CN102634442A - 一种连续结晶生物制造丁二酸的装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种连续结晶生物制造丁二酸的装置及方法，所述的装置包括：生物反应器(1)、错流膜组件(2)和结晶分离罐(3)；所述的错流膜组件(2)的前端通过管路连通生物反应器(1)，错流膜组件(2)的滤过端连通结晶分离罐(3)底部，结晶分离罐(3)的顶部连通反应器(1)，使该装置形成回路，实现了丁二酸的连续发酵、结晶；所述的生物反应器(1)和错流膜组件(2)之间设置蠕动泵(9)；所述的错流膜组件(2)后端和生物反应器(1)连通，实现了流穿发酵液在两者之间的循环。本发明的一种连续结晶生物制造丁二酸的装置和方法，建立了一个低温结晶原位提取丁二酸发酵分离的耦合系统，满足消毒灭菌和无污染运转。

Description

一种连续结晶生物制造丁二酸的装置及方法

技术领域

本发明涉及丁二酸发酵与分离纯化领域，具体地，本发明涉及一种连续结晶生物制造丁二酸的装置及方法。

背景技术

丁二酸(Succinic Acid又名Succinic Acid，Butanedioic Acid)，被美国FDA认定为“一般认为安全”(GRAS)，因此可以用于多种用途。2004年美国能源部的一份报告指出，丁二酸是合成大宗日用品和重要化学品的平台化学物质，有着巨大的经济价值，随着能源紧缺，利用生物发酵法制造丁二酸的前景非常广阔。

丁二酸成本主要由发酵过程和分离费用组成，其中分离纯化的成本占总生产成本的60％以上，如何降低发酵和分离成本是国内外的研究热点，已经出现了一定数量的专利。目前专利及文献中报道的丁二酸的分离纯化方法主要有钙盐法(CN101643400、US5143834)、液液萃取法(US5,773,653)、吸附法(CN101348428、CN101348429、CN101811953A)、电渗析法(CN101486637A)、膜分离(CN101748161A)等方法。这些分离纯化的手段都会遇到副产物杂酸、杂质、碳源、蛋白和无机盐的影响；并且将结晶操作作为最后的纯化步骤以精制丁二酸。丁二酸分离纯化的难度主要在于它与副产物有机羧酸的性质太类似。从理化性质上分析，这些短链的有机羧酸分子室温下物理化学行为相似，增加了丁二酸分离的选择性难题。

目前在丁二酸的制备过程中，通常是先进行发酵，发酵完成进行膜过滤，结晶，再进行纯化，对应每个过程的装置也是单独的、分开的，因此先发酵后放罐进行处理，而且在丁二酸发酵过程中，丁二酸的积累会抑制发酵过程，降低产物浓度，是阻碍丁二酸发酵产业化的重要因素；同时由于丁二酸的每部分装置都是独立的，造成了丁二酸的生产不能连续的进行。现有的微生物发酵法生产丁二酸的过程大都是间歇操作，即发酵完成后放罐，放罐料液进入下游分离纯化的化工单元操作，周期长，时间产率低；各个单元之间彼此孤立，通常一个单元超负荷运作同时，其它单位停车，生产效率很低。在制备丁二酸的过程中不可避免的会产生其它副产物有机酸、丁二酸根离子(丁二酸盐)和蛋白，这些副产物的产生也会对丁二酸的发酵体系产生抑制，限制了丁二酸产业的发展。

因此为解除产物的抑制作用，需要将发酵产物及时转移，降低产物浓度，解除产物的抑制作用，推动发酵过程向丁二酸转化，强化丁二酸发酵过程，提高底物转化率。

发明内容

本发明的目的在于为了克服上述问题提供了一种连续结晶生物制造丁二酸的装置。

本发明的再一目的在于提供了一种连续结晶生物制造丁二酸的方法。

为了克服上述问题本发明的连续结晶生物制造丁二酸的装置包括：生物反应器1、错流膜组件2和结晶分离罐3；

所述的错流膜组件2的前端通过管路连通生物反应器1，错流膜组件2的滤过端连通结晶分离罐3底部，结晶分离罐3的顶部连通反应器1，使该装置形成回路，实现了丁二酸的连续发酵、结晶；

