CN102630228A - 用于核酸分子检测的方法、试剂和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

提供用于产生经过标记的核酸分子以及在其检测分析中使用的方法、试剂和试剂盒，其中标记分子被直接连接于所述核酸分子的3'末端。

Description

用于核酸分子检测的方法、试剂和试剂盒
序列表
计算机可读形式的序列表全部以引用的方式并入本文。
发明背景
近来，已鉴定出一类称为微小RNA(miRNA)的小型非编码RNA，其在植物和动物的基因表达的转录后调控中起作用(Carrington和Ambrose,Science 301:336(2003))。最初在线虫(C.elegans)中被鉴定的miRNA通过与其靶mRNA的3'未翻译区域(UTR)或编码序列中的互补位点进行碱基配对并且抑制它们的翻译而发挥作用(Wang等,Nucleic.Acids Res.32:1688(2004))。
尽管成熟miRNA长度仅为约22个核苷酸(nt)，但是其通过Dicer复合体的作用而来源于约70聚体的前体(前体miRNA)序列的发夹区域(Lee等,EMBO J.21:4663(2002))。所述成熟miRNA随后被并入miRNP，其为介导miRNA对基因调控的效果的核糖核蛋白复合体(Mourelatos等,Genes Dev.16:720(2002))。
生物信息学研究预测在蠕虫和果蝇基因组中编码了约100种miRNA，并且脊椎动物基因组中编码了约250种miRNA(Lai等,Genome Biol.4:R42(2003)；Lim等,Genes Dev.17:991(2003)；Lim等,Science 299:1540(2003))。这占到各基因组的经过预测的蛋白质编码基因数量的约0.5-1%，显示了miRNA作为一类调控性基因产物的重要性(Brennecke和Cohen,Genome Biol.4:228(2003))。
miRNA牵涉到多种生物过程，包括植物中的花与叶的发育，蠕虫中的幼虫发育，果蝇中的凋亡和脂肪代谢，以及哺乳动物中的造血分化和神经元发育(Bartel,Cell 116:281(2004))。此外，多种miRNA基因位于与癌症关联的人染色体区域(如，脆性位点、断点、杂合性缺失区域、扩增区域)(Calin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:2999(2004))。多种miRNA还被显示在体内与脆性X智力低下蛋白(FMRP)相互作用(Jin等,Nat.Neurosci.7:113(2004))，这暗示了这些小RNA在人类健康和疾病中的作用。
由于不同的细胞类型和疾病状态与特定miRNA的表达有关联，因此获得miRNA的时间和空间表达特征是很重要的。Northern杂交已被用于测定miRNA的表达水平(参见，例如Sempere等,GenomeBiol.5:R13(2004)；Aravin等,Dev.Cell 5:337(2003)；Grad等,Mol.Cell 11:1253(2003)；Lim等,Genes & Dev.17:991(2003))，但是这种方法对于高通量分析而言工作过于繁重。基于PCR的方法已被用于监测miRNA的表达，但是这些方法需要使用高成本基因特异性引物(参见，例如Schmittgen等,Nucleic Acids Res.32:e43(2004))或需要进行低效率的平端连接以将引物结合连接物结合于所述miRNA分子(参见，例如Miska等,Genome Biol.5:R68(2004)；Grad等,Mol.Cell11:1253(2003)；Lim等,Genes & Dev.17:991(2003))。此外，PCR可向所扩增的靶miRNA分子群体中引入显著的偏倚性。
高通量的微阵列最近已被开发用于在多种组织和细胞类型中鉴定miRNA的表达模式(参见，例如Babak等,RNA 10:1813(2004)；Calin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:11755(2004)；Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9740(2004)；Miska等,Genome Biol.5:R68(2004)；Sioud和
Figure BDA00001667930400021
BioTechniques 37:574(2004)；Krichevsky等,RNA 9:1274(2003))。微阵列的使用对于miRNA表达的检测具有多种优点，包括在单一时间点在同一样品内检测多种基因表达的能力、仅对少量RNA的需求以及对前体和成熟miRNA分子的表达进行同时鉴定的潜力。
但是，由于成熟miRNA仅长约22nt并且在任意给定组织内仅以非常有限的量存在，因此这些小RNA对于微阵列标记和检测造成难题(Sioud和
Figure BDA00001667930400031
BioTechniques 37:574(2004))。例如，荧光团的共价连接可被用于直接标记miRNA分子以用于微阵列分析(参见，例如Babak等,RNA 10:1813(2004)；MICROMAXTM ASAP miRNAChemical Labeling Kit,Perkin Elmer,Waltham,MA；Label 
Figure BDA00001667930400032
μArrayLabeling Kit,Mirus Bio Corp.,Madison,WI)，但是这种方法缺乏对稀少靶miRNA分子进行检测的灵敏度。直接标记还可引起随机并入的荧光团的分子间沉默，这导致进一步降低的灵敏度。miRNA分子的随机引物反转录已被用于制备在微阵列分析中使用的经过标记的cDNA分子(参见，例如Sioud和BioTechniques 37:574(2004)；Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9740(2004))，但是这种方法并不产生原始全长miRNA群体的精确再现。
已开发出显著改善miRNA分析精确度和灵敏度的新的标记方法(参见，例如共同待决的美国专利申请第10/979,052号，以美国专利公开第2006/0094025号公开)。但是，这些方法使用间接标记连接并且需要多重杂交步骤以在所述分析中显现信号。此外，这些方法受限于大捕获试剂分子，其需要独立的杂交步骤以改善所述结合动力学。虽然提供了良好结果，但这些方法不易适用于高通量分析并且需要颇为更多的时间以获得理想结果。因此，迫切需要对用于微阵列和高通量分析的miRNA分子进行标记和检测的快捷、灵敏和有效的方法。
发明概述
申请人已经发明了用于对靶miRNA分子进行标记的方法，其中核酸标记分子被直接连接于所述miRNA分子的3'末端。申请人已经发现，在无需PCR的情况下可通过优化的核酸标记分子的使用而降低沉默并且增强信号强度，从而产生用于miRNA分析尤其是高通量分析的改善的方法和试剂。所述优化的核酸标记分子优选地是经过多重标记的聚合物骨架，其上连接有能够发射或产生可检测信号的多个标记分子。所述经过多重标记的聚合物骨架可以是其上可连接标记分子的任意聚合物，如，蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、脂类、脂肪酸、核酸等。在优选的实施方案中，所述经过多重标记的聚合物骨架包含小DNA树状高分子，其包含20-1000个碱基的核酸，更为优选的情况下包含300-750个碱基的核酸，并且包含一个可连接末端和10-15个能够发射或产生可检测信号的标记分子。所述可连接末端具有5'磷酸，其可被连接于miRNA分子的3'末端。所述核酸标记分子的体积小到足以实现在多种检测平台之上对miRNA分子进行快速、有效的杂交，所述检测平台诸如微阵列和基于珠粒的分析。
