CN102634533A - 诺如病毒核酸标准样品的制备方法 - Google Patents
诺如病毒核酸标准样品的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102634533A CN102634533A CN2012100827602A CN201210082760A CN102634533A CN 102634533 A CN102634533 A CN 102634533A CN 2012100827602 A CN2012100827602 A CN 2012100827602A CN 201210082760 A CN201210082760 A CN 201210082760A CN 102634533 A CN102634533 A CN 102634533A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- norovirus
- pcr
- reverse transcription
- rna
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种诺如病毒核酸标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：提取诺如病毒RNA；RT-PCR反应；目标基因的纯化；目的片段的连接转化；回收质粒；体外转录。本发明不仅制备过程省时省力，而且所制备的诺如病毒核酸标准样品稳定性高、均匀性好，可以为诺如病毒检测研究、医药研究、应用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒核酸标准样品的制备方法，尤其是一种省时省力、稳定性高、均匀性好的诺如病毒核酸标准样品的制备方法。
背景技术
诺如病毒（Norovirus，NV），属杯状病毒科、沃克病毒属的小圆状结构病毒，呈2O面体对称，无包膜，电镜下缺乏显著的形态特征，与动物嵌杯病毒不同的是没有明显的嵌杯凹陷或表面孔洞，在氯化铯（CsCl）中的浮密度为1.38~1.41 g／cm。对各种理化因子的抵抗力较强，耐乙醚、酸及热，100℃ 30分钟不能完全灭活。
诺如病毒在病毒引起的肠道传染病中属常见的致病源，它已成为非细菌性肠胃炎的最主要致病源。该病毒传染性极强，容易引起暴发流行，若治疗不及时或治疗方法不正确，轻者影响人体的生长发育，严重者可导致脱水死亡。近年来，该病毒引起的病例有上升的趋势，对该病的诊断控制尤为重要，但由于诺如病毒不能体外繁殖、无动物模型、不能用组织培养法或动物实验进行分离检测等，阻碍了对该病的病原学、致病机理、诊断方法的研究和防治措施的制订。
由于该病毒不但具有上述的特殊性，而且该病毒属于RNA病毒，其RNA极其容易被降解，各自实验室提取RNA病毒，不但费时费力，而且很难保持其稳定性和均匀性，难以保证实验室的质量控制。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种省时省力、稳定性高、均匀性好的诺如病毒核酸标准样品的制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种诺如病毒核酸标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
a. 提取诺如病毒RNA
在离心管中加入Trizol裂解液1000μl、感染诺如病毒粪便200μl、加入氯仿200μl震荡混匀，10 000 g离心15min；吸取上清液500μl加入到500μl异丙醇中，反复颠倒混匀，10 000 g离心15min；弃去上清后，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入75%的酒精1000μl，颠倒洗涤，10 000 g离心10min；再弃去上清后，倒置于吸水纸上，沾干液体；4 000g离心10sec，用吸干管底的液体，室温干燥3 min；加入11.5μl的DEPC水，溶解管内的RNA，2 000g离心5sec，4℃保存，做为模板备用；
b. RT-PCR反应
b-1. 反转录体系
5×M-MLV Buffer 4μl，dNTPs（各2.5mmol/L）2μl，M-MLV（5U/μl）1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，反转录游引物（20pmol/μL）1μl，a步骤所得RNA模板11.5μl；所述反转录游引物是5’-TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’；
b-2. 反转录条件
42℃水浴1h~2h；
b-3. PCR扩增反应体系
10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5μl，dNTPs（各2.5mmol/L）0.5μl，Taq DNA聚合酶（5U/μL）1μl，上游引物、下游引物（20pmol/μl）各1μl，b-2的反转录产物0.5μl，用无菌水补充至25μl；
所述上游引物是5’-TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’；
所述下游引物是5’-TCACTATGATGCTGATTACTC-3’；
b-4. PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃ 5min；4℃保存；