所述的生物反应器1和错流膜组件2之间设置蠕动泵9；

所述的错流膜组件2后端和生物反应器1连通，实现了流穿发酵液在两者之间的循环。

作为上述方案的一种改进，所述的结晶分离罐3为若干个，该结晶分离罐3顶部通过一三通阀门分别连通生物反应器1、相邻结晶分离罐3；所述的若干结晶分离罐3并联后的管路上设置一蠕动泵9，通过该蠕动泵9连通一低位储液罐5，用于母液的储存。

作为上述方案的又一种改进，所述的结晶分离罐3的底部通过一三通阀门分别连通错流膜组件2和相邻结晶分离罐3；所述的若干结晶分离罐3并联后的管路连通一低位储液罐5，用于母液的储存。

作为上述方案的再一种改进，所述的生物反应器1的中部连通若干中位储液罐7，两者之间设置蠕动泵9；生物反应器1的上部连通若干高位储液罐8，两者之间设置蠕动泵9。

作为上述方案的再一种改进，所述的生物反应器1的下部连通供气源6，生物反应器1和供气源6之间设置流量计11。

作为上述方案的再一种改进，所述的错流膜组件2的前端和生物反应器1之间的管路上以及错流膜组件2的滤过端和结晶分离罐3之间的管路上分别设置阀门。

作为上述方案的再一种改进，所述的连通错流膜组件2后端和生物反应器1的管路上、连通结晶分离罐3的顶部和反应器1的管路上以及三通阀内部均设置压力阀10。

作为上述方案的还一种改进，所述装置还包括一中央控制系统4，该中央控制系统4用于控制错流膜组件2、结晶分离罐3、阀门、压力阀10和流量计11的控制。

本发明还提供了一种连续结晶生物制造丁二酸的方法，该方法通过将错流膜组件2的前端连通至生物反应器1，错流膜组件2的滤过端连通至结晶分离罐3底部，结晶分离罐3的顶部连通至反应器1形成回路，并在生物反应器1和错流膜组件2之间设置蠕动泵9，实现了丁二酸的连续发酵、结晶；

所述方法包括以下步骤：

1)丁二酸的发酵：无菌条件下，在发酵液中加入种子液，接种量的体积百分比为5～7％，搅拌，通入过滤除菌的二氧化碳气体，进行发酵，随发酵进行发酵液中酸度降低，中央控制系统控制酸度中和剂进入生物反应器1，使生物反应器1中酸度为中性，继续发酵，得到丁二酸发酵液；

2)步骤1)中发酵液中丁二酸浓度超过30g/L时，中央控制系统4启动错流膜过滤操作，实现发酵液在生物反应器1和错流膜组件2之间的循环，生物细胞和培养基固形物被截留，循环汇入生物反应器1，部分含有丁二酸盐的发酵液滤过膜组件进入结晶分离罐3；

3)结晶分离罐3中的滤过液中丁二酸浓度超过30g/L时，中央控制系统4启动结晶分离操作，调节结晶分离罐3中pH小于2.0，降低结晶罐温度至4℃，得到并收集丁二酸晶体沉淀，结晶分离罐3中清液循环进入生物反应器1中循环发酵。

作为上述方案的一种改进，所述的步骤1)中搅拌速度为125～150rpm；所述的步骤1)酸度中和剂为碳酸镁、氢氧化钠或氨水；所述的步骤1)通入二氧化碳气体的气体流速≥0.25vvm；所述的步骤1)发酵温度为30～50℃。

本发明的连续原位低温结晶生物制造丁二酸装置包含一个生物反应器1(发酵罐)，一个错流微滤膜组件2，两个并联低温结晶分离罐3，一个中央控制系统4，两个低位储液罐5，一个供气源6，一个中位储液罐7，两个高位储液罐8，五个蠕动9泵，六个压力阀10，两个流量计11，一个阀门以及全套设备相应管路。

一个错流微滤膜组件2前端通过一个二通阀门连接生物反应器1(发酵罐)；滤过端通过一个二通阀门连接两个低温结晶罐，滤过液进入低温结晶罐进行丁二酸沉淀；后端通过一个二通阀门连接生物反应器1(发酵罐)，流穿液循环进入生物反应器1(发酵罐)与发酵培养基混合。