因此，本发明的一个方面涉及经过多重标记的聚合物骨架，其上连接有能够发射或产生可检测信号的多个标记分子，其中所述经过多重标记的聚合物骨架包含寡核苷酸尾，所述尾包含能够与核酸序列杂交结合的5'磷酸基团。在优选的实施方案中，所述经过多重标记的聚合物骨架具有约50至约350kDa的总分子量。在一些实施方案中，所述标记分子包含一个或多个荧光团部分。在其它实施方案中，所述标记分子包含一个或多个生物素部分。
在优选的实施方案中，能够与所述延伸序列结合的核酸序列是桥联寡核苷酸，其还能够杂交于与所述聚合物骨架分离并且不同的核酸分子。合在一起，所述聚合物骨架和桥联寡核苷酸构成了用于标记核酸分子的系统。优选地，与所述聚合物骨架分离并且不同的核酸分子是RNA分子，更为优选的情况下是非编码或miRNA分子。5'磷酸基团的存在使所述聚合物骨架得以被连接于所述RNA分子的3'末端。DNA分子也可以这种方式进行标记。
在优选的实施方案中，所述经过多重标记的聚合物骨架是具有多个单链区域的线型树状多核苷酸组合物，所述单链区域可与一个或多个经过标记的寡核苷酸进行杂交；所述线型树状多核苷酸组合物包含第一、第二和第三多核苷酸单体，其通过以5’-3’定向的杂交而结合在一起；各多核苷酸单体在彼此杂交结合前均具有第一、第二和第三单链杂交区域；并且在所述线型树状多核苷酸组合物中所述第一多核苷酸单体的第三单链杂交区域与所述第二多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合，并且所述第二多核苷酸单体的第三单链杂交区域与所述第三多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合，其中所述第一多核苷酸单体的第一单链杂交区域能够与核酸序列杂交结合，并且其中所述线型树状多核苷酸组合物中的第二单链杂交区域与一个或多个经过标记的寡核苷酸进行杂交结合，所述经过标记的寡核苷酸包含一个或多个标记分子。
本发明的另一方面涉及用于产生经过标记的靶miRNA分子的方法，其包括：
a)提供具有5'和3'末端的单链miRNA分子；
b)将寡核苷酸尾连接于所述单链miRNA分子的3'末端；
c)提供具有正义链和反义链的部分双链核酸序列，其中所述正义链包含核酸标记分子，所述核酸标记分子在其3'末端包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子，并且所述反义链包含单链3'突出端，所述突出端包含与所述寡核苷酸尾互补的序列；
d)通过与所述3'突出端序列进行的互补碱基配对而使所述部分双链核酸序列与所述寡核苷酸尾退火；以及
e)将所述部分双链核酸序列的正义链的5'末端与所述寡核苷酸尾的3'末端进行连接，由此将包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子的核酸标记分子连接于所述miRNA分子的3'末端，从而产生了经过标记的靶miRNA分子。
在一些实施方案中，所述miRNA分子被提供于总RNA来源之中，而在其它的实施方案中，所述miRNA分子被提供于富含低分子量RNA分子的RNA来源之中。所述寡核苷酸尾在优选的情况下是使用多聚A聚合酶连接的多聚dA尾。连接优选地使用T4DNA连接酶实施。在优选的实施方案中，所述部分双链核酸序列包含所描述的经过多重标记的聚合物骨架和桥联寡核苷酸，更为优选的情况下包含上文所描述的线型树状多核苷酸组合物。
本发明的另一个方面涉及用于对固体支持物上的miRNA反义探针进行检测的方法，其包括：
a)将其上具有包含miRNA分子的互补核苷酸序列的反义探针的固体支持物与经过标记的靶miRNA分子接触，所述经过标记的靶miRNA分子通过包括以下步骤的方法制备：
i)提供具有5'和3'末端的单链miRNA分子；
ii)将寡核苷酸尾连接于所述单链miRNA分子的3'末端；
iii)提供具有正义链和反义链的部分双链核酸序列，其中所述正义链包含核酸标记分子，所述核酸标记分子在其3'末端包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记物，并且所述反义链包含单链3'突出端，所述突出端包含与所述寡核苷酸尾互补的序列；
iv)通过与所述3'突出端序列进行的互补碱基配对而使所述部分双链核酸序列与所述寡核苷酸尾退火；以及
v)将所述部分双链的核酸序列的正义链的5'末端与所述寡核苷酸尾的3'末端进行连接，由此将包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记物的核酸标记分子连接于所述miRNA分子的3'末端，从而产生了经过标记的靶miRNA分子；以及
b)将所述固体支持物和经过标记的靶miRNA分子在足以使所述经过标记的靶miRNA分子与所述miRNA反义探针杂交的时间和温度下进行孵育；
c)洗涤所述固体支持物以去除未杂交的经过标记的靶mRNA；以及
d)检测来自所述杂交的经过标记的靶miRNA分子的信号，从而检测了固体支持物上的miRNA反义探针。
在一些实施方案中，所述固体支持物是平面固体支持物，诸如微阵列或微滴度板，而在其它的实施方案中，所述固体支持物是珠粒。所述miRNA探针可对成熟或前体miRNA序列均具特异性或仅对前体miRNA序列具特异性。
本发明的另一个方面涉及制备用于在miRNA分析中使用的经过标记的靶miRNA分子的试剂盒，所述试剂盒包含：具有正义链和反义链的部分双链核酸序列，其中所述正义链包含核酸标记分子，所述核酸标记分子包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记物，并且所述反义链包含单链3'突出端，所述突出端包含与寡核苷酸尾互补的序列；以及说明资料，其用于通过使用所述部分双链核酸序列产生经过标记的靶miRNA分子。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含至少一种酶，其用于将寡核苷酸尾连接于靶miRNA分子的3'末端，其中所述寡核苷酸尾与所述部分双链核酸序列的单链3'突出端序列互补；以及至少一种酶，其用于将所述部分双链核酸序列的正义链的5'末端连接于所述靶miRNA分子的3'末端。在其它的实施方案中，提供能够发射或产生不同可检测信号的多个核酸标记分子以使双重或多重颜色分析得以进行。在优选的实施方案中，所述部分双链核酸序列包含上文所描述的经过多重标记的聚合物骨架和桥联寡核苷酸。在更为优选的实施方案中，所述经过多重标记的聚合物骨架包含上文所描述的线型树状多核苷酸组合物。
本发明的一个方面涉及核酸标记分子，其上连接有一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记物，其中所述核酸标记分子包含寡核苷酸延伸序列，其包含能够与核酸序列杂交的5’磷酸基团。在一些实施方案中，所述核酸标记分子包含DNA并且具有约5至约250kDa的总分子量。在优选的实施方案中，所述核酸标记分子包含单链DNA寡核苷酸，其具有约2至约2.3kDa的总分子量。在一些实施方案中，所述标记分子包含一个或多个荧光团部分。在其它实施方案中，所述标记分子包含一个或多个生物素部分。所述标记分子优选地包含1至约15个标记分子。所述核酸标记分子可被用于上文所述的方法和试剂盒。
附图简述
图1a-d合并描述了根据本发明的方法进行的靶miRNA分子的标记以及miRNA分子探针的检测。
图2描述了本发明的优选的核酸标记分子。
图3是显示核酸标记分子的长度与miRNA杂交分析中的平均信号强度之间的相关性的图表。
图4显示了用于miRNA杂交分析的一步标记过程和两步标记过程之间的并列比较。
发明详述
本发明涉及用于RNA微阵列分析的核酸分子、方法和试剂盒。术语“RNA分子”、“miRNA分子”、“mRNA分子”、“DNA分子”、“cDNA分子”和“核酸分子”均意在涵盖单一分子、单一种类的多个分子以及不同种类的多个分子。术语“miRNA分子”还意在涵盖成熟和前体miRNA分子。与微阵列术语相一致，“靶miRNA”指的是待标记的miRNA或互补cDNA序列，而“miRNA探针”指的是直接连接于固体支持物的未标记的正义或反义miRNA序列。术语“核酸标记分子”指的是能够连接于miRNA分子的3'末端的任意非天然的核苷酸序列，如DNA树状高分子，并且其包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子。