c. 目标基因的纯化
采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒，回收目标分子DNA片段；
d. 目的片段的连接转化
d-1连接体系
c步骤所得到的纯化的目的片段4μl，2×Rapid ligation buffer 5μl，PGEM-T载体0.5μl，T4 DNA Ligase 0.5μl，室温连接1h；
d-2 转化
将上一步骤的连接产物加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴20min，42℃热应激1min，冰浴2min，加入800μl SOC培养基，150g摇菌1.5h，1 000g离心10min，弃去培养液，加入新鲜的SOC培养基200μl，混匀后涂在含有Amp+的LB平板上，风干后，37℃倒置培养12h~110h；
d-3 阳性克隆的筛选
挑取单克隆菌进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选，PCR体系及反应条件如b-3、b-4；
e. 回收质粒；
f.体外转录
将e步骤所得质粒用SalI进行单酶切，反应体系为：10×H Buffer 5μl，SalI 1μl，质粒 10μl，双蒸水 34μl；37℃2h，用Omega回收试剂盒回收线性化质粒；转录反应体系为：10×T7 RNA polymerase buffer 5μl，DTT 5μl,NTP 10μl，Rnasin 1μl，线性化质粒5μl，T7 RNApolymerase 1μl，DEPC处理水28μl；37℃2h，然后再加入10U DnaseI 2μl，37℃，30min。
本发明不仅制备过程省时省力，而且所制备的诺如病毒核酸标准样品稳定性高、均匀性好，可以为诺如病毒检测研究、医药研究、应用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。
附图说明
图1是本发明实施例诺如病毒聚合酶基因的RT-PCR扩增电泳图。
图2是本发明实施例诺如病毒聚合酶基因系统发育树。
具体实施方式
a. 提取诺如病毒RNA在离心管中加入Trizol裂解液1000μl、人感染诺如病毒粪便200μl（购于中国疾病预防控制中心）、同时设阳性对照、阴性对照。加入氯仿200μl震荡混匀，10 000 g离心15min；吸取上清液500μl加入到500μl异丙醇中，反复颠倒混匀，10 000 g离心15min；弃去上清后，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入75%的酒精1000μl，颠倒洗涤，10 000 g离心10min；再轻轻弃去上清后，倒置于吸水纸上，沾干液体；4 000g离心10sec，用微量加样器吸干管底的液体，室温干燥3 min；加入11.5μl的DEPC水，轻轻混匀，溶解管内的RNA，2 000g离心5sec，4℃保存，做为模板备用；
b. RT-PCR反应
b-1. 反转录体系
5×M-MLV Buffer 4μl，dNTPs（各2.5mmol/L）2μl，M-MLV（5U/μl）1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，反转录游引物（20pmol/μL）1μl，a步骤所得RNA模板11.5μl；所述反转录游引物是5’-TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’；
b-2. 反转录条件
42℃水浴1h~2h；
b-3. PCR扩增反应体系
10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5μl，dNTPs（各2.5mmol/L）0.5μl，Taq DNA聚合酶（5U/μL）1μl，上游引物、下游引物（20pmol/μl）各1μl，b-2的反转录产物0.5μl，用无菌水补充至25μl；
所述上游引物是5’-TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’；
所述下游引物是5’-TCACTATGATGCTGATTACTC-3’；
上述引物均为人工合成；
b-4. PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃ 5min；4℃保存；
PCR电泳结果如图1所示：图中出现明显目的条带，M为DL2 000 Marker；1为诺如病毒聚合酶基因；2为阴性对照；
c. 目标基因的纯化
采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒（货号DV805A），并按其操作说明回收目标分子DNA片段；
d. 目的片段的连接转化
d-1连接体系
c步骤所得到的纯化的目的片段4μl，2×Rapid ligation buffer 5μl，PGEM-T载体0.5μl，T4 DNA Ligase 0.5μl，室温连接1h；
d-2 转化
将上一步骤的连接产物加入到感受态细胞（购于大连宝生物公司）中，轻轻用移液器混匀，冰浴20min，42℃热应激1min，冰浴2min，加入800μl SOC培养基，150g摇菌1.5h，1 000g离心10min，弃去培养液，加入新鲜的SOC培养基200μl，混匀后涂在含有Amp+的LB平板上，风干后，37℃倒置培养12h~110h；
d-3 阳性克隆的筛选