两个并联的低温结晶分离罐3的底部均开有循环液进口，低温结晶分离罐3的顶部均开有循环液出口；循环液回路的循环液总管路，在该总管路上带有4个三通阀门、2个二通阀门；

所述的在低温结晶分离罐上部处的循环液总管路上的两个三通阀门的三个端口，分别通过管路与所述低温结晶分离罐顶部的循环液出口、与生物反应器1连通的一总管路、及连通该两个三通阀门之间的管路相连通，且第一个并联的低温结晶分离罐3的循环液出口处管路上的三通阀门的一端口，与连通三通阀门的一端口的管路相连通，该三通阀门的一端口通过管路与生物反应器1(发酵罐)相连通；

所述的中央控制系统通过在线测量丁二酸浓度，当丁二酸浓度超过30g/L时，启动错流膜过滤操作，实现发酵液在生物反应器1(发酵罐)和膜组件之间的循环。同时测量进入结晶罐中滤过液丁二酸浓度，调节pH和温度，当丁二酸浓度超过30g/L时，启动结晶罐。

利用低温结晶原位提取丁二酸的连续发酵装置原位提取丁二酸的工艺所述如下：

无菌操作条件下，在发酵液中加入种子液，接种量的体积百分比为5～7％。此时丁二酸量为0，开启搅拌，生物反应器搅拌桨的转速为125rpm～150rpm，通入过滤除菌的二氧化碳气体，气体流速≥0.25vvm，在37～39℃条件下发酵。

发酵过程中丁二酸浓度逐渐累积，使得发酵液中酸度降低，中央控制系统控制酸度中和剂如碳酸镁、氢氧化钠、氨水等及时进入生物反应器1(发酵罐)发酵罐中酸度为中性，微生物发酵产生的丁二酸与酸度中和剂反应生成丁二酸盐。

当丁二酸浓度超过30g/L时，启动错流膜过滤操作，实现发酵液在生物反应器1(发酵罐)和膜组件之间的循环。

当进入结晶罐中的滤过液中丁二酸浓度超过30g/L时，启动结晶分离操作，即调节结晶罐中pH环境小于2.0，逐渐降低结晶罐温度为4℃，出现丁二酸晶体沉淀，收集丁二酸晶体沉淀，结晶罐中清液循环进入生物反应器1(发酵罐)中并入发酵液循环发酵。

本发明的连续结晶生物制造丁二酸的方法在发酵过程中以NaOH为发酵过程的酸度中和剂，控制pH值近中性、温度37℃左右的发酵条件下进行，发酵液的pH值远高于丁二酸和副产物有机酸的的pKa(乙酸(K_a＝6.2×10^-5)，甲酸(K_a＝2.1×10^-4)，乳酸(K_a＝1.37×10^-4)，丁二酸(K_a1＝2.1×10^-4，K_a2＝2.3×10^-6))，所以，发酵液中这些酸几乎都以酸根离子的形态存在于溶液中，因此消除了酸度过高对发酵体系的抑制，同时通过发酵、分离、结晶工艺的耦合，及时的将发酵后得到的丁二酸发酵液移除进行下一步工艺，因此成功的解决了发酵产物对发酵体系的抑制，并且实现了连续的生产。同时由于以酸根离子的形态存在的丁二酸、丁二酸一氢钠、丁二酸二钠的溶解度巨大差异，在4℃，pH 1.9，丁二酸的溶解度为29g/L左右，而其它副产物有机酸、丁二酸根离子(丁二酸盐)和蛋白却溶解在水溶液中，因此，可以采用降温降pH的操作，当体系的酸度降至1.9、温度降至0～4℃之间时，过饱和的丁二酸晶体就会析出，直接结晶并回收丁二酸晶体，而其它有机酸则保留在水环境中，实现多种有机酸的分离；因此通过本发明的装置和方法不仅解除了微生物所处发酵体系的产物抑制，强化了发酵过程，而且实现了多种有机酸的分离，极大降低了副产物的丁二酸生产中的影响。

本发明的一种连续结晶生物制造丁二酸的装置和方法，克服产物对丁二酸发酵的抑制，实现了连续发酵生产丁二酸的工艺，实现了丁二酸发酵和低温结晶分离丁二酸的工艺的耦合。本发明的装置是将低温结晶罐与丁二酸生物反应器耦合，原位提取丁二酸结晶沉淀，利用错流微滤膜分离组件实现了发酵液的固液分离，进入低温结晶罐滤过液含有丁二酸盐，不含微生物细胞和培养基固形物并调节低温结晶罐的温度和pH环境，实现丁二酸盐向丁二酸分子转换，以及丁二酸原位分离，建立一个低温结晶原位提取丁二酸发酵分离的耦合系统，满足消毒灭菌和无污染连续运转。

