoI)而变化。

图7显示所述基于SiOG的SPR系统的示例性测量响应。

图8显示用现有技术的SPR设备测得的对比性多层响应。

图9显示所述基于SiOG的SPR传感器系统响应与PAH/PSS层厚度的线性关系。

图10描述2个光束间SPR响应的角度差异随基材折射率而变化。

图11提供SPR响应半角宽在不同基材上不同波长时随折射率变化的图。

图12显示检测能力的示例，用不依赖标记的检测共振波导仪和所述SPR传感器系统测量针对三磷酸腺苷(ATP)处理的细胞反应。

图13显示接触肾上腺素的细胞比较，用不依赖标记的检测共振波导仪和所述SPR传感器系统所测量。

图14显示用所述传感器系统测得的革兰氏阳性(G⁺)菌枯草芽孢杆菌(B.subtilis，Bs)和革兰氏阴性(G^-)菌大肠杆菌(E.coli，Ec)对青霉素的细菌反应的结果。

图15显示对氨苄青霉素的深度分辨细菌试验反应的传感器系统结果。

图16显示有调节剂的核受体的细胞试验结果，用深部分辨细胞试验(DRCA)法测量以提供有效的细胞-核试验。

图17进一步证明细胞-核试验中核受体与DRCA的特异性。

发明详述

参考附图(如果有)详细描述本公开的各种实施方式。对各种实施方式的引述并不限制本发明的范围，该范围仅由所附权利要求书的范围限制。另外，本说明书所列实施例为非限制性且仅列出所主张发明的许多可能实施方式中的一些。

定义

“效应物”或类似术语指某分子，包括各种小分子且涵盖任何调控分子，包括能结合某蛋白并改变该蛋白活性的蛋白，或与其他细胞相互作用的生物细胞。

“调节剂”或类似术语指在别构调节中结合调控位点并别构调节所述蛋白形状的分子，或更常是能引发另一分子反应的分子。

“包括”、“包含”或类似术语指涵盖但不限于，即包容性而非排他性。

用于描述本公开实施方式的“约”修饰例如组合物中成分的量、浓度、体积、加工温度、加工时间、得率、流速、压力等值和其范围，指可发生数量的变化，例如：由于用以制备化合物、组合物、复合物、浓缩物或应用制剂的常规测量和处理过程；由于这些过程中的不经意误差；由于生产、来源中的差异，或用于完成所述方法的起始材料或成分的纯度差异；和类似因素所发生的变化。术语“约”还涵盖由于具有特定起始浓度或混合物的组合物或制剂的老化而产生差异的量，以及因为用具有特定起始浓度或混合物来混合或加工组合物或制剂而产生差异的量。本文所附权利要求包括这些“大约”数量的等同物。

实施方式中“基本由…组成”指例如对于可变深度传感器和传感器系统，和对于制备或使用所述可变深度传感器和传感器系统以及本文所述物件、装置或任何设备的方法，且可包括权利要求所列组分或步骤，以及不实质性影响本公开物件、设备或制备和应用方法的基本和新特性的其他组分或步骤，如特定添加剂或成分、特定试剂、特定表面修饰剂或条件，或类似结构、材料或选定的过程变量。可实质性影响本公开组成或步骤的基本特性或者可使本公开的多方面产生不需要特征的物项包括例如无意的蛋白变性，或通过化学或物理方式对蛋白分子结构或特征造成类似的功能破坏或改变，所述改变可破坏试验的细胞或核特征。

除非另有说明，本文使用的不定冠词“一个”或“某个”及其对应的定冠词“所述”指至少一个，或者一个或多个。

可使用本领域普通技术人员熟知的缩写(例如，“h”或“hr”指小时，“g”或“gm”指克，“mL”指毫升，“rt”指室温，“nm”指纳米，和类似缩写)。

对于组分、成分、添加剂、反应物、试剂、聚合物、寡聚体、单体、时间、温度等方面所公开的具体的以及优选地值及其范围仅用于说明；它们不排除其他定义值或已定义范围内的其他值。本公开的组合物和方法包括具有本文所述的任何值或所述值的任意组合、特定值、更特定的值和优选值。

在本公开的实施方式中，有限穿透深度的光生物传感器系统和类似其他的消逝场传感器的问题可由例如所述可变穿透深度SPR传感器系统来克服，如本文所述，该系统具有含不同波长的光源且具有不同穿透能量学。

本公开的实施方式中提供表面等离子体共振传感器系统，其包括例如：高折射率棱镜、传感器芯片、具有涵盖广泛波长的多个波长的光源、光学透镜、光电探测器、和数据获取单元。所述传感器芯片可包括例如透光性基材一面上的薄层硅和金以及所述透光性基材另一面附近的高折射率棱镜。这种设置可提供多至约1.5微米的可变穿透深度，感测样品内折射率变化的动态范围比常规SPR传感器高数倍。

本公开的实施方式中提供表面等离子体共振(SPR)传感器系统，所述系统包括：

提供入射光束的光源，所述光源具有至少2个波长；

提供入射光束成形和光束聚焦的第一光学系统；

包括透光性基材的传感器芯片，所述透光性基材在第一面上有高折射率棱镜以接受入射聚焦光束，在基材第二面上有约100nm-约5微米的硅层和所述硅层上约30nm-约80nm的金属层；

提供反射光束收集的第二光学系统；

接受反射光束或发射光束并检测SPR信号的光电探检测器；和

数据获取单元。

所述系统还可在所述金属层表面上包括分析物，所述分析物含有例如生物制品、生化样本、细胞、细胞组分、细胞构建体、表面包被等实体或其组合。

所述传感器系统可具有至少约0.4微米的分析物穿透深度。

所述光源可以是有例如跨越约400-约1,700nm的多种不同波长的多个光束。所述数据获取单元可通过例如发现SPR最小的角位置提供SPR角响应。所述传感器芯片有折射率为约2.5-约4.0的高折射率层，所述棱镜的折射率为约2.5-约4.0。所述基材上的硅层提供折射率为约3.5的光学材料或起其作用。所述基材可为例如厚约10-约100微米的薄膜涂层，玻璃，晶体，半导体材料，等实体或其组合。所述基材可以是例如透光的，折射率大于约2.4，且该基材在感兴趣波长范围内光损失低。所述系统还可包括例如切换光照的光源、光照的波长或其组合的装置。

所述切换装置可包括人工操纵切换、自动或机器切换，包括有动力和控制功能的机电装置，如伺服发动机、微处理器、微动开关或类似组件，以及类似切换方法或设备，或其组合。

在本公开的实施方式中，提供传感器芯片，包括：

透光性基材，在所述透光性基材的第一面上有约100-约2,000nm的硅层和所述硅层上的金层；和

在所述透光性基材第二面上的高折射率棱镜。

所述传感器芯片可包括厚约100-约1,000nm的硅。

在本公开的实施方式中，提供有扩展穿透深度的表面等离子体共振方法，所述方法包括：

提供上述传感器系统，包括分析物和类似系统，或等同系统；

用光源照射所述分析物；

用光电探检测器检测SPR信号；

用数据获取单元分析测得的SPR信号；和

将所测得SPR信号与分析物事件相关联。

所述基材可以是例如有高折射率的材料以减少SPR响应差异。所述SPR信号检测可用例如多波长SPR光电探测器完成且没有复合光学系统。

所述基材的折射率可以为例如至少2.4，且所述棱镜折射率可以为例如至少2.4。在实施方式中，光源在约0.4微米-约1.7微米的至少2个或更多波长发射。扩展的穿透深度可以为例如约400nm-约1,500nm。光源可以是例如聚焦光束以照射分析物并激发SPR。