挑取单克隆菌进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选，PCR体系及反应条件如b-3、b-4；
e. 回收质粒；
应用Omega公司质粒回收试剂盒回收质粒；
f.体外转录
将e步骤所得质粒用SalI进行单酶切，反应体系为：10×H Buffer 5μl，SalI 1μl，质粒 10μl，双蒸水 34μl；37℃2h，用Omega回收试剂盒回收线性化质粒；转录按照宝生物公司体外转录试剂盒说明书进行。反应体系为：10× T7 RNA polymerase buffer 5μl，DTT 5μl,NTP 10μl，Rnasin 1μl，线性化质粒5μl，T7 RNApolymerase 1μl，DEPC处理水28μl；37℃2h，然后再加入10U DnaseI 2μl，37℃，30min。
将e步骤所回收的质粒通过宝生物公司ABI 3730进行测序。结果如下
TCACTATGATGCTGATTACTCCCGGTGGGACTCAACACAACAAAGAGCCGTGTTAGCAGCGGCTTTAGAAATCATGGTCAAGTTCTCCCCAGAGCCGCATCTGGCCCAAAAGGTTGCAGAAGACCTTCTTTCTCCCAGTGTGATGGACGTGGGTGATTTTAAAATATCAATCAATGAGGGTCTCCCCTCCGGGGTGCCCTGCACCTCCCAATGGAATTCCATCGCCCACTGGCTCCTCACTCTATGTGCACTCTCTGAGGTTACAAACCTGTCCCCTGACATTATCCAGGCCAACTCTCTCTTTTCTTTCTACGGTGATGATGAAATTGTGAGCACAGACATAAAATTGGACCCAGAAAAGCTGACAGCAAAACTCAAGGAATACGGGTTGAAACCGACCCGCCCTGACAAGACTGAGGGACCCCTTGTTATCTCTGAAGACCTGGATGGCCTAACCTTCCTGCGGAGGACCGTGACCCGCGACCCAGCAGGCTGGTTTGGAAAGTTGGAACAGAGTTCAATACTCAGACAAATGTATTGGACTAGGGGCCCCAACCATGAAGACCCATCTGAAACAATGATACCACACTCCCAGAGGCCCATACAATTGATGTCTTTGCTGGGTGAGGCCGCACTCCACGGCCCAGCATTCTACAGCAAAATCAGCAAACTGGTCATTGCAGAGTTGAAGGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCAAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCGGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGTTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGA
本发明扩增了诺如病毒聚合酶基因的部分片段，全长823bp，将本发明毒株聚合酶基因序列提交NCBI数据库进行核苷酸序列相似性检索，结果表明该毒株序列与GII-4基因群序列核苷酸相似性最高。见表1。
表1诺如病毒聚合酶基因核苷酸序列blast结果
| 注册号 | 毒株名称 | 核苷酸序列相似性 |
| AB2947810.1 | Hu/GII-4/Funabashi/0501001/2005/JP | 99% |
| AB294787.1 | Hu/GII-4/Ichikawa/050701/2005/JP | 99% |
| AB294782.1 | Hu/GII-4/Chiba/040974/2004/JP | 99% |
| AB220925.1 | Hu/Chiba/04-974/2004/JP | 99% |
| AB220923.1 | Hu/Ehime/05-30/2005/JP | 99% |
| AB294791.1 | Hu/GII-4/Inba/0101099/20010/JP | 99% |
| AB447448.1 | Hu/GII-4/Sakai2/20010/JP | 98% |
| AB220921.1 | Hu/Chiba/04-1050/2005/JP | 98% |
| AB220922.1 | Hu/Sakai/04-179/2005/JP | 99% |
| EU187437.1 | Hu/5017.34/2003/JPN | 98% |
经Philip软件绘制进化树，如图2，结果表明本发明毒株与Hu/GII-4/Inba/0101099/20010/JP 的亲缘关系最近，由同一毒株衍化而来，与其他毒株的亲缘关系较远。
均匀性和稳定性检验：
均匀性检验结果：
取本发明实施例制备的诺如病毒核酸标准样品，随机分成A、B两组，每组分别为2×15个样品，采用病毒半数感染量的检测方法，在重复条件测试2×15份样品A和2×15份样品B的病毒的半数感染量。结果数据用单因素方差分析进行统计处理，统计步骤及结果见表2、表3、表4。
表2 样品A均匀性试验结果表
表3 样品B均匀性试验结果表
表4 样品均匀性检验
稳定性试验结果
采用两种类型的稳定性试验：一种是在贮存温度（-20℃）下的稳定性试验，随机取本发明实施例标准样品24份，分成A、B两组，每个月同一天A、B两组各检测1份，共计12个月，另一种是在较高的温度（模拟样品的运输条件4℃）下的稳定性试验，随机取本发明实施例标准样品14份，每1天检测2份共计7天测试结果见下表5、表6。