本发明的方法包含将核酸标记分子连接于至少一种miRNA分子的3'末端，所述核酸标记分子包含能够发射或产生可检测信号的标记物。所产生的经过标记的miRNA分子随后被用于检测连接于固体支持物的miRNA探针，从而获得miRNA的表达特征。通过使用经过适当标记的靶分子以及适当设计的探针，可获得所述成熟和前体miRNA表达特征。
本发明的方法区别于现有技术，所述现有技术通过荧光团的共价连接直接标记靶miRNA分子或对靶miRNA分子进行随机引物结合和反转录以产生经过标记的cDNA分子，两者均缺乏在与miRNA探针杂交后足以检测稀少靶miRNA分子的灵敏度。本发明的方法还区别于基于PCR的标记技术，其可向经过标记的靶分子群体中引入扩增偏倚性。
本发明的方法使用了分子生物学领域中的常规工艺。公开了常用分子生物学方法的基础教材包括Sambrook等,Molecular Cloning，A LaboratoryManual(2001年第3版)和Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(1994)。
本发明的方法使用了RNA分子来源。优选地，所述来源富含miRNA分子。尽管通篇使用了“miRNA”和“富含”，但应当了解本文所公开的方法可被用于标记具有3'末端的任意核酸分子，无论其富含与否，其包括具有经过修饰的3'末端的RNA分子，诸如在植物和细菌中可见的经过修饰的3'末端的RNA分子。可对任意RNA分子进行标记。本发明的方法还可被拓展用以结合酶类而标记具有可用3'末端的DNA分子，所述酶类在脱氧核糖核苷酸存在下在所述3’末端合成聚合体尾。能够在脱氧核糖核苷酸存在下合成聚合体尾的酶的一个实例是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。
存在用于从总RNA中富集miRNA分子的大量方法和商业试剂盒。实例包括miRvanaTM miRNA分离试剂盒(Ambion,Austin,TX)、PureLinkTMmiRNA分离试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)、mirPremierTM微小RNA分离试剂盒(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)，在变性PAGE凝胶中进行纯化(参见，例如Miska等,GenomeBiol.5:R68(2004))，使用适当大小分子量截留的滤器进行的离心(例如，
Figure BDA00001667930400101
YM过滤器装置,Millipore,Billerica,MA)，以及醋酸钠/乙醇沉淀(参见，例如Wang等,Nucleic Acids Res.32:1688(2004))。
所述miRNA可获自包含miRNA的任意组织或细胞来源，其包括在任意生物或环境样品中可见的病毒颗粒、植物和动物来源。优选地，所述来源是动物组织，更为优选的情况下是哺乳动物组织，最为优选的情况下是人组织。所述RNA也可使用RNA提取试剂盒从临床FFPE样品中纯化，所述试剂盒从而如RecoverAllTM总核酸分离试剂盒(Ambion,Austin Tx)。
所述RNA可经受扩增过程。RNA扩增试剂盒的实例包括但不限于，SenseAMP RNA扩增试剂盒(Genisphere,Hatfield,PA)、MessageAmpTM RNA扩增试剂盒(Ambion,Austin,TX)、OvationTM RNA扩增系统(NuGenTechnologies,San Carlos,CA)，等等。
参照图1，单链寡核苷酸尾被连接于单链miRNA分子的3'末端(参见图1a)。可通过将核苷酸连接于单链RNA的任意方法并入所述寡核苷酸尾。优选地，使用多聚(A)聚合酶(PAP)或其它适当的酶在适当的核苷酸存在的情况下在适当的缓冲液中将所述寡核苷酸尾连接于所述单链cDNA。优选地，所述寡核苷酸尾是同聚体核苷酸尾(即，多聚A、多聚G、多聚C或多聚T)。优选地，所述寡核苷酸尾是多聚A尾，其长度一般介于约3与超过500个核苷酸之间，在优选的情况下其长度介于约20与约100个核苷酸之间。当使用PAP时，优选的缓冲液是Tris-HCl，pH 8.0(或其它适当的缓冲液)，其同时包含镁离子和锰离子。例如，所述缓冲液可包含1至100mM Tris-HCl，pH 8.0，1至20mM MgCl2和1至20mM MnCl2，以及0.01至20mM ATP。所述加尾反应(tailing reaction)一般在37℃下进行5至60分钟。
为制备经过标记的靶miRNA分子，通过连接反应将包含正义链的部分双链脱氧核酸序列连接于所述3'寡核苷酸尾，所述正义链包含核酸标记分子，所述核酸标记分子在其3'末端包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记物(参见图1b)。这通过所述3'寡核苷酸尾与所述部分双链的脱氧核酸序列的反义链3'末端的突出端序列之间的互补碱基配对而促进，所述突出端序列包含与所述寡核苷酸尾互补的脱氧核苷酸序列。例如，如果所述寡核苷酸尾是多聚A尾，所述部分双链的脱氧核酸序列的3'突出端应在其3'末端包含脱氧胸苷序列，其长度一般介于约3与超过50个核苷酸之间，在优选的情况下长度介于约10与约30个核苷酸之间。对于被认为是彼此互补的序列，所述3'突出端序列的特定核苷酸序列并非必须与所述3'寡核苷酸尾的特定核苷酸序列完全(即，100%)互补，所述3'突出端序列的长度亦非必须完全等于所述3'寡核苷酸尾的长度。本领域的技术人员应认识到，全部所需的是在所述两种序列之间存在充足的互补性以使所述3'突出端可与所述3'寡核苷酸尾退火，由此而将所述捕获序列适当地定位于所述miRNA分子的3'末端。
一旦被适当地定位，所述核酸标记分子通过连接反应被连接于所述3'寡核苷酸尾。这些突出端或“交错(staggered)”连接反应比平端连接反应更为有效并且可以在更高的温度下进行。此外，寡聚脱氧核苷酸尾的使用实现了脱氧核酸标记分子DNA与所述DNA尾的连接，这比DNA与miRNA的直接连接更为有效。在所述连接反应中可使用任意DNA连接酶。优选地，所述DNA连接酶是T4DNA连接酶。当使用T4DNA连接酶时，优选的缓冲液是1/10稀释的10×连接缓冲液(660mM Tris-HCl，pH 7.5，50mM MgCl，10mM DTT，10mM ATP)，其由Roche Applied Science,Indianapolis,IN提供。所述反应优选地通过加入EDTA而终止。
如上所述，所述miRNA分子的加尾和所述尾与所述标记分子的连接反应在独立的反应中实施，或者在单一反应混合物中实施。这样的“一步”过程析之间的重现性。所述单一反应混合物一般在18-37℃下孵育30-45分钟。
在所述连接反应中使用的核酸标记分子优选地是经过多重标记的聚合物骨架，其上连接有能够发射或产生可检测信号的多个标记分子。所述骨架还包含寡核苷酸延伸序列，所述延伸序列包含5'磷酸基团以用于与所述3'加尾的miRNA分子的连接(参见图1b)。所述经过多重标记的聚合物骨架可以是其上可连接标记分子的任意聚合物，如蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、脂类、脂肪酸、核酸等。所述经过多重标记的聚合物骨架的总分子量在优选的情况下为约50至约350kDa。所述聚合物骨架在优选的情况下包含约2-100个标记分子，其被间隔分离以使沉默被降低或消除和/或实现对大检测分子(如，链霉亲和素)的接近。本领域的技术人员可根据已有文献测定所述标记分子的适当间隔。例如，美国专利第6,762,292号、第6,072,043号和第6,046,038号描述了用于对荧光标记分子与核酸骨架的连接的最佳间隔进行测定的方法。一般情况下，在核酸骨架中所述标记分子至少分离10nt的间隔是足够的。可据此而测定其它类型的骨架中的间隔。