在实施方式中，本公开提供深度分辨感测生物实体的方法，其包括例如：

提供表面等离子体共振(SPR)传感器系统，所述系统包括：

提供入射光束的光源，所述光源具有至少2个波长；

提供入射光束成形和光束聚焦的第一光学系统；

包括透光性基材的传感器芯片，在所述基材的第一面上有高折射率棱镜以接受入射聚焦光束，在所述基材的第二面上有约100nm-约5微米的硅层和所述硅层上约30nm-约80nm的金属层，和所述硅层上的贵金属层；

提供反射光束或发射光束收集的第二光学系统，即收集反射光束或发射光束；

接受所收集的光束并检测SPR信号的光电探测器；

数据获取单元；和

传感器芯片表面的贵金属外表层上的生物实体或类似分析物；

用至少2个不同波长照射传感器，所述不同波长各自具有不同的穿透深度；

监控所述不同波长各自的折射率变化；和

将折射率变化与生物实体变化相关联。

上述方法还可包括例如在用2个或更多不同波长中的至少一个照射传感器之前、期间、或之后，将所述生物实体与第二实体接触，所述第二实体包括化合物、生物制品、或其组合。

在实施方式中，所述生物实体可以是例如细胞膜受体、胞内受体、细胞核受体、亚细胞组分等实体，或其组合。在实施方式中，所述生物实体可以是例如细胞、细胞培养物、细胞组分、细胞构建体、病毒、朊病毒等实体，或其组合。

所述细胞培养物可具有例如约70-约100%的细胞密度，细胞培养物汇合可以为例如约70–约100%，试验缓冲液可以是例如HBSS。在实施方式中，所述方法还可包括使所述传感器芯片的贵金属(如金、铂、铬、镍)外表层具有机聚合物(如聚赖氨酸、聚乙二醇、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、基质胶等材料)或无机物(如磷酸钙、氯化钙等无机物或其组合)，然后将生物实体置于传感器芯片表面。

在实施方式中，所述生物实体可以是例如真核细胞的受体、原核细胞的受体、合成的细胞构建体或其组分，或其组合。

在实施方式中，所述至少2个不同波长可以是例如多个不同波长，如3-20个不同波长。在实施方式中，所述第二实体可以是例如调节剂、效应物、或其组合。

基于表面等离子体共振(SPR)的光学传感器是用于在表面数百纳米内无标记检测(例如细胞、药物、化合物)的最灵敏且精确的技术。在常规SPR传感器测量中，选定波长的光束通过高折射率介质导向另一含待分析样品的介质。在Kretschmann设置中，将很薄的金属膜(通常为约40-约60nm的金)置于2种介质间。它们在真空或带正介电常数的材料与负介电常数的材料(通常为金属或掺杂电介质)间的界面出现。当入射光束的角度和偏振经适当调整时，其可与金属膜中的电子气表面波模共振。共振耦合条件由电子气的色散关系限定，所述电子气自身由金属膜和外周介电材料确定。这产生与金属表面非常紧密结合的非辐射表面电磁波，其传播方向在入射光束平面内且平行于金属膜平面。表面等离子体波内的能量为金属膜的(低)电阻率吸收。以错误角度入射或偏振的光不与等离子体表面耦合，而是以高效率从薄膜镜面反射。反射光强度最小的角度是由来自SPR共振吸收。反射强度最小的角度对薄金属膜毗邻材料的折射率变化很敏感。因此，可用光电探测器阵列监控SPR吸收的入射角度。通过追踪最小强度反射光的位置变化，可在金属膜表面附近监控例如生物或生化相关结合和质量运输事件。所述技术可用于许多应用，包括例如基于细胞的受体/配体相互作用、非侵入性细胞增殖、抗体和小分子亲和性分析。开发了多种SPR传感器，例如美国专利号6,045,756、5,898,503、5,912,456、5,946,083、6,798,521和7407817中所述，用于许多生产和分析应用，包括例如化学加工和分析、过程控制和污染检测。然而，这些传感器具有约200-约300nm的固定穿透深度且不能检测不同层或深度即具有不同穿透深度的化学和生物事件，例如穿透深度大于约300nm的事件。

SPR共振吸收对SPR共振相关消逝场体积内的质量和结合变化敏感。当已知结合和质量运输区限于传感器表面的薄层例如几纳米和多至可能数十纳米厚度的有效脉冲函数时，这关系不大。在此情况中，SPR共振的消逝场延伸多倍于结合或质量运输区的厚度，厚度和材料扰动对探测消逝场的影响在可忽略至一级近似。其他设计中，采用3维“支架”(如Biacore、基质胶)，但结合和质量运输对SPR共振消逝场中材料的平均光学性质影响较小。在此情况中，结合和质量运输对探测电磁场的影响也可忽略至一级近似。

样品如细胞对SPR检测(和其他消逝场)技术提出独特的问题，因为细胞通常比典型SPR共振场约250nm的消逝尾厚许多，如大于或等于约1微米。因此，完整消逝场体积仅探测了一部分完整细胞深度。这可能产生问题，因为SPR消逝场不能探测细胞内的一些感兴趣结构如核。此外，仅能在膜附近研究胞内转运过程如在细胞膜和细胞核之间来回转运物质。在此方面，信号中可能出现一些歧义，因为不能直接确定SPR信号的变化是由膜引起(例如内陷和其他形态学变化)，还是由于物质经膜运到或运离开细胞内部或外部的膜。类似地，整个样品体积中的结合事件位置缺乏直接确定。可根据现有关于细胞生理反应的知识作出一些推断。然而，对SPR响应(或任何其他消逝场传感器响应)信号准确含义的解释不完全明确。为此，能够简单、快捷且选择性调整消逝场穿透深度很有用，从而对超过1种的穿透深度的取样可以同时(即在同一时间)、依序或两者。如此，可尝试将不同穿透深度获得的信号作比较或对比以推断离传感器表面某些距离范围内发生的过程。因此，尽管可能无法对细胞样品内的物质分布、结合和转运变化的深度概况进行完全去卷积，但所述设备和方法仍可改善基于细胞的和其他动态物质重分布试验中SPR响应的定位和阐释。

通过光源波长和传感器材料属性和取样体积来确定表面等离子体穿透深度。对于给定样品和感测系统设计，穿透深度不能变化很大；其或多或少固定。在常规SPR测量系统中，由于穿透深度不能大幅调整，不能收集到细胞尺寸的可变穿透深度相关信息(即大于或等于约1微米)。例如，市售可得SPR装置在常用的760nm波长下，穿透深度为约250–约300nm。尽管此穿透深度足以用于化学分析和结合事件，其不适于细胞试验相关应用的更全面研究。需要有穿透深度更大的SPR传感器，从而表面等离子体共振相关消逝场可穿透(并因而探测)大部分细胞。此能力可允许对细胞内部进行SPR研究，与仅能研究细胞表面的现有SPR仪器限制相反。此外，为获得关于细胞中生物事件的详细信息，需要有不同穿透深度的信号并实时监控来自各穿透深度的事件。

本公开提供用于检测和监控引起样品不同深度处折射率变化的生物和生化事件的设备、传感器芯片和方法。此设备和方法用于测量和定位例如在传感器金属(例如金)薄膜界面附近的样品内生物、生化或化学变化的发生。所公开设备利用玻璃基硅(SiOG)芯片的独特性质，所述芯片在此情况中还包被有纯金薄层(约40-约50nm)。

角度解调法中，可通过测量传感器反射光最小的角度位置来检测SPR响应。可通过用光电探测器阵列记录强度概况来检测确切的角度位置。

参考附图，图1提供所公开SPR传感器系统的一般示意图，包括有一个或多个光源的测量设备、数个光束成形光学系统、高折射率耦合棱镜、检测芯片、一个或多个光电探测器阵列、和数据获取单元。实施方式中，所述SPR传感器系统可包括例如光源(10)；有来自光源的光束(20)；光束成形光学系统(30)；用于感测的聚焦光束(40)；至少一种玻璃基硅(SiOG)芯片(50)或类似芯片；用户提供的分析物或测试样本(60)，如细胞、细胞组分、细胞构建体和类似生物实体；棱镜(70)；光束成形光学系统(80)；反射或发射光束(90)；光电探测器阵列(100)；任何合适的显示，如所测SPR角响应的图示(110)。