附图说明

图1为本发明的连续结晶生物制造丁二酸的装置示意图；

图2为25℃时不同pH下丁二酸的溶解度分布示意图；

图3为不同温度下丁二酸的溶解度分布示意图；

图4为不同温度下丁二酸一钠的溶解度分布示意图；

图5为不同温度下丁二酸二钠的溶解度分布示意图。

附图标识

1、生物反应器    2、错流微滤膜组件    3、结晶分离罐  4、中央控制系统

5、低位储液罐    6、供气源            7、中位储液罐  8、高位储液罐

9、蠕动泵        10、压力阀           11、流量计

具体实施方式

下面结合图1和实施例对本发明进一步说明。虽然下例实施例只列举了连续低温原位结晶生物制造丁二酸的过程工艺，但是因本发明可以广泛应用于发酵过程中因产物浓度增加而产生抑制作用的酸性初级代谢物和次级代谢物的生产，以及利用结晶技术原位提取的工艺，所以本发明的权利要求并不限于下例实施例。

如图1所示，本发明的连续原位低温结晶生物制造丁二酸设备包含一个生物反应器1(发酵罐)，一个错流微滤膜组件2，两个并联低温结晶分离罐3，一个中央控制系统4，两个低位储液罐5，一个供气源6，一个中位储液罐7，两个高位储液罐8，五个蠕动泵9，六个压力阀10，两个流量计11，一个阀门以及全套设备相应管路。

本发明中错流膜组件2的前端通过管路连通生物反应器1，错流膜组件2的滤过端连通结晶分离罐3底部，结晶分离罐3的顶部连通反应器1，使该装置形成回路，实现了丁二酸的连续发酵、结晶；生物反应器1和错流膜组件2之间设置蠕动泵9；错流膜组件2后端和生物反应器1连通，实现了流穿发酵液在两者之间的循环。

一个错流微滤膜组件2前端通过一个二通阀门连接生物反应器1(发酵罐)；滤过端通过一个二通阀门连接两个低温结晶罐3，滤过液进入低温结晶罐3进行丁二酸沉淀；后端通过一个二通阀门连接发酵罐，流穿液循环进入发酵罐与发酵培养基混合。

两个并联的低温结晶分离罐3的底部均开有循环液进口，低温结晶分离罐的顶部均开有循环液出口；循环液回路的循环液总管路，在该总管路上带有4个三通阀门、2个二通阀门；

所述的在低温结晶分离罐3上部处的循环液总管路上的两个三通阀门的三个端口，分别通过管路与所述低温结晶分离罐顶部的循环液出口、与生物反应器连通的一总管路、及连通该两个三通阀门之间的管路相连通，且第一个并联的低温结晶分离罐3的循环液出口处管路上的三通阀门的一端口，与连通三通阀门的一端口的管路相连通，该三通阀门的一端口通过管路与产物储液罐和错流微滤膜组件3相连通；

所述的中央控制系统4通过在线测量丁二酸浓度，当丁二酸浓度超过30g/L时，启动错流膜过滤操作，实现发酵液在发酵罐和膜组件之间的循环。同时测量进入结晶罐中滤过液丁二酸浓度，调节pH和温度，当丁二酸浓度超过30g/L时，启动结晶罐。

实施例1、

如图1所示生物反应器为自动控温、调节pH、补料的发酵罐，发酵所选微生物采用丁二酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)，又名130Z^T，保存于美国菌种保藏中心(ATCC)，编号ATCC55618。培养基的配制：保存培养基和活化培养基为营养丰富的TSB培养基；种子培养基配方(单位：g/L)葡萄糖10，酵母粉6，NaCl 1，MgCl₂2，CaCl₂1.5，Na₂HPO₄2.9，NaH₂PO₄ 2.2；种子培养基配方(单位：g/L)葡萄糖30，酵母粉15，尿素2，KCl 4，MgCl₂2，MnCl₂0.07，CaCl₂1.5，Na₂HPO₄4.4，NaH₂PO₄3.3，调节pH值为6.4～6.9，121℃灭菌30分钟。