图2描述了本发明的优选的经过多重标记的聚合物骨架。所述经过多重标记的聚合物骨架包含具有5'磷酸基团的寡核苷酸延伸序列，其能够与核酸序列杂交结合。在本实施方案中，所述核酸序列是图2中所示的桥联寡核苷酸，其5'部分与所述聚合物骨架的寡核苷酸尾互补，并且其3'部分与所述miRNA分子的3'寡核苷酸尾互补。合在一起，所述聚合物骨架和桥联寡核苷酸构成了用于标记所述miRNA分子的系统。所述寡核苷酸尾的5'磷酸基团使所述聚合物骨架得以连接于所述miRNA分子。在所述连接反应期间，所述桥联寡核苷酸一般对于所述聚合物骨架的寡核苷酸尾是摩尔过量的，在优选的情况下约1.8-2.6倍摩尔过量。所述杂交桥联寡核苷酸/聚合物骨架寡核苷酸尾合并形成了上文所描述的部分双链脱氧核酸序列，由此而构成了用于标记所述miRNA分子的系统。此外，应当了解在图2中所示的序列仅为示例性的，并且能够杂交的任意序列均可使用。
在优选的实施方案中，所述经过多重标记的聚合物骨架是小线型树状多核苷酸组合物，其包含20-1000个核酸碱基，更为优选的情况下包含300-750个核酸碱基，并且包含一个可连接末端和10-15个能够发射或产生可检测信号的标记分子。根据上文所讨论，所述可连接末端具有5’磷酸，其可被连接于所述加尾的miRNA分子。在一些实施方案中，所述线型树状多核苷酸组合物是小3DNATM Dendrimer Capture Reagent(Genisphere Inc.,Hatfield,Pa.)。树状高分子是高度分支化的核酸分子，在其表面包含两种类型的单链杂交“臂”以用于标记分子和捕获序列的连接。由于单一的树状高分子均可具有各类型的多个臂，因此通过杂交所获得的信号被大大增强。使用树状高分子试剂进行的信号增强被描述于Nilsen等,J.Theor.Biol.187:273(1997)；Stears等,Physiol.Genomics 3:93(2000)；美国专利第5,175,270号、第5,484,904号、第5,487,973号、第6,072,043号、第6,110,687号和第6,117,631号；以及美国专利公开第2002/0051981号。使用最佳设计的树状高分子使得所述标记分子被放置以降低或消除沉默。此外，在所述标记分子中的信号可被扩增或增强而不对所述靶核酸分子自身进行引入偏倚性的扩增。
所述线型树状多核苷酸组合物可包含第一、第二和第三多核苷酸单体，其通过以5’-3’定向的杂交而结合在一起，各多核苷酸单体在彼此杂交结合前均具有第一、第二和第三单链杂交区域。所述第一多核苷酸单体的第三单链杂交区域与所述第二多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合，并且所述第二多核苷酸单体的第三单链杂交区域与所述第三多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合。所述线型树状多核苷酸组合物的第一多核苷酸单体的第一单链杂交区域被设计用于与核酸序列杂交结合。当用于本文所述的标记方法中时，所述核酸序列是图2中所示的桥联寡核苷酸序列，其用于将所述经过多重标记的聚合物骨架连接于所述3'加寡核苷酸尾的miRNA分子。
用于组装所述线型树状多核苷酸组合物的各个多核苷酸单体中的所述第二单链杂交区域均被设计用于与一个或多个经过标记的寡核苷酸杂交结合。所述经过标记寡核苷酸包含一个或多个标记分子。优选地，所述第三多核苷酸单体的第三单链杂交区域还与或多个经过标记的寡核苷酸杂交结合。所述经过标记的线型树状多核苷酸组合物优选地在组装之后使用例如补骨脂化学反应这样的方法被交联。
在其它的实施方案中，所述核酸标记分子(亦称为核酸标记试剂)是多核苷酸，其上连接有一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子，其中所述核酸标记分子包含寡核苷酸延伸序列，其包含能够与核酸序列杂交的5’磷酸基团。在优选的实施方案中，所述核酸标记分子包含DNA并且具有约5至约250kDa的总分子量。所述标记分子优选地包含1至约15个标记分子。在一个特别优选的实施方案中，所述核酸标记分子包含单链DNA寡核苷酸，其不计所述标记分子情况下具有高至约为5kDa的总分子量并且在其3'末端包含单一标记分子。在其它的实施方案中，所述单链DNA寡核苷酸的分子量是约2至约2.3kDa，不计任何标记分子。
所述核酸标记分子上的标记分子可以是能够发射或产生可检测信号的任意分子。这些分子包括，直接发射或产生可检测信号的分子，诸如放射活性分子、荧光分子和化学反光分子，以及用于比色分析的酶类，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。这些分子还包括并不直接产生可检测信号但结合于产生可检测信号的系统的分子，诸如生物素/链霉亲和素、抗原/抗体和其它半抗原组合。优选地，所述信号产生分子是直接发射或产生可检测信号的分子，更为优选的情况下是荧光团，最为优选的情况下是Cy3或Cy5染料(GE Healthcare,Piscataway,NJ)、或
Figure BDA00001667930400142
染料(Denovo Biolabels,Münster,Germany)或其它适当的染料，诸如Alexa FluorTM 555或647染料(Molecular Probes,Eugene,OR)。使用标记分子制备经过标记的寡核苷酸在本领域中是为人所熟知的。
所述经过标记的miRNA分子随后与包含miRNA探针的固体支持物(参见图1c)接触。根据本文所述，“固体支持物”意在包括任意包含核酸探针的固体支持物，其包括载片、芯片、膜、珠粒和微滴度板。用于将miRNA探针连接于固体支持物的方法为本领域的技术人员所熟知(参见，例如Babak等,RNA 10:1813(2004)；Calin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:11755(2004)；Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9740(2004)；Miska等,GenomeBiol.5:R68(2004)；Sioud和
Figure BDA00001667930400151
BioTechniques 37:574(2004)；Krichevsky等,RNA 9:1274(2003))。或者，平面和珠粒形式的miRNA微阵列均可购自，例如Invitrogen，Carlsbad，CA(NCodeTM miRNA Microarray)、Exiqon，Woburn，MA(miRCURYTM miRNA Array)、CombiMatrix，Mukilteo，WA(miRNA CustomArrayTM)和Luminex，Austin，TX (FlexmiRTMmiRNA Panel)。所述经过标记的miRNA分子也可被用于酶联寡聚吸附分析(enzyme-linked oligosorbent assays)(ELOSA)。
针对经过标记的靶miRNA分子的情况，所述固体支持物应包含反义miRNA探针。所述探针可被设计用于同时检测成熟和前体miRNA序列，或者所述探针可对于前体miRNA序列具有特异性。进行比较可给出所述前体和成熟序列的特征。可使用已知的miRNA和前体miRNA序列而设计miRNA探针，所述miRNA和前体miRNA序列可公开获得于，例如miRBase Sequence Database(http://microma.sanger.ac.uk/sequences,TheWellcome Trust Sanger Institute,Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,UK(Griffiths-Jones等,Nucleic Acids.Res.34:D140(2006)。新miRNA序列也可被用于设计miRNA探针并且其可使用计算方法进行鉴定(参见，例如Ambros等,Curr.Biol.13:807(2003)；Grad等,Mol.Cell11;1253(2003)；Lai等,Genome Biol.4:R42(2003)；Lim等,Genes & Dev.17:991(2003)；Lim等,Science 299:1540(2003))或使用miRNA克隆策略进行鉴定(参见，例如Wang等,Nucleic Acids Res.32:1688(2004)；Lagos-Quintana等,Science 294:853(2001)；Lau等,Science294:858(2001)；Lee等,Science 294:862(2001))，其为本领域的技术人员所熟知。