描述了具有单一光源和单个光电探测器的代表性系统。然而，可包括其他变化，例如添加纤维或自由空间耦合器、纤维阵列、排列光学系统、分光器，或其组合，以将多光源、多探测器检测或这2种特征都纳入所述设备。尽管不受理论限制，当传感器表面上入射光的波投射数量满足产生表面等离子体的要求时，入射光激发表面等离子体共振。表面等离子体波的激发和其随后在金属膜上的消散导致金属层反射光的强度相比角度分布出现最小。最小角反射对表面等离子体消逝场探测的样品介质体积的介电常数很敏感。

图1的光源可包括例如一种或多种光发射装置，所述装置在从可见光到近红外光范围如约400nm–约1,700nm的不同波长操作。光源还可有跨大范围的波长(例如400nm-1,700nm)。图2显示就所公开传感器系统(210)而言，样本穿透深度的关系。SPR相关消逝场的穿透深度随着波长变化。波长越长，表面等离子体穿透越深。图2可见，使用1,500nm光源时，穿透深度可增加至1.5微米。相较使用在约760nm运行光源的现有技术SPR装置的310nm穿透深度，所公开感测系统的穿透深度提高约5倍。图3显示现有技术SPR芯片(300)的结构，由玻璃基材(330)上的薄金属涂层(340)组成。然后，所述基材的未包被表面接触耦合棱镜(320)。图4显示所公开基于SiOG的SPR(400)传感器芯片的一般结构。玻璃基材(420)与薄层(430)例如晶体硅结合。金属涂层(440)在硅层上沉积以用于检测。所述基材的未包被面与例如硅棱镜(410)接触。分析物(450)如生物样本、涂层组合物、化合物等材料或基质可方便地置于金属涂层(440)上或其附近。

在常规SPR中，固定穿透深度且检测层体积始终相同。相反，所公开系统可使穿透深度短至250nm以及可超过1,500nm。所选光源的特定最优波长可选择在样品吸收和散射损失相对较小的光谱范围内。对于有强荧光发射的样品，检测波长应避开荧光吸收峰以使其对折射率敏感性的影响最小。相反，在采用表面等离子体来明确激发例如表面荧光或量子点的系统中恰恰相反，波长应选择在荧光或量子点激发带内。

在实施方式中，使用提供可变检测深度(即穿透深度)的多种波长，从而可监控不同深度的样品折射率。此信息可有助于分析生物事件或生化事件。通过测量某个第一波长的SPR响应，然后切换照明源到不同的第二波长来实现可变穿透检测深度，所述切换优选快速和自动方式。随着时间收集不同波长的SPR响应时，可将其组合以显示经过样品不同穿透深度的样品综合响应差异。对比不同波长的SPR响应差异可监控不同样品深度的响应差异。

可以选择有各种光谱带宽的许多不同光源，如激光、激光二极管、发光二极管(LED)、超辐射发光二极管(SLD)、白光灯、超连续光源，或其组合。可用例如使用光学反射镜和透镜的自由空间光系统将光束递送到光束成形器。还可用例如光纤维或纤维束递送光束。所述纤维可以是单模、多模、或其组合。光源产生线性偏振输出时，所述纤维可以是保偏光纤。所述多个波长可用例如波多路复用技术获得，从而所有光源可合并到一个纤维或一束中以简化光学装置。在此配置中，测量在各波长进行。即，检测装置在任何时间点和任何给定波长仅取一个数据点(SPR响应)。对于以下测量，波长可用光切换技术如翻转镜、检流计和光纤开关变为用于不同穿透深度的不同波长。由波多路复用技术合并光源时，可通过例如用光切换打开光源来实现波长选择。尽管不受理论约束，据信通过可用波长带宽切换应优选以快于正常生物或生化事件发生的速率完成。

光束成形光学系统将光源或光纤的光输出转化成需要的束形并提供样品区域的受控光照。所述光束成形光学系统可包括例如一些光学透镜、偏振器、光束调制元件。光学透镜将光束成形为需要的光斑尺寸、形状和合适数值孔径。感测区的形状可集中于一个点或一条线或甚至作为延伸点。可采用偏振器确保合适的光源偏振(“P-偏振”，与金膜上入射光束的入射平面平行)。例如，用光纤耦合光源以线光照射样品，圆光束截面需要再成形为矩形或椭圆形光束截面。此转化可用例如柱状透镜和其他常用透镜的组合完成，所述的常用透镜如球面、非球面透镜、衍射光束成形器、反光镜、棱镜或其组合。由于只有P-偏振组分可与SPR共振耦合，s-偏振组分不是必须的且可能潜在破坏检测反射光最小SPR的能力。因此，可能需要偏振器阻断入射光束中的任何剩余s-偏振组分并仅允许p-偏振光通过进入测试样本。当光源谱宽过于狭窄(例如低于约0.01nm)由于公知的斑点而不能产生均匀分布时，需要光束调制元件。在此情况中，调制器沿着p-偏振略微改变光束位置(例如低于约3度)以使斑点最小化并因而改善信噪比。

在实施方式中，传感器芯片可包括例如玻璃基材、薄(例如10-100nm)硅层和硅层顶上的薄金属层。在实施方式中，可制作传感器芯片，例如，首先，晶硅晶片或瓷用氢或其他离子植入。其次，随后将玻璃基材与硅植入表面接触。所述基材可以是例如通过应用热和电压与阳极结合。加热基材还引起薄硅层在已植入氢层上脱落，导致薄的单硅晶层结合玻璃基材。所述玻璃基材可以是各种玻璃，其玻璃组成中可含有碱土氧化物(例如MgO、CaO、SrO、BaO或其组合)。在实施方式中，优选玻璃与硅的热膨胀匹配，这可使LCD显示玻璃，如康宁公司(Corning Inc.)玻璃组合物编号1737或EAGLE

成为优选。

硅膜厚度可通过离子植入深度确定，可以是例如约200-约1,500nm，约400-约500nm，包括中间值和范围。硅层表面可以是粗糙的，直接位于外部硅表面下的区域包含不需要的氢且对晶体结构有高度损伤。由于这些都不利地影响组装自硅膜的装置性能，一种实践是抛光表面以移除受损层并降低表面粗糙度。抛光后，可采用炉退火以移除任何剩余氢。对于此步骤，可采用大面积抛光(例如化学机械抛光(CMP))或小面积确定性抛光(例如Zeeko)。抛光后的典型薄膜厚度可以是例如约200-约500nm，有良好表面质量(均方根粗糙度小于2nm)。

金属涂层可以由导电材料如金、银等金属，或其组合制成。这种层的厚度可以为约20nm-约80nm，包括中间值和范围，这取决于应用和材料选择。通过例如包括溅射和热蒸发在内的已知真空技术，可将金属沉积在硅膜上。实施方式中，可采用约40nm的薄金层，因为其具有很好的耐化学腐蚀性。可在金和硅之间加入薄(小于约5nm)金属层以改善薄膜粘附。铬或钛可对于此金属间层特别有用。