无菌操作条件下，在发酵液中加入种子液，接种量的体积百分比为5～7％。此时丁二酸量为0，开启搅拌，生物反应器搅拌桨的转速为125rpm～150rpm，通入过滤除菌的二氧化碳气体，气体流速≥0.2vvm，在37～39℃条件下发酵。

表1产丁二酸放线杆菌分批发酵结果

实施例2、

通过调节结晶罐体系的酸度，可以控制丁二酸和丁二酸盐，副产物有机酸(甲酸、乳酸、乙酸)以及其盐的分布百分数。不同pH环境下羧酸的解离度按照各自的解离常数进行计算，如乙酸(K_a＝6.2×10^-5)，甲酸(K_a＝2.1×10^-4)，乳酸(K_a＝1.37×10^-4)丁二酸(K_a1＝2.1×10^-4，K_a2＝2.3×10^-6)。一元酸的自由酸/酸根离子分布图按照下面公式计算：

${\mathrm{\δ}}_{\mathrm{HA}}=\frac{\left[\mathrm{HA}\right]}{\left[\mathrm{HA}\right]+\left[A^{-}\right]}=\frac{1}{1+\frac{\left[A^{-}\right]}{\left[\mathrm{HA}\right]}}=\frac{1}{1+\frac{K_a}{\left[H^{+}\right]}}=\frac{\left[H^{+}\right]}{\left[H^{+}\right]+K_a}$

${\mathrm{\δ}}_{A^{-}}=\frac{\left[A^{-}\right]}{\left[\mathrm{HA}\right]+\left[A^{-}\right]}=\frac{K_a}{\left[H^{+}\right]+K_a}$

二元酸的自由酸/酸根离子分布图按照下面公式计算：

${\mathrm{\δ}}_{H_{2}A}=\frac{1}{1+\frac{K_{a_1}}{\left[H^{+}\right]}+\frac{K_{a_1}{K}_{a_2}}{{\left[H^{+}\right]}^2}}=\frac{{\left[H^{+}\right]}^2}{{\left[H^{+}\right]}^2+K_{a_1}\left[H^{+}\right]+K_{a_1}{K}_{a_2}}$

${\mathrm{\δ}}_{{\mathrm{HA}}^{-}}=\frac{K_{a_1}\left[H^{+}\right]}{{\left[H^{+}\right]}^2+K_{a_1}\left[H^{+}\right]+K_{a_1}{K}_{a_2}}$

${\mathrm{\δ}}_{{\mathrm{HA}}^{-}}=1-{\mathrm{\δ}}_{{\mathrm{HA}}^{-}}-{\mathrm{\δ}}_{H_{2}A}$

其中δ是酸根离子和酸相对分布量，Ka是溶解常数，[H+]是氢离子浓度，只与pH有关。

丁二酸、乳酸、甲酸和乙酸都是弱酸，其在不同pH范围解离情况是不一样的。它们的分布量δ反映了羧酸的自由酸分子和解离的酸根离子的相对含量。对甲酸、乳酸和乙酸而言，当环境pH为6.0时，90％以离子形态存在水环境中；当pH大于7时，这些一元酸完全解离成离子态，丁二酸是二元酸，当pH大于8时，才完全解离成二价酸根离子；当pH小于2时，所有这些羧酸均是以自由酸分子存在，没有酸根离子解离。

实施例3、

丁二酸和丁二酸盐的的溶解度测定在常压下进行，温度控制在0～100℃，丁二酸和丁二酸盐的溶解度计算按照特定条件下饱和丁二酸/丁二酸盐溶液中的浓度。HCl和NaOH用以调节母液pH。如图2所示为25℃(室温)不同pH下丁二酸(succinicacid)溶解度分布，室温下不同pH范围内丁二酸的溶解度，随着pH的降低，丁二酸的溶解度也急剧下降。甲酸、乙酸和乳酸，无论是酸分子还是酸根离子，在冰点以上所有pH范围内与水互溶；图3显示不同温度下丁二酸的溶解度分布，图4显示不同温度下丁二酸一氢钠的溶解度分布，图5显示了不同温度下丁二酸二钠的溶解度分布。丁二酸酸根离子(钠盐)与酸分子相比，溶解度非常大，尽管丁二酸、丁二酸一氢钠和丁二酸二钠的溶解度都随着温度降低而降低，但是丁二酸降低幅度更大。当温度降至4℃时，丁二酸的溶解度仅为30g/L，丁二酸一氢钠的溶解度为190g/L，丁二酸二钠的溶解度为180g/L。