所述固体支持物和所述经过标记的miRNA分子被孵育于杂交缓冲液中，所孵育的时间和温度足以使所述经过标记的miRNA分子与所述miRNA探针杂交。适当的基于阵列的杂交缓冲液包括2×基于SDS的缓冲液(2×SSC，4×Denhardt氏溶液，1%SDS，0.5M磷酸钠，2mM EDTA，pH8.0)以及2×增强杂交缓冲液(Enhanced Hybridization Buffer)(ExpressHybTM,BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)，其使用无核酸酶的水稀释至75%。适当的基于珠粒的分析缓冲液包含4-4.5M TMAC、5-15%去离子甲酰胺、0.1-2%BSA、0.25-1mg/ml鲑鱼精DNA。
优选地，所述固体支持物和所述经捕获序列标记的核酸分子被孵育约0.5-72小时，优选地为18-24小时，孵育在约25-65℃下进行，优选地为在45-65℃下进行。可通过在预暖于25-60℃下，优选地预暖于50-55℃下的2×SSC，0.2%SDS洗涤缓冲液中洗涤15分钟，室温下在2×SSC中洗涤10-15分钟，并且在室温下在0.2×SSC中洗涤10-15分钟而去除过量的未杂交的经过标记的miRNA分子。所述固体支持物随后受到分析，一般通过扫描进行(参见图1d)。基于微阵列的分析可使用适当的仪器进行分析，诸如配以
Figure BDA00001667930400161
Pro 3.0软件的
Figure BDA00001667930400162
4000B微阵列扫描仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)或ScanArrayTM 5000(PerkinElmer,Waltham,MA)。基于珠粒的分析可使用Luminex Corporation(Austin,TX)提供的仪器和软件和本领域的技术人员所熟悉的类似设备进行分析。
本发明的方法和试剂可方便地以试剂盒的形式进行包装。这些试剂盒可被用于多种研究和诊断应用。例如，本发明的方法和试剂盒可被用于促进在不同细胞或组织、相同细胞或组织的不同亚群体、相同细胞或组织的不同生理状态、相同细胞或组织的不同发育阶段或相同组织的不同细胞群体中进行的对一种或多种miRNA表达的比较性分析。这些分析可揭示miRNA表达水平上的统计学显著性差异，根据受分析的细胞或组织，所述差异可随后被用于促进多种疾病状态的诊断、疾病发展的预后以及对疾病治疗目标的甄别。
根据本发明可制备广泛多种的试剂盒。例如，用于制备经过标记的靶miRNA分子的试剂盒可包括部分双链核酸序列，其具有正义链和反义链，其中所述正义链包含核酸标记分子，所述核酸标记分子包含一个或多个发射或产生可检测信号的标记物，并且所述反义链包含单链3'突出端，所述突出端包含与所述寡核苷酸尾互补的序列；以及说明资料，其用于通过使用所述部分双链的核酸序列产生经过标记的靶miRNA分子。在优选的实施方案中，所述部分双链的核酸序列包含上文所描述的经过多重标记的聚合物骨架和桥联寡核苷酸。在其它优选的实施方案中，所述经过多重标记的聚合物骨架是上文描述的线型树状多核苷酸组合物。
虽然所述说明资料一般包含书面或打印资料，但它们并不限于这些。本发明涵盖了能够存储这些说明并使其传达给终端用户的任何媒介。这些媒介包括但不限于，电子存储介质(如，磁盘、磁带、磁片盒、芯片)、光储介质(如，CD ROM)等等。这些媒介可包含提供这些说明资料的互联网站的网址。
所述试剂盒还可包含以下一种或多种用于制备本发明的经过标记的miRNA分子的组分或试剂：RNA酶抑制剂；用于将寡核苷酸尾连接于单链RNA分子的酶(如，多聚(A)聚合酶)；用于将寡核苷酸尾连接于单链DNA分子的酶(如，TdT)；反转录酶；以及用于将所述部分双链的核酸序列连接于所述寡核苷酸尾的酶(如，T4DNA连接酶)。所述试剂盒还可包含在miRNA分析中应用所述经过标记的miRNA所需的组分和试剂以及说明资料，其包括杂交和洗涤溶液、孵育容器、盖玻片，以及多种信号检测用、信号产生用、信号增强用和细胞保存用试剂。此外，所述试剂盒可包括缓冲液、核苷酸、盐类、无RNA酶水、容器、玻瓶、反应管等等，这些与本发明的经过标记的miRNA分子的制备和应用相匹配。所述成分和试剂可以提供于具有适当的储存介质的编号容器中。
根据本发明的方法的特定实施方案在此被描述于以下实施例中。所述实施例仅为说明性的，并且并非意在以任何方式对本发明的其它部分进行限制。
实施例
实施例1
总RNA中的miRNA分子的标记以及与反义miRNA探针的杂交
线型树状多核苷酸核酸标记分子的制备
根据上文所述制备了三聚线型树状多核苷酸核酸标记分子。所述标记分子具有165kDa的分子量，包含间隔为10-15nt的15个荧光团部分并且在组装之后使用三甲沙林在UV-A存在下进行交联。所述标记分子包含图2中所示的5'磷酸化寡核苷酸延伸序列(5'-TTC AGT AAT ATG CC-3′；SEQ IDNO:l)。使用
Figure BDA00001667930400181
YM-30微浓缩管，根据厂商(Millipore,Billerica,MA)说明来纯化所述经过UV照射的制剂。
包含所述线型树状多核苷酸核酸标记分子的连接混合物的制备
42μl的所述纯化标记分子(2,380ng/μl)结合12.3μl图2所示的桥联寡核苷酸(904ng/μl)(5'-GGC ATA TTA CTG AAT TTT TTT TTT T-3′；SEQ IDNO:2)和35μl 10×连接缓冲液(660mM Tris-HCl，pH 7.5，50mM MgCl，10mM DTT，10mM ATP；Roche Applied Science,Indianapolis,IN)，最终体积为210μl。所述桥联寡核苷酸被设计用以同时与图2所示的5'-磷酸化寡核苷酸延伸序列和下文所述的3'多聚A加尾的miRNA分子杂交结合，这使得所述标记分子和所述加尾miRNA分子连接在一起。在0.30L水浴中加热所述混合物至60℃持续10分钟，所述水浴在1升的烧杯之中加以制备。随后将盛有所述连接混合物的烧杯冷却至室温。加入140μl的10×连接缓冲液并且所述试管通过振荡进行混合。随后将所述混合物储存于-20℃下直至使用。
miRNA分子的加尾
1.5μg大鼠脑总RNA和1.5μg大鼠肝脏总RNA(Ambion,Austin,TX)被分别使用无核酸酶水溶至10μl。通过加入1.5μl 10×反应缓冲液(50mMTris-HCl，pH 8.0，10mM MgCl2)、1.5μl 25mM MnCl2、1μl 0.02mM ATP和1μl多聚A聚合酶(5U/μl)并且在37℃下加热15分钟而对所述总RNA进行了多聚A加尾。
miRNA的连接
通过加入4μl的所述连接混合物和2μl T4DNA连接酶(2U/μl)并且在室温下孵育30分钟而对所述多聚A加尾的RNA分子进行了连接。通过加入2.5μl终止溶液(0.25M EDTA)而终止反应。所述大鼠脑RNA被连接于包含
Figure BDA00001667930400191
标记分子的树状高分子，所述大鼠肺RNA被连接于包含
Figure BDA00001667930400192
标记分子的树状高分子。
经过标记的miRNA的微阵列杂交