所公开SPR系统的重要组成是SiOG传感器芯片，其可允许宽动态范围和多种穿透深度。这类芯片的一个特别有用的特性是例如光源波长从720nm到1,500nm的2倍变化仅产生低于约0.5度SPR信号移位，如图6所示。当入射光束数值孔径跨数度时，此小角度移位可忽略。由于沿低数值孔径光束传播轴的场深度(即“聚焦深度”)比更高数值孔径光束高许多，样品在低数值孔径系统中心放置的范围相比更高数值孔径系统更宽大。此外，相较更高数值孔径光束，低数值孔径光束的波前对于色差和其他像差不太敏感。因此，光源波长改变即切换以获得不同穿透深度时，不需要额外的重新对齐。因此所有光源可用同一光束成形光学系统射入样品表面。SiOG传感器的此配置和能力使得可变穿透深度得以简单精巧地实现。小入射角(720-1,550nm上的22.75-23.25度)也使得检测单元非常紧凑，因为其不需要加入额外组件来补偿波长变化引起角移位。就图3所示常规SPR装置而言，不能使用类似配置获得类似性能。图5中，当波长从720nm(虚线)变为1,500nm(实线)时，常规系统的SPR响应移位约5度。图6还显示所公开SiOG芯片的SPR响应，当辐射波长从720nm(虚线)变为1,500nm(实线)时反射率随着入射角(AoI)的变化。

因此，可能需要给激光源添加许多额外的光学、机械或类似组件；例如，光束对齐、检测单元或两者，用于补偿波长变化引起的大角度移位。没有主动对齐和补偿光学系统下，由于角移位大10倍(10x)，常规SPR感测方法需要对各波长进行显著的重新对齐以确保芯片上的样品检测面积就各波长而言相同。测量过程中的这种重新对齐耗时且缓慢，因此在化学、生物或生化相关试验中很不可取。

所述光束可用有高折射率的棱镜来耦合于SiOG芯片。所述棱镜起光发射元件作用且确保适当波数量与SPR传感器等离子体模式匹配。所述棱镜可以具有平表面，或平和弯曲表面的组合以在撞击取样点前使光束再成形。为减少表面反射，所述表面可用抗反射涂层包被。在实施方式中，折射率优选与硅相同。波长大于约1.2微米时，硅是构建棱镜的优选材料(其在该波长变得透明)。对于广泛的穿透深度，可使用有高折射率的其他材料如GaP、TiO₂、LiNbO₃等材料，因为它们在可见光(即大于约500nm)和近红外光(即高至1,700nm)波长都是透明的。耦合棱镜的基础角可通过材料的折射率来确定。例如，由GaP制成的棱镜可具有如约20-约25度的基础角。

所述SiOG芯片提供相对基于硅晶片的传感器芯片的优点。芯片上有这种薄硅层(小于约500nm)时，可见光波长的光损失比基于硅晶片的传感器低许多(即约0.5mm厚的硅晶片在可见光波长不透明)。由于所述薄硅层的吸收低，所述用SiOG芯片的SPR传感器装置可使用可见光源用于高灵敏折射率测量。使用可见光提高了可选择的可得穿透深度范围，因而允许系统和传感器检测传感器表面附近样品的极薄层和极厚层的折射率变化。例如，用约500nm的光源可将穿透深度减至约77nm。

对于高通量，检测多个区域的响应可使用一些光电探测器阵列，或通过用例如光束缩小或放大系统在CCD相机上对多种响应进行光学作图。为提高灵敏度和消除环境变化，可使用“孔内(in-well)”参考方案，其中传感器上的1个样品区可分为2个。一半区域用特定表面化学屏蔽，从而SPR响应对某些事件不敏感，而另一半区域用于检测生物或生化事件。屏蔽区的SPR响应获得环境相关漂移(例如，由于温度变化引起)且可用作参比。通过减去参比的信号，可以减少激光、测量系统、热环境中的相关噪音。图5和图6显示常规和SiOG芯片基于角检测的SPR响应。与常规SPR相比，由于SiOG芯片的最小SPR相对较窄，可高精度测量浸渍位置并因而改善所得检测的灵敏度。另一特别有用的方面是宽动态范围(例如，比常规SPR大约5-约50倍)，使其能鉴定大细胞反应如细胞凋亡(细胞死亡)和脱落期间发生的反应。此宽动态范围可扩展SiOG传感器芯片用途以能够对例如有高折射率变化的聚合物薄膜生长进行SPR研究。

所公开的SiOG传感器芯片的穿透深度改善已由试验证实。用所述基于SiOG的传感器芯片和SPR测量系统相比市售可得SPR测量系统和传感器装置，完成比较试验。实验结果示于图7和图8。图7显示用所述基于SiOG的SPR系统对分层样本的示例性测量响应，所述样本由交替的聚丙烯胺盐酸(PAH)和聚苯乙烯磺酸钠(PSS)双层组成。可检测大于十八(18)个双层；第5个双层(710)；第10个双层(720)；第18个双层(730)。响应曲线随着时间的明显非线性性质可以是手动切换流体系统的人为产物，即切换段不恒定。所述系统超出角动态范围，即超出范围(750)，但显然这些层的构建未超过传感器感测体积(由穿透深度确定)。18个双层后观察到的幅度变化与初始双层几乎相同，这表明消逝场的穿透深度远大于18个双层的深度，18个双层的估计深度或总厚度为约90nm。尽管所述结果没有给出确切的穿透深度，但显然所述穿透深度对于大部分试验要求来说足够深。(740)处的失真代表泵重填间隔。

所述基于SiOG的系统可以检测PAH和PSS的交替填充层的折射率变化。使用此基于SiOG的传感器和所公开测量系统，能在其到达动态范围限制前检测多至十八(18)个双层。此外，由于第一个双层到最后(第18个)双层的阶梯高度间的差异小，还可推断增长的双层远没有达到消逝场的潜在穿透深度。

图8显示用现有技术SPR仪器(Biacore MUA)测量的比对性多层响应。相较图7中所述基于SiOG的SPR，图8的SPR仪器的最大动态范围限于五(5)个双层。随着加入层数量增加，如观察到的幅度变化(阶梯高度)减少所示,现有技术SPR传感器开始饱和并变得对额外层不太敏感。

市售可得的SPR测量系统和传感器芯片装置仅能检测五(5)个双层且随着层厚度增加发生的响应幅度减小表明加入层使系统测量传感器表面更远处折射率变化的能力饱和。使用基于SiOG的SPR传感器系统使SPR探测电磁场的穿透深度增加超过三倍(3X)。图9显示基于SiOG的SPR传感器系统响应(RU；以皮米计的响应单位)与PAH/PSS层总数的线性度，其中y=5.7918x-25.31且R²=0.9818。基于SiOG芯片的SPR响应在总共18个双层(910)上的线性度。所公开系统的线性关联性(910)与市售可得的SPR装置(920)类似。玻璃基硅(SiOG)构想公开于例如共有和受让的美国专利号7,176,528、7,192,844和7,399,681。

深度分辨细胞试验(DRCA)

所公开传感器系统已建模且给出建模细节。也给出了用所公开SPR传感器系统进行的细胞试验的实验结果。

SPR传感器系统中所公开传感器芯片例如金属硅处理基材(SiOG)的一个显著优点是能大幅减少不同波长SPR响应的角移位。因此，不同波长的多种光束能检测同一样品区而不需要复合光学系统来补偿大角移位，而角移位大是用BK7基材的常规SPR系统的一个问题特征。SiOG基材使用薄Si层作为光学材料，提供约3.5的折射率用以检测约600nm-约1,600nm的光。所述传感器芯片上Si层的高折射率可大幅降低不同波长下SPR响应的角移位。

为评估折射率如何影响角移位，在2个特定波长：800nm和1,600nm(0.8和1.6微米)对SPR响应建模。图10描述2种光束之间SPR响应的角差异随基材折射率的变化。图10显示折射率增加可大幅降低2种光束的角差异。为使角移位减至低于1度，基材的折射率应大于约2.4。更优选基材的折射率可为约3.0，从而2种光束可完全重叠。图11提供了在2个波长建模的SPR响应半角宽随折射率变化的图(上部曲线，0.8微米；下部曲线，1.6微米)。