实施例4、

如图1所示，其中膜分离组件进行膜分离单元操作工艺如下：发酵液经过微滤操作，微滤操作采用的是中空纤维微滤膜，微滤膜的孔径为0.1μm，膜材质选用有机尼龙膜，采用错流操作的方式，操作温度与发酵温度相同，均为37℃，经微滤之后，菌体的除去率为94％，蛋白质的除去率在35％(表1)。微滤液进入结晶罐进行低温原位结晶操作，流穿液并入发酵罐与发酵液混合连续发酵。

表1图1设备中膜分离单元分离参数

实施例5、

如图1所示，本发明的连续原位低温结晶生物制造丁二酸设备包含一个生物反应器1(发酵罐)，一个错流微滤膜组件2，两个并联低温结晶分离罐3，一个中央控制系统4，两个低位储液罐5，一个供气源6，一个中位储液罐7，两个高位储液罐8，五个蠕动泵9，六个压力阀10，两个流量计11，一个阀门以及全套设备相应管路。

一个错流微滤膜组件2前端通过一个二通阀门连接生物反应器1(发酵罐)；滤过端通过一个二通阀门连接两个低温结晶罐3，滤过液进入低温结晶罐3进行丁二酸沉淀；后端通过一个二通阀门连接发酵罐，流穿液循环进入发酵罐与发酵培养基混合。

两个并联的低温结晶分离罐3的底部均开有循环液进口，低温结晶分离罐的顶部均开有循环液出口；循环液回路的循环液总管路，在该总管路上带有4个三通阀门、2个二通阀门；

所述的在低温结晶分离罐3上部处的循环液总管路上的两个三通阀门的三个端口，分别通过管路与所述低温结晶分离罐顶部的循环液出口、与生物反应器连通的一总管路、及连通该两个三通阀门之间的管路相连通，且第一个并联的低温结晶分离罐3的循环液出口处管路上的三通阀门的一端口，与连通三通阀门的一端口的管路相连通，该三通阀门的一端口通过管路与产物储液罐和错流微滤膜组件3相连通；

所述的中央控制系统4通过在线测量丁二酸浓度，当丁二酸浓度超过30g/L时，启动错流膜过滤操作，实现发酵液在发酵罐和膜组件之间的循环。同时测量进入结晶罐中滤过液丁二酸浓度，调节pH和温度，当丁二酸浓度超过30g/L时，启动结晶罐。

利用低温结晶原位提取丁二酸的连续发酵装置原位提取丁二酸的工艺所述如下：

采用实施例1的发酵体系，无菌操作条件下，在发酵液中加入种子液，接种量的体积百分比为5～7％。此时丁二酸量为0，开启搅拌，生物反应器搅拌桨的转速为125rpm～150rpm，通入过滤除菌的二氧化碳气体，气体流速≥0.25vvm。在37～39℃条件下发酵。

发酵过程中丁二酸浓度逐渐累积，使得发酵液中酸度降低，中央控制系统控制酸度中和剂如碳酸镁、氢氧化钠、氨水等及时进入发酵罐发酵罐中酸度为中性。微生物发酵产生的丁二酸与酸度中和剂反应生成丁二酸盐。

当丁二酸浓度超过30g/L时，启动错流膜过滤操作，实现发酵液在发酵罐和膜组件之间的循环。

当进入结晶罐中的滤过液中丁二酸浓度超过30g/L时，启动结晶分离操作，即调节结晶罐中pH环境小于2.0，逐渐降低结晶罐温度为4℃，出现丁二酸晶体沉淀，收集丁二酸晶体沉淀，丁二酸纯度大于95％，结晶罐中清液循环进入发酵罐中并入发酵液循环发酵。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种连续结晶生物制造丁二酸的装置，所述的装置包括：生物反应器(1)、错流膜组件(2)和结晶分离罐(3)；其特征在于，

所述的错流膜组件(2)的前端通过管路连通生物反应器(1)，错流膜组件(2)的滤过端连通结晶分离罐(3)底部，结晶分离罐(3)的顶部连通反应器(1)，使该装置形成回路，实现了丁二酸的连续发酵、结晶；