在制备微阵列杂交混合物之前融化并重悬2×增强杂交缓冲液(使用无核酸酶水将ExpressHybTM缓冲液(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)稀释至75%)。所述经过标记的RNA分子结合5μl 10%BSA和2×增强杂交缓冲液直至终浓度为1×。所述杂交混合物被施用于NCodeTM微阵列(Invitrogen,Carlsbad,CA)，以玻璃盖片覆盖并且在52℃下孵育过夜。对于单色分析，仅仅一种经过标记miRNA群体被包含于所述选定杂交混合物中，其余的体积由无核酸酶水构成。
通过在预暖于52℃下的2×SSC，0.2%SDS洗涤缓冲液中洗涤所述微阵列而除去所述盖片。所述微阵列依次在预暖于52℃下的2×SSC，0.2%SDS洗涤缓冲液中洗涤15分钟，在室温下的2×SSC中洗涤10-15分钟，并且在室温下0.2×SSC中洗涤10-15分钟。所述微阵列被转移至干燥的50mL离心管内，调整载片以使任何粘性条码或标记处于所述离心管下部。包含所述微阵列的离心管立即在无盖情况下以800-1000RPM进行离心以干燥所述微阵列。从所述离心管中去除所述微阵列，小心勿接触所述微阵列表面。使用配以
Figure BDA00001667930400201
Pro 3.0软件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)的4000B微阵列扫描仪对所述阵列进行所描，由此而产生了所述原始样品内所述miRNA序列的表达特征。对脑和肝脏特征进行比较以确立多种miRNA的差异特征。miR122被观察到主要存在于肝脏中并且miR124a和miR9主要存在于脑中。miR16和miRlet7a-f以及其它miRNA在脑和肝脏均有表达但是显示了组织特异性特征。
实施例2
富集RNA中的miRNA分子的标记以及与反义miRNA探针的杂交
除所述大鼠脑总RNA和大鼠肝脏总RNA在微阵列杂交之前进行了对低分子量RNA的富集处理之外，遵循了实施例1中的程序。1.5μg大鼠脑总RNA和大鼠肝脏总RNA以10mM Tris，pH 8.0分别稀释至100μl，加热至80℃持续3分钟，并在冰上冷却。对于各RNA样品，YM-100微浓缩管(Millipore,Billerica,MA)通过加入50μl 10mM Tris，pH 8.0并且在13,000RPM下离心3分钟进行了预湿处理。将浓缩柱置入新的收集管内并各加入100μl样品并在13,000RPM下离心7分钟。包含低分子量RNA分子的各穿流物(约95μl)使用YM-3微浓缩管(Millipore,Billerica,MA)通过13,000RPM下离心30分钟而进行了浓缩。随后向各样品储池中加入5μl的10mM Tris，pH 8.0并且通过弹击所述浓缩柱的侧壁进行轻柔混合。各样品储池被随后倒置放入新的收集管内并且在13,000RPM下离心3分钟以收集所述浓缩富集RNA(回收约5-10μl)。随后使用无核酸酶水将各富集RNA样品调至10μl。
根据上文对所述富集RNA分子进行多聚A加尾、连接并且与NCodeTM微阵列杂交。在杂交之后，根据上文洗涤并扫描所述阵列，由此而产生了所述原始样品中的miRNA序列表达特征。当将来自实施例1的数据(总RNAlog2(肝脏/脑))和实施例2的数据(富集RNA log2(肝脏/脑))进行比较时，观察到了0.933的皮尔逊相关系数。
实施例3
ELOSA
平板涂覆
Figure BDA00001667930400211
(Coming,Lowell,MA)微滴度板通过向各孔中加入1×PBS中的100μl 1μg/mL人miR122反义DNA寡核苷酸(5'-CAA ACA CCA TTG TCACAC TCC A-3'；SEQ ID NO:3)而进行涂覆。所述平板使用微平板压封膜(PerkinElmer,Waltham,MA)进行覆盖并且在室温下被孵育过夜。随后使用1×PBS,0.05%Tween-20洗涤所述平板2次并且吸干。
平板封闭和miRNA标记
向各孔中加入处于1×PBS中的200μl 4%BSA。平板被覆盖并且在室温下被孵育1-2小时。在所述平板封闭期间，对总RNA和富集RNA中的miRNA分子进行标记。根据上文实施例2中所述，使用
Figure BDA00001667930400212
YM-100微浓缩管(Millipore,Billerica,MA)并继之以使用
Figure BDA00001667930400213
YM-3微浓缩管(Millipore,Billerica,MA)进行浓缩而从1μg、0.75μg、0.5μg和0.25μg大鼠肝脏总RNA中(Ambion,Austin,TX)富集低分子量RNA。所述富集RNA样品，以及1μg、0.75μg、0.5μg和0.25μg大鼠肝脏总RNA根据上文实施例1所述进行多聚A加尾。通过加入4μl的连接混合物和2μl T4DNA连接酶(2U/μl)并且在室温下孵育30分钟而对所述加尾的RNA分子进行了连接。除所述线型树状多核苷酸核酸标记分子包含生物素部分而非荧光团部分之外，所述连接混合物类似于实施例1中的连接混合物。通过加入2.5μl终止溶液(0.25M EDTA)终止反应以产生23.5μl的生物素化RNA。封闭完成之后，使用1×PBS,0.05%Tween-20洗涤所述平板2次并且吸干。
样品杂交
向各23.5μl的生物素化RNA样品中加入19μl TMAC溶液(4.5M TMAC,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，75mM Tris，pH 8，0.15%十二烷基肌氨酸钠(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，6mM EDTA(Ambion,Austin,TX)，26μl去离子甲酰胺(EMD,Gibbstown,NJ)，5μl 10%BSA和1.5μl无核酸酶水，终体积为75μl。各样品被轻柔混合、离心并且施用于经过涂覆的封闭孔内。所述样品在室温下于所述平板内进行3-4小时杂交。杂交之后，所述平板首先使用预暖于52℃下的2×SSC，0.2%SDS洗涤缓冲液洗涤2次，随后使用2×SSC在室温下洗涤2次，并且随后使用0.2×SSC在室温下洗涤2次。
链霉亲和素-HRP杂交
根据制造商的建议，使用1×PBS中的4%BSA(Equitech-Bio,Kerrville,TX)稀释链霉亲和素-HRP(SA-HRP,R&D Systems,Minneapolis,MN)。向各孔内加入50μl稀释的SA-HRP并且所述平板在室温下通过轻柔振荡被孵育1小时。随后使用1×PBS，0.05%Tween-20洗涤所述平板2-4次并且吸干。
信号显色
向各孔内加入100μl TMB底物(Pierce,Rockford,IL)并在室温下孵育所述平板1至15分钟。向各孔内加入100μl BioSourceTM终止缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)。在Victor3 Multilabel Plate Reader(PerkinElmer,Waltham,MA)上在450nm下读取吸收值。对于富集RNA和总RNA均观察到输入RNA和观察到信号之间的线性相关，相关系数分别为0.985和0.973。miR122的检测限度测定为低于0.25μg富集miRNA或总RNA的总量RNA。
实施例4
miRNA分子的Luminex珠粒检测