基于建模结果，显然SiOG仅是许多合适材料组合中的一例。一般，如果材料或材料组合透明且在感兴趣波长范围内散射损失低，则折射率高于约2.4的任何材料可用作基材。所述基材材料可以是例如玻璃、晶体、半导体材料、薄膜涂层等材料，或其组合。

使用高折射率基材的另一益处是改善系统性能。在各种基材上以不同波长对SPR响应的半角宽随折射率的变化建模。图11中绘出所得结果。使用高折射率材料作为基材也可降低SPR响应的角宽，从而能精确测量其在位置传感器上的定位。因此，易于检测很小的角移位并从而改善装置灵敏度。

在实施方式中，所述基于SiOG的SPR传感器和SPR传感器系统能提供可变穿透深度而不削弱灵敏度。使用例如SiOG制得的基材能使装置纳入很小包装。以下列出了所公开传感器、设备和方法相较常规SPR系统和类似系统的一些细节和区别特征。

穿透深度增加超过五倍(5X)。常规SPR消逝场穿透深度为约300nm。所公开SPR传感器系统可获得穿透深度多至约1,500nm的消逝场。使用长波长光源(1,550nm相比760nm)大幅提高穿透深度。

大动态范围。使用SiOG芯片产生很窄的SPR角响应，使得其能在更大范围的角变化中被追踪。因此，对于入射光束中角输入的给定范围，可检测大折射率变化(例如，由生物或生化事件引起)。

广泛范围的可变穿透深度。使用高折射率棱镜将光耦合到传感器表面与多波长光源联合，产生可变穿透深度而不需对各波长变化进行额外的对齐。

高灵敏度。可以生产和完成具有高表面质量和低散射损失的所公开SPR芯片。另外，所述基于SiOG的SPR传感器产生窄SPR信号响应，其检测比常规SPR更准确。这提供高对比SPR信号来改善进行高灵敏测量的能力。

小尺寸。与入射光束以约60-约75度的SPR角在金属膜上撞击的常规SPR不同，所公开芯片和设备使SPR角减至小于25度。因此，所述装置更紧凑且更适合便携式系统。较小尺寸也可去除不必要的环境控制器以进一步降低系统成本。

高度多能性。所述基于硅的传感器芯片可以是整合SiOG SPR传感器系统与其他被动和主动装置如激光二级管、纳米线和光电探测器的平台，可用先进的半导体制造技术以高数量和高质量制成。因此，一些更精密和高灵敏检测技术可加入装置以获得多功能特征。表1提供了常规SPR和所述基于SiOG的SPR的列表比较。

表1.SPR和所述基于SiOG的SPR之间的对比

深度分辨细菌试验

在实施方式中，本公开提供设备和方法用于光学传感器的光学感测，特别是表面等离子体共振(SPR)传感器或角度解调系统或波长解调系统，用于监控对细菌细胞的调节作用。特定地，本公开提供用所述SPR光学传感器测量细菌细胞反应的条件。

细菌相较真核生物具有独特的细胞结构，如具有细胞壁。有2种细菌细胞壁：革兰氏阳性(G⁺)和革兰氏阴性(G^-)。G⁺和G^-细菌对给定化合物例如抗生素的响应不同。抗生素是天然或合成物质，可选择性抑制细菌或类似生命形式的生长。抗生素耐受性是公共健康的一个主要问题，且通常因为疾病和住院治疗的延长导致的直接成本，生产率损失导致的间接成本，发病和致死导致的社会成本而对医疗保健系统和社会都产生巨大的经济负担。抗生素耐受性是基于生物体选择的进化过程，所选生物体具有增强的能力以存活在原本致死性抗生素剂量下。抗生素本身作为选择压力，允许群体内的抗性细菌生长并抑制易感细菌。引起抗生素耐受性的潜在分子机制可有多种。内在抗性可由于细菌遗传构成而天然产生。抗生素耐受性也可通过质粒转移在不同细菌中扩散，其可导致对多种抗生素的共耐受。本公开提供了用无标记光学传感器测量抗生素对细菌细胞影响的方法。

细菌细胞的厚度可以是例如约500nm-约10微米。因此，在给定细胞深度，仅可检测某特定细胞事件。

为获得对细菌细胞内生物和化学活性的更全面描述，监控和测量不同深度的折射率可提供有价值的信息，参见下面的实施例5。然而，用常规无标记光学传感器同时监控不同深度很具有挑战性。

深度分辨核试验

在实施方式中，本公开提供用所述SPR光学传感器在某些穿透深度测量全细胞的一个或多个核事件的方法。

在实施方式中，本公开提供用多穿透深度SPR系统监控和鉴定对效应物的细胞-核反应的方法，如用深度分辨细胞试验分析调节化合物。

核是活细胞的控制中心，其中完成例如DNA复制、RNA转录。核受体(NR)在调节核功能中起关键作用。理解共调节蛋白与核受体间相互作用的复杂和不断扩张的网络对人细胞生物学有重要意义，且对许多疾病的新药物治疗也有重要作用。大部分现有研究涉及细胞破坏和多荧光标记。核通常远离细胞质膜且需要较深光学透射深度以对其进行监控。

所述核受体超家族含有广泛的转录因子，其包括核受体(NR)和孤核受体。与细胞表面受体的激素不同，亲脂性激素可以通过细胞膜进入细胞内部，核受体在此转导来自糖皮质激素、盐皮质激素、性激素(雌激素、黄体酮和雄激素)、维生素D₃或甲状腺激素的信号。

哺乳动物细胞高度通常为约1-约3微米。细胞是生物体的结构和功能单元。细胞内，有含蛋白和代谢物的细胞质，以及许多细胞器如核、线粒体、高尔基体和内质网，所有这些在细胞功能中都起关键作用。因此，在给定细胞深度，仅可检测特定细胞事件。为获得对细胞内情况的更全面描述，监控位于各种深度的细胞器的活性可提供有价值的信息。然而，用常规无标记光学传感器监控细胞器事件如核事件很具有挑战性。常规SPR光学系统下，随着入射光束波长变化，SPR信号发生大入射角改变。从约760nm到约1,550nm，SPR角变化大约4度。因此，SPR测量的任何静态光学系统需要设计成跨大数值孔径(即角动态范围)运行。在此情况中，所述范围甚至需要大于4度。可开发主动定位系统，但随后其必须在每次解调波长变化时准确改变入射角和光学重对齐。已知主动定位系统可能因为运转速度慢而很不可取，其会干扰试验条件，降低多波长数据采集速度，产生噪音和重复误差。在所述玻璃基硅SPR生物传感器系统下，光照辐射波长从约760nm加倍至约1,550nm时，产生仅约0.4度的SPR角移位，这是常规角移位的约十分之一(1/10)。所述玻璃基硅SPR生物传感器系统会产生近5倍的穿透深度增加，范围为约330nm-约1,500nm。在实施方式中，基于SiOG的SPR传感器可设计为静态系统，同时仍能在大范围穿透深度上几乎同时多波长检测。基于SiOG的SPR传感器可以做到这点而不需繁重的光路布局(大数值孔径)或无需定位系统。

在实施方式中，本公开提供同时评价不同深度的核事件的方法和光学传感器仪器设置，使用例如通路调节剂和人细胞系。以下列出了所公开核试验方法和设备相较常规SPR系统和类似系统的一些细节和区别特征。

无标记检测。可通过光学传感器检测并测量不同深度的核特异性细胞反应产生的综合信号。所测信号包括折射率、波长、解调角、或其组合的变化。

实时活细胞试验。通路调节剂对活细胞影响的检测可早至接触后30秒内。另外，可用多波长在单实验中监控细胞反应的连续效果/时程。

生理相关试验条件。所公开方法和设备还可在细胞培养基中用活的全细胞完成试验。

试验方法简单。细胞在经处理金传感器室底部生长后，加入效应物、调节剂或两者。然后，可用光学传感器如DRCA仪器测量动力学相互作用或终点读数。如需要，所公开方法易于自动化。