表5 稳定性检验实验（-20℃）
表6 稳定性检验实验（4℃）结果
定值方法
随机选10个本发明制备的诺如病毒核酸标准样品，用SN/T 1635-2005中“贝类中诺沃克病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法” 所示进行定值试验，结果完全一致，均为诺如病毒核酸阳性。
本诺如病毒核酸标准样品经中国检验检疫科学研究院、山东检验检疫局、珠海检验检疫局、山西检验检疫局、大连疾病预防控制中心协作试验定值结果统计见表7。
表7 协作试验定值结果表
应用SN/T 1635-2005规定的方法对本标准样品的定值实验结果均为诺如病毒核酸阳性。
序列表
<110> 大连民族学院
<120> 诺如病毒核酸标准样品的制备方法
<160> 4
<210> 1
<211> 823
<212> DNA
<213> 诺如病毒（NOROVIRUS）
<400> 1
TCACTATGATGCTGATTACTCCCGGTGGGACTCAACACAACAAAGAGCCGTGTTAGCAGCGGCTTTAGAAATCATGGTCAAGTTCTCCCCAGAGCCGCATCTGGCCCAAAAGGTTGCAGAAGACCTTCTTTCTCCCAGTGTGATGGACGTGGGTGATTTTAAAATATCAATCAATGAGGGTCTCCCCTCCGGGGTGCCCTGCACCTCCCAATGGAATTCCATCGCCCACTGGCTCCTCACTCTATGTGCACTCTCTGAGGTTACAAACCTGTCCCCTGACATTATCCAGGCCAACTCTCTCTTTTCTTTCTACGGTGATGATGAAATTGTGAGCACAGACATAAAATTGGACCCAGAAAAGCTGACAGCAAAACTCAAGGAATACGGGTTGAAACCGACCCGCCCTGACAAGACTGAGGGACCCCTTGTTATCTCTGAAGACCTGGATGGCCTAACCTTCCTGCGGAGGACCGTGACCCGCGACCCAGCAGGCTGGTTTGGAAAGTTGGAACAGAGTTCAATACTCAGACAAATGTATTGGACTAGGGGCCCCAACCATGAAGACCCATCTGAAACAATGATACCACACTCCCAGAGGCCCATACAATTGATGTCTTTGCTGGGTGAGGCCGCACTCCACGGCCCAGCATTCTACAGCAAAATCAGCAAACTGGTCATTGCAGAGTTGAAGGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCAAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCGGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGTTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGA
<210> 2
<211>21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc feature
<223> 引物
<400>2
TCATTCGACGCCATCTTCATT
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc feature
<223> 引物
<400> 3
TCATTCGACGCCATCTTCATT
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc feature
<223> 引物
<400> 4
TCACTATGATGCTGATTACTC
Claims (1)
1.一种诺如病毒核酸标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
a. 提取诺如病毒RNA
在离心管中加入Trizol裂解液1000μl、感染诺如病毒粪便200μl、加入氯仿200μl震荡混匀，10 000 g离心15min；吸取上清液500μl加入到500μl异丙醇中，反复颠倒混匀，10 000 g离心15min；弃去上清后，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入75%的酒精1000μl，颠倒洗涤，10 000 g离心10min；再弃去上清后，倒置于吸水纸上，沾干液体；4 000g离心10sec，用吸干管底的液体，室温干燥3 min；加入11.5μl的DEPC水，溶解管内的RNA，2 000g离心5sec，4℃保存，做为模板备用；
b. RT-PCR反应
b-1. 反转录体系
5×M-MLV Buffer 4μl，dNTPs（各2.5mmol/L）2μl，M-MLV（5U/μl）1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，反转录游引物（20pmol/μL）1μl，a步骤所得RNA模板11.5μl；所述反转录游引物是5’-TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’；
b-2. 反转录条件
42℃水浴1h~2h；
b-3. PCR扩增反应体系