来自大鼠脑和肝脏的总RNA样品(Ambion,Austin,TX)经过多聚A加尾并且根据上文实施例3所描述与生物素化树状多核苷酸核酸标记分子连接。包含不同量的两种荧光染料以通过所述两种荧光染料的比率而实现珠粒类型之间的辨别的多种Luminex牌羧化微珠粒制备物(Luminex,Austin,TX)通过Luminex程序被共价连接于多种胺化22聚体反义miRNA探针(IDTtechnologies)，其对应于选定的成熟大鼠miRNA序列(miRBase SequenceDatabase；http://microma.sanger.ac.uk/sequences)。为进行设计用于同时检测多种miRNA特异性的多个检测分析，17μl的经过连接的RNA样品被加入包含于33μl缓冲液中的多种Luminex珠粒类型的多个组合之内，所述缓冲液包含10%甲酰胺、4.5M TMAC、0.1%BSA以及25ng/μl鲑鱼精DNA。在47℃下将所述珠粒-RNA混合物在500μl聚丙烯管内伴以300RPM下的水平搅拌而孵育过夜。所述珠粒被转移至滤器微平板内并且使用预暖至56℃的2×SSC，20%甲酰胺通过真空抽滤进行洗涤，随后使用2×SSC、0.2×SSC和1×PBS在室温下进行洗涤。1×PBS中(2ng/μl)的100μl链霉亲和素藻红蛋白偶联物(Invitrogen,Carlsbad,CA)被加至各个珠粒混合物中并且在37℃下伴以300RPM的搅拌被孵育30分钟。所述珠粒以1×PBS洗涤三次，重悬浮于125μl 1×PBS之中并且在Luminex 100IS系统上根据制造商的建议进行分析。特异性miRNA探针的平均荧光强度(MFI)值2×于背景值显示了在所述经过连接的RNA制备物内对miRNA分子的特异性检出。所述脑和肝脏miRNA特征与实施例1和2中的miRNA阵列所观察到的结果进行比较。对于在所述Luminex平台上测试的所有miRNA，均在平台间观察到了类似的肝脏/脑特征。
实施例5
用于直接标记靶miRNA分子以与反义miRNA探针进行杂交的试剂盒
用于经过标记的靶miRNA分子的制备和微阵列杂交的试剂盒以下列组分进行组装：
Figure BDA00001667930400231
和650连接混合物(250ng/μl线型树状多核苷酸组合物和31.7ng/μl桥联寡核苷酸)(Genisphere,Hatfield,PA)；
10×反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM MgCl2)
MnCl2(25mM)；
ATP混合物(10mM)；
多聚A聚合酶(5U/μl)；
2×基于SDS的杂交缓冲液(2×SSC，4×Denhardt氏溶液，1%SDS，0.5M磷酸钠，2mM EDTA，pH 8.0)；
2×增强杂交缓冲液(以无核酸酶水预稀释至75%的ExpressHybTM缓冲液(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA))；
T4DNA连接酶(2U/μl)；
以及无核酸酶水。
这些组分被置于编号的瓶中并且置于具有打印说明手册的容器内，所述手册用于通过所述试剂盒的组分进行经过标记的靶miRNA分子的制备和微阵列杂交。
实施例6
总RNA中的miRNA分子的标记以及与反义miRNA探针的杂交
线型树状多核苷酸核酸标记分子的制备
根据上文所述通过将一种或多种生物素化寡核苷酸在包含缓冲剂(10mM Tris-HCl，pH 8.0)和盐(100mM NaCl)的溶液内进行结合而制备多核苷酸核酸标记分子。所述标记多核苷酸分子具有5-250kDa的分子量(不计任何标记分子)，并且包含1至15个标记分子(生物素或荧光团染料)。荧光团部分以10-15nt的间隔被置入。标记多核苷酸在组装之后使用三甲沙林在UV-A存在下进行交联。所述标记分子包含图2中所示的5'磷酸化寡核苷酸延伸序列(5'-TTC AGT AAT ATG CC-3′；SEQ ID NO:l)。使用YM-30微浓缩管根据厂商(Millipore,Billerica,MA)说明来纯化所述UV照射制剂。
包含所述线型树状多核苷酸核酸标记分子的连接混合物的制备
纯化的标记分子结合图2中所示的桥联寡核苷酸(5'-GGC ATA TTACTG AAT TTT TTT TTT T-3'；SEQ ID NO:2)和35μl 10×连接缓冲液(660mM Tris-HCl，pH 7.5，50mM MgCl，10mM DTT，10mM ATP；RocheApplied Science,Indianapolis,IN)，最终体积为210μl。使用相对于所述标记多核苷酸摩尔过量的所述桥联寡聚物。所述桥联寡核苷酸被设计用以同时与图2所示的5'-磷酸化寡核苷酸延伸序列和下文所述的3'多聚A加尾的miRNA分子杂交结合，这使得所述标记分子和所述加尾miRNA分子连接在一起。在0.30L水浴中加热所述混合物至60℃持续10分钟，所述水浴在1升的烧杯之中加以制备。随后将盛有所述连接混合物的烧杯冷却至室温。加入140μl的10×连接缓冲液并且所述试管通过振荡进行混合。随后将所述混合物储存于-20℃下直至使用。
miRNA分子加尾和连接的两步过程：
1μg大鼠脑总RNA和1μg大鼠肝脏总RNA(Ambion,Austin,TX)被分别使用无核酸酶水溶至10μl。通过加入1.5μl 10×反应缓冲液(50mMTris-HCl，pH 8.0，10mM MgCl2)、1.5μl 25mM MnCl2、1μl 0.02mM ATP和1μl多聚A聚合酶(5U/μl)并且在37℃下加热15分钟而对所述总RNA进行了多聚A加尾。
通过加入4μl的所述连接混合物和2μl T4DNA连接酶(2U/μl)并且在室温下孵育30分钟而对所述多聚A加尾的RNA分子进行了连接。通过加入2.5μl终止溶液(0.25M EDTA)而终止反应。所述大鼠脑RNA被连接于包含标记分子的树状高分子，所述大鼠肺RNA被连接于包含
Figure BDA00001667930400262
标记分子的树状高分子。
一步过程：
1μg大鼠脑总RNA和1μg大鼠肝脏总RNA(Ambion,Austin,TX)被分别使用10μl无核酸酶水溶至10μl。所述总RNA通过加入1.5μl 25mM MnCl2、4μl所述连接混合物、2μl T4DNA连接酶(2U/μl)和1μl多聚A聚合酶(5U/μl)并且在25-37℃下孵育45分钟而进行标记。通过加入2.5μl终止溶液(0.25M EDTA)而终止反应。与所述两步过程相同，所述大鼠脑RNA被连接于包含
Figure BDA00001667930400263
标记分子的树状高分子，所述大鼠肺RNA被连接于包含
Figure BDA00001667930400264
标记分子的树状高分子。
荧光标记miRNA的微阵列杂交
在制备微阵列杂交混合物之前融化并重悬2×增强杂交缓冲液(使用无核酸酶水稀释ExpressHybTM缓冲液(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)至75%)。所述经过标记的RNA分子结合5μl 10%BSA和2×增强杂交缓冲液直至终浓度为1×。所述杂交混合物被施用于NCodeTM微阵列(Invitrogen,Carlsbad,CA)，以玻璃盖片覆盖并且在52℃下孵育过夜。对于单色分析，仅仅一种经过标记的miRNA群体被包含于所述选定杂交混合物中，其余的体积由无核酸酶水构成。
通过在预暖于52℃下的2×SSC，0.2%SDS洗涤缓冲液洗涤所述微阵列而除去所述盖片。所述微阵列依次在预暖于52℃下的2×SSC，0.2%SDS洗涤缓冲液中洗涤15分钟，室温下在2×SSC中洗涤10-15分钟，并且在室温下在0.2×SSC中洗涤10-15分钟。所述微阵列被转移至干燥的50mL离心管内，调整载片以使粘性条码或标记处于所述离心管下部。包含所述微阵列的离心管立即在无盖情况下以800-1000RPM进行离心以干燥所述微阵列。从所述离心管中去除所述微阵列，小心勿接触所述微阵列表面。使用配以
Figure BDA00001667930400271
Pro 3.0软件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)的
Figure BDA00001667930400272
4000B微阵列扫描仪对所述阵列进行所描，由此而产生了所述原始样品内所述miRNA序列的表达特征。对脑和肝脏特征进行比较以确立多种miRNA的差异特征。miR122被观察到主要存在于肝脏中并且miR124a和miR9主要存在于脑中。miR16和miRlet7a-f以及其它miRNA在脑和肝脏均有表达但是显示了组织特异性特征。