实施例

以下实施例用于更充分描述使用上述公开内容的方式，以及列出考虑用于完成本公开各个方面的最佳模式。应理解，这些实施例不限制本公开的范围，而是用于阐明目的。工作实施例进一步描述如何制备和使用本公开的物品和方法。

实施例1

制备传感器芯片和SPR传感器系统的方法传感器芯片制备自玻璃基硅(SiOG)基材。首先，SiOG芯片用美国专利号7,176,528、7,192,844和7,399,681所述方法制备。然后抛光表面以提供光学表面。随后，此基材用金层包被，采用常规金属涂层技术如热沉积、溅射沉积和电子束沉积。金层厚度可为例如约40nm。为改善粘附，在沉积金涂层前包被约5nm厚的薄Ti层。然后，传感器芯片结合蜂窝结构底部形成微板。金层可面向上，可与生物或生化样品直接或间接接触。

实施例2

用SPR传感器系统的SPR感测方法传感器系统由光源、光束成形器、棱镜、CCD相机和数据获取单元组成。用于所述设置的光源由在650nm、800nm、980nm和1500nm发射的4个激光二极管组成。来自这些光源的光束用单模纤维递送。光束通过光束成形器并经GaP棱镜靶向传感器芯片。传感器芯片经折射率与玻璃基材相同的折射率匹配油与棱镜物理接触。然后，可由CCD相机收集反射光束并由数据获取单元分析。在测量期间，各光束依序打开和关闭，同时CCD相机记录对应图象。CCD相机一次仅拍摄一张光源照。通过数据获取单元分析获取的图片。

实施例3

深度分辨细胞试验(DRCA)。用所公开SPR传感器系统进行细胞试验并获得良好结果。所公开SPR传感器系统的样本穿透深度是

无标记检测系统或常规SPR系统约3-4倍大。所公开SPR传感器系统能检测显著更多的生物事件。实际和比较结果各示于图12和图13。图12显示就细胞对ATP(三磷酸腺苷)处理反应的检测能力示例，用不依赖标记的检测共振波导

仪器(1210)和所公开SPR传感器系统DRCA(1220)测定。2种试验都显示随着时间的类似反应趋势。然而，所公开SPR传感器系统显示对强反应的更多细节。图13显示接触肾上腺素的细胞示例，并由

系统(1310)和所公开SPR传感器系统(1320)测量。所公开SPR传感器系统因为是连续过程所以可检测短至例如0.1秒间隔的生物事件，而

系统以约10秒的更长时间间隔检测事件。此结果进一步证明长穿透深度的重要性和多穿透深度能力对于细胞试验如何特别有用。

实施例4

深度分辨细菌试验。为证明所公开SPR传感器系统对细菌细胞试验的有效性，开发了用调节剂如青霉素的细胞试验平台。青霉素是β内酰胺类抗生素且可用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染。β内酰胺类抗生素抑制细菌细胞壁内形成肽聚糖交联且可引起有削弱或缺陷细胞壁的革兰氏阳性菌在渗透压下发生细胞溶解或死亡。另外，肽聚糖前体的积累可引起细菌细胞壁水解酶和自溶素的激活，其进一步消化细菌现有的肽聚糖。通过测量已知调节剂引起的细菌反应来证明用所公开SPR传感器系统检测调节剂影响细菌细胞的能力。所公开的深度分辨细胞试验可用作细菌试验的有效工具。

例如，包括所述基于SiOG的表面等离子体共振(SPR)传感器的光学传感器可用于监控抗生素对细菌的作用。细菌细胞可在传感器的经处理金表面上培养并沉积为薄层。然后，用调节剂处理培养的细菌细胞。细菌反应可用所公开多波长SPR平台如所述

深部分辨细胞试验(DRCA)仪器同时监控。

利用可变穿透深度，相同或类似设置和试验方案可用于其它类型的细菌。例如，对于一些悬浮细菌，引起更大穿透深度的更长波长光源可用于检测悬浮细菌反应而不需传感器上的特殊表面化学。通常，难以或甚至不能检测悬浮细菌的反应。另外，所公开传感器系统的多-或可变-深度能力还可适于研究由表面相互作用确定的细菌对表面化学的附着或脱离。在此情况中，可实现一些穿透深度并同时监控其响应。用此方法，可检测细菌何时及如何附着和脱离表面。

检测细菌反应

细菌细胞壁结构

革兰氏阳性生物体具有高肽聚糖细胞壁含量且细胞壁通常缺乏革兰氏阴性菌中所见外膜。革兰氏阴性菌具有薄肽聚糖层和含脂多糖的外膜。革兰氏阴性菌的致病性通常与外膜相关联。

通路调节剂

通路调节剂可对细胞生物学产生重要影响且能用于药物开发。

图14显示用所公开传感器系统测量的结果，表明青霉素对革兰氏阳性(G⁺)菌枯草芽孢杆菌(Bs)(1410)有显著影响而对革兰氏阴性(G^-)菌大肠杆菌(Ec)(1420)和具有重组pUC19质粒的大肠杆菌(1430)没有显著影响。缓冲液对照测量以追踪(1440)。

氨苄青霉素是β内酰胺类抗生素，有结合于青霉素结构的氨基侧链。氨苄青霉素能穿透革兰氏阳性和一些革兰氏阴性菌。其与青霉素的差异仅在于氨基的存在。此氨基有助于药物穿透革兰氏阴性菌的外膜。氨苄青霉素通过灭活细菌细胞膜内表面上的转肽酶来抑制细菌细胞壁的合成(肽聚糖交联)。氨苄青霉素能抑制枯草芽孢杆菌和大肠杆菌，但不能抑制有重组pUC19质粒的大肠杆菌。将很少量的细胞如0.05OD的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和大肠杆菌pUC19分开接种到加有氨苄青霉素(Ap)如100微克/毫升的生长培养基中。用DRCA连续监控细胞生长。图15显示细菌对氨苄青霉素反应的传感器系统结果，具体地，仅有pUC19(1510)和(1520)的大肠杆菌在有氨苄青霉素的培养基中存活和生长(顶部2条递增的曲线)。基线曲线(1530)显示Bs、Ec和缓冲液对照。有pUC19(1510)的大肠杆菌显示典型的细菌生长曲线。数据表明对于在传感器表面上或靠近其表面的细菌悬浮液，DRCA能检测细胞生长、质量增加或两者。

所公开的细菌试验是DRCA如何用于细菌试验的许多示例之一。类似设置和试验方案还可通过使用可变穿透深度用于其他类型的细菌。这可能特别有益于分析某些很少附于检测表面的细菌菌株。在这种情况中，引起大穿透深度的长波长光源可用于检测悬浮细菌的反应而不需要特殊表面化学。DRCA的多深度能力还可适于研究细菌因为生物学反应而附着或脱离各种表面化学。在这种情况中，选择一些穿透深度并同时监控响应。DRCA的穿透深度可以是例如约50nm-约2,600nm，约100nm-约1,600nm，包括中间值和范围。用此方法，可检测细菌何时及如何附着和脱离表面。实施例证明DRCA系统同时检测化合物对细菌细胞的影响。所公开细菌细胞试验方法可用于各种应用，包括例如用于微生物学、流行病学和药物开发等应用。

试剂、培养基和细菌氨苄青霉素和青霉素购自西格玛公司(密苏里州圣路易斯)。LB(Luria-Bertani)培养基和营养肉汤(NB)来自英杰公司(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌来自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)。

细胞培养许多细菌实验用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌进行。大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别在LB琼脂板或营养肉汤琼脂板上培养，并在4°C保持。然后，收集来自琼脂板的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌并分别接种于37°C的LB或30°C的营养肉汤共8小时。然后，大肠杆菌或枯草芽孢杆菌培养物用其培养基稀释获得600nm时的光密度(OD)为0.05，并进一步37°C培养2小时直到获得约1.8-约2.5的OD。连续稀释实验显示600nm的1个OD对应约4x10⁸个细胞/毫升。