所述的生物反应器(1)和错流膜组件(2)之间设置蠕动泵(9)；

所述的错流膜组件(2)后端和生物反应器(1)连通，实现了流穿发酵液在两者之间的循环。

2.根据权利要求1所述的连续结晶生物制造丁二酸的装置，其特征在于，所述的结晶分离罐(3)为若干个，该结晶分离罐(3)顶部通过一三通阀门分别连通生物反应器(1)、相邻结晶分离罐(3)；所述的若干结晶分离罐(3)并联后的管路上设置一蠕动泵(9)，通过该蠕动泵(9)连通一低位储液罐(5)，用于母液的储存。

3.根据权利要求1所述的连续结晶生物制造丁二酸的装置，其特征在于，所述的结晶分离罐(3)的底部通过一三通阀门分别连通错流膜组件(2)和相邻结晶分离罐(3)；所述的若干结晶分离罐(3)并联后的管路连通一低位储液罐(5)，用于母液的储存。

4.根据权利要求1所述的连续结晶生物制造丁二酸的装置，其特征在于，所述的生物反应器(1)的中部连通若干中位储液罐(7)，两者之间设置蠕动泵(9)；生物反应器(1)的上部连通若干高位储液罐(8)，两者之间设置蠕动泵(9)。

5.根据权利要求1所述的连续结晶生物制造丁二酸的装置，其特征在于，所述的错流膜组件(2)的前端和生物反应器(1)之间的管路上以及错流膜组件(2)的滤过端和结晶分离罐(3)之间的管路上分别设置阀门。

6.根据权利要求1所述的连续结晶生物制造丁二酸的装置，其特征在于，所述的生物反应器(1)的下部连通供气源(6)，生物反应器(1)和供气源(6)之间设置流量计(11)。

7.根据权利要求1或6所述的连续结晶生物制造丁二酸的装置，其特征在于，所述的连通错流膜组件(2)后端和生物反应器(1)的管路上、连通结晶分离罐(3)的顶部和反应器(1)的管路上以及三通阀内部均设置压力阀(10)。

8.根据权利要求7所述的连续结晶生物制造丁二酸的装置，其特征在于，所述装置还包括一中央控制系统(4)，该中央控制系统(4)用于控制错流膜组件(2)、结晶分离罐(3)、阀门、压力阀(10)或流量计(11)的控制。

9.一种连续结晶生物制造丁二酸的方法，该方法通过将错流膜组件(2)的前端连通至生物反应器(1)，错流膜组件(2)的滤过端连通至结晶分离罐(3)底部，结晶分离罐(3)的顶部连通至反应器(1)形成回路，并在生物反应器(1)和错流膜组件(2)之间设置蠕动泵(9)，实现了丁二酸的连续发酵、结晶；

所述方法包括以下步骤：

1)丁二酸的发酵：无菌条件下，在发酵液中加入种子液，接种量的体积百分比为5～7％，搅拌，通入过滤除菌的二氧化碳气体，进行发酵，随发酵进行发酵液中酸度降低，中央控制系统控制酸度中和剂进入生物反应器1，使生物反应器1中酸度为中性，继续发酵，得到丁二酸发酵液；

2)步骤1)中发酵液中丁二酸浓度超过30g/L时，中央控制系统(4)启动错流膜过滤操作，实现发酵液在生物反应器(1)和错流膜组件(2)之间的循环，生物细胞和培养基固形物被截留，循环汇入生物反应器(1)，部分含有丁二酸盐的发酵液滤过膜组件进入结晶分离罐(3)；

3)结晶分离罐(3)中的滤过液中丁二酸浓度超过30g/L时，中央控制系统(4)启动结晶分离操作，调节结晶分离罐(3)中pH小于2.0，降低结晶罐温度至4℃，得到并收集丁二酸晶体沉淀，结晶分离罐(3)中清液循环进入生物反应器1中循环发酵。

10.根据权利要求9所述的连续结晶生物制造丁二酸的方法，其特征在于，所述的步骤1)中搅拌速度为125～150rpm；所述的步骤1)酸度中和剂为碳酸镁、氢氧化钠或氨水；所述的步骤1)通入二氧化碳气体的气体流速≥0.25vvm；所述的步骤1)发酵温度为30～50℃。

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