10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5μl，dNTPs（各2.5mmol/L）0.5μl，Taq DNA聚合酶（5U/μL）1μl，上游引物、下游引物（20pmol/μl）各1μl，b-2的反转录产物0.5μl，用无菌水补充至25μl；
所述上游引物是5’-TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’；
所述下游引物是5’-TCACTATGATGCTGATTACTC-3’；
b-4. PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃ 5min；
c. 目标基因的纯化
采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒，回收目标分子DNA片段；
d. 目的片段的连接转化
d-1连接体系
c步骤所得到的纯化的目的片段4μl，2×Rapid ligation buffer 5μl，PGEM-T载体0.5μl，T4 DNA Ligase 0.5μl，室温连接1h；
d-2 转化
将上一步骤的连接产物加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴20min，42℃热应激1min，冰浴2min，加入800μl SOC培养基，150g摇菌1.5h，1 000g离心10min，弃去培养液，加入新鲜的SOC培养基200μl，混匀后涂在含有Amp+的LB平板上，风干后，37℃倒置培养12h~110h;
d-3 阳性克隆的筛选
挑取单克隆菌进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选，PCR体系及反应条件如b-3、b-4；
e. 回收质粒；
f. 体外转录
将e步骤所得质粒用SalI进行单酶切，反应体系为：10×H Buffer 5μl，SalI 1μl，质粒 10μl，双蒸水 34μl；37℃2h，用Omega回收试剂盒回收线性化质粒；转录反应体系为：10× T7 RNA polymerase buffer 5μl，DTT 5μl,NTP 10μl，Rnasin 1μl，线性化质粒5μl，T7 RNApolymerase 1μl，DEPC处理水28μl；37℃2h，然后再加入10U DnaseI 2μl，37℃，30min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012100827602A CN102634533A (zh) | 2012-03-27 | 2012-03-27 | 诺如病毒核酸标准样品的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012100827602A CN102634533A (zh) | 2012-03-27 | 2012-03-27 | 诺如病毒核酸标准样品的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102634533A true CN102634533A (zh) | 2012-08-15 |
Family
ID=46619109
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012100827602A Pending CN102634533A (zh) | 2012-03-27 | 2012-03-27 | 诺如病毒核酸标准样品的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102634533A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103031386A (zh) * | 2012-12-10 | 2013-04-10 | 浙江大学 | 一种检测人杯状病毒的三重荧光定量rt-pcr试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102304514A (zh) * | 2011-01-27 | 2012-01-04 | 湖州市疾病预防控制中心 | 一种引物及利用该引物检测gⅰ型gⅱ型诺如病毒的方法 |
-
2012
- 2012-03-27 CN CN2012100827602A patent/CN102634533A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102304514A (zh) * | 2011-01-27 | 2012-01-04 | 湖州市疾病预防控制中心 | 一种引物及利用该引物检测gⅰ型gⅱ型诺如病毒的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 杜雄伟等: "诺如病毒聚合酶基因的扩增及其遗传变异研究", 《中国病原生物学杂志》, vol. 6, no. 10, 31 October 2011 (2011-10-31) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103031386A (zh) * | 2012-12-10 | 2013-04-10 | 浙江大学 | 一种检测人杯状病毒的三重荧光定量rt-pcr试剂盒 |