DRCA系统和细菌细胞试验DRCA系统用于这些细菌细胞试验。对于细菌细胞试验，用如上所述的合适培养基使细菌细胞覆盖约90-约100%的底部表面，除非另有说明。所述细胞和化合物的板在仪器中孵育约60分钟以到达22°C。所有细胞试验研究在约22°C完成。

实施例6

深度分辨核试验(DRNA)为证明所述基于SiOG的SPR系统用于检测在大穿透深度发生的细胞核事件的有效性，开发了细胞试验平台，所述平台使用化学或生物通路调节剂如丙酸氟替卡松(FP)(衍生自氟替卡松的合成皮质类固醇，用于治疗例如哮喘和过敏性鼻炎；包括氟替卡松的其他商品名产品，如辅舒酮(Flovent，Flixotide)、辅舒良(Flonase，Flixonase)、舒利迭(Advair)和舒悦泰(Seretide))。丙酸氟替卡松是高亲和性和选择性的糖皮质激素受体(GR)激动剂。

在治疗上由于2个原因对糖皮质激素受体很感兴趣。第一，糖皮质激素受体的突变在库欣综合征(由皮质类固醇-皮质醇水平过度引起的内分泌疾病)、自身免疫疾病和一些癌症中起作用。第二，糖皮质激素受体配体已用于治疗各种医学病症，如哮喘、类风湿性关节炎和白血病。然而，这些配体在治疗中的应用由于不良副作用而受到限制，所述副作用如骨质流失、生长迟缓和下丘脑-垂体-肾上腺轴的抑制。对糖皮质激素受体和其调节的更好理解会有助于探寻糖皮质激素受体配体并可能产生具有所有抗炎症益处而无禁用副作用的治疗。通过用所公开SPR系统测量由已知通路调节剂引发的细胞反应，证明了检测核事件的能力。现有技术的光学传感器系统如

系统(康宁公司)或常规SPR平台(例如Biacore)由于穿透深度有限(例如小于约150-约200nm)而没有这种能力。所公开的深度分辨细胞试验(DRCA)可提供约30nm-约1,500nm的宽穿透深度。所公开的DRCA系统可提供的信息多于穿透深度较短的平台。

本公开提供用光学传感器来测量和鉴定细胞核事件的方法和平台。例如，包括表面等离子体共振(SPR)传感器在内的光学传感器可用于监控效应物如通路调节剂的核事件。在实施方式中，细胞可在经处理的金表面生长。所述处理可以是例如有机、无机或生物材料，其可形成层用于细胞附着、生长或两者。然后，用通路调节剂处理细胞。核反应用所公开多波长SPR平台同时监控，在此情况中所用平台为

深度分辨细胞试验(DRCA)仪器。深度分辨细胞试验结果清楚证明了核反应。

可采用特定调节剂引发核受体，而用DRCA仪器检测不同穿透深度的多个光学信号。发生核受体反应且相较细胞膜受体反应可以更深的穿透深度检测，例如，穿透深度应大于200nm。

在实施方式中，所述至少2种不同光源可以是例如在不同波长如约300nm-约1,700nm操作的照射源。可通过光电探测器如光电探测器阵列检测SPR信号。这种设置提供例如超过约1,500nm的可变穿透深度，动态范围数倍于常规SPR传感器。

如上所述，图2显示对于本公开基于SiOG的SPR传感器芯片(210)，计算的穿透深度与照明波长。此处所用的2种波长为808nm和980nm。关联穿透深度分别在356nm和572nm用圆圈表示。对所定深度如572nm，DRCA信号输出是自细胞底部0-572nm范围深度的信号的积分。

所公开DRCA细胞试验系统采用传感器芯片SPR系统实时监控和鉴定调节剂在不同穿透深度诱导的动态细胞事件。选择融合细胞以覆盖所述孔的金包被表面底部。然后，用化合物调节细胞反应。调节细胞反应可产生具有药物意义的值。例如，丙酸氟替卡松是选择性高亲和的糖皮质激素受体(GR)激动剂，用于治疗哮喘和过敏性鼻炎。葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline)目前将FP以Flovent(美国和加拿大)和Flixotide(EU)销售用于哮喘，以Flonase(美国和加拿大)和Flixonase(EU和巴西)销售用于过敏性鼻炎，将氟替卡松和沙美特罗的组合以Advair(美国和加拿大)或Seretide(EU)销售。活的全细胞研究可用于剖析FP药物的分子作用机制。由DRCA光学仪器通过细胞获得并记录某一深度范围的综合响应信号。

使用光学传感器检测细胞事件

真核细胞结构

活细胞在结构和功能上类似于生产厂。细胞内，有细胞质，其中分布着许多蛋白和代谢物。此外，有许多细胞器如核、线粒体、高尔基体和核糖体分布在细胞内，其在细胞功能中都起关键作用。跨细胞的不同深度可有独特细胞事件正在进行。

通路调节剂

通路调节剂可对细胞生物学研究有重要影响且能用作药物开发的有用工具。丙酸氟替卡松(FP)是衍生自氟替卡松的合成皮质类固醇，用于治疗例如哮喘和过敏性鼻炎。其是高亲和性和选择性糖皮质激素受体(GR)激动剂。GR是甾类激素激活的转录因子，参与炎症、糖稳态、骨细胞更新、细胞分化和肺成熟的过程。其属于广泛的核受体超家族，所述受体包括盐皮质激素、雌激素、孕酮、雄激素、过氧物酶增殖子、维生素D和甲状腺激素受体。GR的分子构成为N末端的激活功能-1结构域(AF-1)、中心的DNA结合域(DBD)和C末端的配体结合域(LBD)。GR配体是皮质类固醇类似物，包括地塞米松和氢化波尼松。不结合配体时，伴侣蛋白如hsp90和p23保留胞质中的GR。一旦激素结合，释放伴侣蛋白并发生二聚化，伴有完整受体的核易位。一旦在核内，GR可结合特异性DNA启动子元件或与特定转录因子‘串音’以抑制基因激活。GR在人体内几乎所有细胞中表达并调节控制发育、代谢和免疫应答的基因。由于受体基因以多种形式表达，其在不同身体部分有许多不同(多效性)效果。GR结合糖皮质激素时，其主要作用机制是调节基因转录。直接作用机制包括受体的同二聚化，经主动转运易位到核内，与激活基因转录的特定DNA响应性元件结合。此作用机制称为转活化。所述生物学反应也取决于细胞类型。

核受体试验

细胞内的不同穿透或分辨深度产生不同响应。图16显示用DRCA方法的核受体与调节剂的细胞试验结果，其中FP是丙酸氟替卡松；WV1是波长808nm(356nm深度)；WV2是波长980nm(572nm深度)；sec是秒；其中(1610)是WV2-ATP；(1620)是WV1-ATP；(1630)是WV1-FP；(1640)是WV2-FP；(1650)是WV1-缓冲液；和(1660)是WV2-缓冲液。

在信号转导途径中，ATP可用作以下的底物：磷酸化蛋白和脂类的激酶，使用ATP生成环化AMP的腺苷酸环化酶。ATP结合P2Y受体(GPCR)，后者存在于几乎所有人组织中基于其G蛋白偶联产生各种生物学功能。另外，ATP是生物学能量转化中的多功能核苷。图16的信号曲线表明最初几分钟内在胞质膜附近有主要细胞事件，因为短穿透深度的信号大于更长穿透深度。一种假设是ATP结合P2Y受体，进而引发显示为快速和大变化的明显细胞事件，所述变化可以是构象变化、胞质膜附近的质量变化、或两者。如果是此情况，应能发现不同细胞深度的差异。波长1(WV1)的平均响应应大于WV2。随着时间流逝，信号显著下降。然而，由于所述2种穿透深度间没有显著差异，可能表明ATP引发的细胞事件或多或少在这2种深度中(若非在全细胞内)平均分布。