| CN103031386B (zh) * | 2012-12-10 | 2014-01-08 | 浙江大学 | 一种检测人杯状病毒的三重荧光定量rt-pcr试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhou et al. | Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin | |
| CN105412153A (zh) | 间充质干细胞分泌的外泌体在制备防治丙型肝炎病毒药物中的应用 | |
| CN108950068B (zh) | 一种鸡传染性支气管炎病毒qx型毒株鉴别检测试剂盒 | |
| CN112481154B (zh) | 一种绵羊肺炎支原体疫苗株、由该疫苗株制备得到的疫苗组合物及其应用 | |
| Spackman et al. | Multiplex real-time reverse transcription–polymerase chain reaction for the detection of three viruses associated with poult enteritis complex: turkey astrovirus, turkey coronavirus, and turkey reovirus | |
| CN110862968A (zh) | Map3k8基因敲除pk-15细胞系的构建方法及其应用 | |
| CN116254270A (zh) | 抗严重急性呼吸系统综合征ii型冠状病毒sars-cov-2的中和抗体 | |
| CN103966359A (zh) | 番鸭呼肠孤病毒通用型rt-pcr检测引物及检测方法 | |
| CN104561092B (zh) | 表达猪瘟病毒e2蛋白重组prrs病毒基因工程疫苗的构建方法和应用 | |
| Abba et al. | In vitro isolation and molecular identification of reptarenavirus in Malaysia | |
| CN113564133B (zh) | 柯萨奇病毒a16型毒株及其免疫原性组合物和应用 | |
| CN102876810A (zh) | 一种鲤春病毒血症病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| Berthet et al. | Complete genome characterization of the Arumowot virus (unclassified Phlebovirus) isolated from Turdus libonyanus birds in the Central African Republic | |
| CN109897825A (zh) | 一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统 | |
| CN102634533A (zh) | 诺如病毒核酸标准样品的制备方法 | |
| CN102533672A (zh) | 一种猪捷申病毒的体外分离方法 | |
| Gopi et al. | Molecular diagnosis and adaptation of highly virulent infectious bursal disease virus on chicken embryo fibroblast cell | |
| Chen et al. | Delayed protein shut down and cytopathic changes lead to high yields of infectious pancreatic necrosis virus cultured in Asian Grouper cells | |
| CN102634532A (zh) | 传染性造血器官坏死病毒分子标准样品的制备方法 | |
| Soltanialvar et al. | Genetic analysis of polymerase complex (PA, PB1 and PB2) genes of H9N2 avian influenza viruses from Iran (1999 to 2009) | |
| CN104694561B (zh) | 表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的prrsv重组质粒的构建方法以及应用 | |
| CN111411087A (zh) | 一种鲤疱疹病毒ii型弱毒株及其应用 | |
| CN108210497B (zh) | 化合物mln4924在制备布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒抑制剂的应用 | |
| CN106435030B (zh) | 一种联合检测禽流感h7n9和h9n2的四通道荧光定量pcr检测方法及试剂盒 | |
| Ahmadi et al. | SARS-CoV2 spike protein displays biologically significant similarities with paramyxovirus surface proteins; a bioinformatics study |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120815 |