另一重要观察是FP在2种穿透深度都引发核事件。结果表明356nm和572nm波长以及其对应穿透深度是在A431细胞核范围内。60分钟后出现的延迟信号可反映一些与核受体反应相关的后期细胞过程。信号在6小时后(21,600秒)到达平台。作为空白的缓冲液不引发显著响应。

还评估FP引发响应的特异性。细胞用试验缓冲液或米非司酮预处理约1-2小时，用FP攻击细胞。米非司酮是合成类固醇，在体内和体外用作黄体酮(PR)和糖皮质激素(GR)受体的选择性拮抗剂。对于GR，其亲和性高于地塞米松。对于PR，其也是沉默拮抗剂且亲和性高于黄体酮。拮抗剂米非司酮(mife)预处理细胞时，米非司酮显著阻断FP对GR的作用，而用试验缓冲液预处理的细胞不阻断FP的效果，如图17所示。图17显示用DRCA测量的核受体的特异性，其中(1710)是Mife和FP；(1720)是缓冲液和FP；(1700)是单独试验缓冲液，FP是丙酸氟替卡松；Mife是米非司酮；和sec是秒。结果表明，来自FP效果的主要作用因子衍生自糖皮质激素受体。所述试验对核受体示例-糖皮质激素受体有特异性。

结果证明用所公开DRCA系统在不同穿透深度用超过1种波长同时检测细胞-核事件的方法。通过改变穿透深度，例如从约50nm变为约3,000nm，可观察到远离胞质膜的细胞事件。用短和长穿透深度的多种组合，所公开DRCA系统可区分细胞事件定位。所公开系统可提供来自全活细胞试验的深度分辨细胞事件信息。所公开系统可为例如细胞生物学研究和药物开发方法提供重要价值。

试剂ATP、丙酸氟替卡松和米非司酮购自Tocris公司(密苏里州圣路易斯)。

细胞培养A431细胞购自美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)。A431细胞在加有10%胎牛血清(FBS)及抗生素的DMEM培养基中生长。A431的细胞数用贝克曼库尔特(Beckman-Coulter)粒子计数器(贝克曼库尔特，加利福尼亚州富勒顿)计数。将含约1-2x10⁵个A431细胞的40微升培养基接种到DRCA 80孔室的各孔中。所述孔在引入所述细胞前包被有胶原或纤连蛋白薄层。接种后，细胞在细胞生长培养箱中37°C生长24小时。

DRCA系统和细胞试验所公开DRCA系统用于此实验。对于细胞试验的细胞融合度用上述合适培养基达到约90-约100%，除非另有说明。所述细胞和化合物的板在仪器中孵育约60分钟以到达22°C。所有研究在22°C进行。

本公开已参考各种特定实施方式和技术作描述。然而，应理解可进行许多变化和改良而仍保留在本公开的精神和范围内。

Claims (28)

1.一种表面等离子体共振(SPR)传感器系统，所述系统包括：

提供入射光束的光源，所述光源具有至少2个波长；

提供入射光束成形和光束聚焦的第一光学系统；

包括透光性基材的传感器芯片，所述透光性基材在第一面上有高折射率棱镜以接受入射聚焦光束，在基材第二面上有约100nm-约5微米的硅层和在硅层上有约30nm-约80nm的金属层；

提供反射光束或发射光束收集的第二光学系统；

接受反射光束并检测SPR信号的光电探检测器；和

数据获取单元。

2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述系统还包括在金属层表面上的分析物，所述分析物包括生物制品、生化样本、细胞、细胞组分、细胞构建体、表面涂层，或其组合。

3.如权利要求2所述的系统，其特征在于，所述传感器具有至少约0.4微米的分析物穿透深度。

4.如权利要求1-3中任一项所述的系统，其特征在于，所述光源包括有跨越约400-约1,700nm的多种不同波长的多个光束。。

5.如权利要求1-4中任一项所述的系统，其特征在于，所述数据获取单元通过发现SPR最小角位置提供SPR角响应。

6.如权利要求1-5中任一项所述的系统，其特征在于，所述传感器芯片有折射率为约2.5-约4.0的高折射率层，所述棱镜的折射率为约2.5-约4.0。

7.如权利要求1-6中任一项所述的系统，其特征在于，所述基材上的硅层提供折射率为约3.5的光学材料，所述基材包括厚约10-约100微米的薄膜涂层，玻璃，晶体，半导体材料，或其组合，所述基材是透明的，所述基材的折射率大于约2.4，且所述基材在感兴趣波长范围内光损失低。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述系统还包括切换照射光源、照射波长或其组合的装置。

9.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述切换装置包括人工操纵切换、自动机器切换，或其组合。

10.一种传感器芯片，所述芯片包括：

透光性基材，所述透光性基材的第一面上有约100-约2,000nm的硅层和硅层上的金层；和

所述透光性基材第二面上的高折射率棱镜。

11.如权利要求10所述的传感器芯片，其特征在于，所述传感器芯片包括厚约100-约1,000nm的硅。

12.一种有扩展穿透深度的表面等离子体共振方法，所述方法包括：

提供权利要求2所述的传感器系统；

用光源照射分析物；

用光电探检测器检测SPR信号；

用数据获取单元分析测得的SPR信号；和

将所测得SPR信号与分析物事件相关联。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述基材包括有高折射率的材料以减少SPR响应差异。

14.如权利要求12-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测包括多波长SPR光电探测器且没有复合光学系统。

15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述基材的折射率为至少2.4，所述棱镜折射率为至少2.4。

16.如权利要求12-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述光源发射约0.4微米-约1.7微米的至少2个或更多波长。

17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩展的穿透深度为约400nm-约1,500nm。

18.如权利要求12-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述光源包括聚焦光束以照射分析物并激发SPR。

19.一种深度分辨感测生物实体的方法，所述方法包括：

提供表面等离子体共振(SPR)传感器系统，所述系统包括：

提供入射光束的光源，所述光源具有至少2个波长；

提供入射光束成形和光束聚焦的第一光学系统；

包括透光性基材的传感器芯片，所述透光性基材在第一面上有高折射率棱镜以接受入射聚焦光束，在基材第二面上有约100nm-约5微米的硅层和硅层上约30nm-约80nm的金属层，和硅层上的贵金属层；

提供反射光束或发射光束收集的第二光学系统；

接受所收集光束并检测SPR信号的光电探测器；

数据获取单元；和

传感器芯片表面的贵金属外表层上的生物实体；

用至少2个不同波长照射传感器，所述不同波长各具有不同穿透深度；

监控所述不同波长各自的折射率变化；和

将所述折射率变化与生物实体的变化相关联。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在用所述2个不同波长中的至少一个照射传感器之前、期间、或之后，将生物实体与第二实体接触，所述第二实体包括化合物、生物制品、或其组合。

21.如权利要求19-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物实体包括细胞膜受体、胞内受体、细胞核受体、亚细胞组分，或其组合。

22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物实体包括细胞、细胞培养物、细胞组分、细胞构建体、病毒、朊病毒，或其组合。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述细胞培养物具有约70-约100%的细胞密度，细胞培养物融合度为约70-约100%，试验缓冲液是HBSS。

24.如权利要求19-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将生物实体置于传感器芯片表面之前，所述表明含有机聚合物、无机聚合物或其组合。

25.如权利要求19-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物实体包括真核细胞受体、原核细胞受体、合成的细胞构建体、其组分、或其组合。

26.如权利要求19-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少2个不同波长包括多个不同波长。

27.如权利要求19-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少2个不同波长包括3-20个不同波长。

28.如权利要求20-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二实体是调节剂、效应物、或其组合。

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