生物素标记miRNA的微阵列杂交
所述标记RNA分子结合50μl 2×GeneChip杂交缓冲液(GeneChip HybWas Stain Kit,Affymetrix,Santa Clara,CA)，5μl 100%甲酰胺(VWR)，10μlDMSO(GeneChip Hyb Was Stain Kit,Affymetrix,Santa Clara,CA)，5μl20×Eukaryotic Hyb Controls(GeneChip Hyb Control Kit,Affymetrix,SantaClara,CA)，1.7μl Control B2(Affymetrix,Santa Clara,CA)以及10μl无核酸酶水(Ambion,Austin,Tx)。所述杂交混合物被施用于
Figure BDA00001667930400273
微小RNA微阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA)，并且根据制造商的建议在47℃下孵育过夜(16小时)。使用Fluidics Script，FS450003在Affymetrix Fluidics Station上对所述阵列进行洗涤并染色。
结果：
取决于给定实验中所使用的生物素标记多核苷酸标记试剂，所述标记标签的估计大小介于长约100与700个碱基之间(这一长度包含所述寡核苷酸尾的长度和所述标记试剂的长度)。图3总结了在Affymetrix
Figure BDA00001667930400274
微小RNA阵列上观察到的结果，对不同大小的多核苷酸标记试剂进行比较。不依赖于每试剂上生物素分子的数量，较小的标记试剂表现得显著优于较大的分子。
使用荧光标记的多核苷酸进行的两步和一步标记过程之间的并列比较显示，所述一步过程具有明显更为简易的工作流程并且易于对大量的样品进行并行处理。阵列结果(图4)显示，所述两步和一步程序之间存在平均较小差异直至无差异，这暗示了无论分开实施或合并于同一反应混合物中所述两酶学步骤(多聚A加尾和连接)均以相似的效率进行。此外，使用所述一步过程具有比所述两步过程更高的重现性。
本说明书中所引用的全部公布，专利公布和非专利公布均包括在内，均表明本发明所涉及的领域中的技术人员的水平。所有这些公布均以引用的形式完全并入本文，其引用程度如同将各个公布特定且个别地表明通过引用的方式并入。
尽管本发明在此通过特定的实施方案进行描述，应当了解这些实施方案仅为本发明的原理和应用的示例。因此应当了解可对所述示例性实施方案进行大量的调整，并且应当了解可在不脱离根据下列权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下设计其它配置。

Claims (19)

1.一种核酸标记分子，其上连接有一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子，其中所述核酸标记分子包含含有能够与核酸序列杂交的5’磷酸基团的寡核苷酸延伸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸标记分子，其具有约5kDa至约250kDa的分子量。
3.根据权利要求1所述的核酸标记分子，其包含1至约15个标记分子。
4.根据权利要求1所述的核酸标记分子，其中所述标记分子由生物素或荧光团组成。
5.根据权利要求1所述的核酸标记分子，其呈具有高至约5kDa的分子量并且在其3'末端具有单一生物素分子的单链DNA寡核苷酸的形式。
6.一种用于产生经过标记的靶RNA分子的方法，其包括：
a)提供具有5'和3'末端的单链RNA分子；
b)将寡核苷酸尾连接于所述单链RNA分子的3'末端；
c)提供具有正义链和反义链的部分双链核酸序列，其中所述正义链包含核酸标记分子，所述核酸标记分子在其3'末端包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子，并且所述反义链包含单链3'突出端，所述突出端包含与所述寡核苷酸尾互补的序列；
d)通过与所述3'突出端序列进行的互补碱基配对而使所述部分双链核酸序列与所述寡核苷酸尾退火；以及
e)将所述部分双链核酸序列的正义链的5'末端与所述寡核苷酸尾的3'末端进行连接，由此将包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子的核酸标记分子连接于所述RNA分子的3'末端，从而产生经过标记的靶RNA分子。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述单链RNA分子是miRNA分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述核酸标记分子是经过多重标记的聚合物骨架，其上连接有能够发射或产生可检测信号的多个标记分子，其中所述经过多重标记的聚合物骨架包含寡核苷酸延伸序列，所述寡核苷酸延伸序列包含5'磷酸基团并且能够与所述部分双链核酸序列的反义链杂交结合，其中所述经过多重标记的聚合物骨架是具有多个单链区域的树状多核苷酸组合物，所述单链区域可与一个或多个经过标记的寡核苷酸杂交，所述树状多核苷酸组合物基本由两个或更多个通过以5’-3’定向的杂交而结合在一起的多核苷酸单体构成，并且其中所述经过多重标记的聚合物骨架具有约50至约350kDa的总分子量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述经过多重标记的聚合物骨架是具有多个单链区域的三聚线型树状多核苷酸组合物，所述单链区域可与一个或多个经过标记的寡核苷酸进行杂交；所述线型树状多核苷酸组合物基本由通过以5’-3’定向的杂交而结合在一起的第一、第二和第三多核苷酸单体构成；各多核苷酸单体在彼此杂交结合之前均具有第一、第二和第三单链杂交区域；并且在所述线型树状多核苷酸组合物中，所述第一多核苷酸单体的第三单链杂交区域与所述第二多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合，并且所述第二多核苷酸单体的第三单链杂交区域与所述第三多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合，其中所述第一多核苷酸单体的第一单链区域能够与所述部分双链核酸序列的反义链杂交结合，并且其中所述线型树状多核苷酸组合物中的第二单链杂交区域与一个或多个经过标记的寡核苷酸进行杂交结合，所述经过标记的寡核苷酸包含一个或多个标记分子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述部分双链核酸序列的反义链包含桥联寡核苷酸，所述寡核苷酸与所述经过多重标记的聚合物骨架的寡核苷酸延伸序列和所述单链RNA分子的3'末端的寡核苷酸尾均能够杂交结合。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸标记分子之上连接有一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子，其中所述核酸标记分子包含寡核苷酸延伸序列，所述寡核苷酸延伸序列包含能够与所述部分双链核酸序列的反义链杂交结合的5'磷酸基团。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸标记分子具有约5kDa至约250kDa的分子量。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸标记分子包含1至约15个标记分子。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述标记分子由生物素或荧光团组成。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸标记分子呈具有约5kDa的分子量并且在其3'末端具有单一生物素分子的单链DNA寡核苷酸的形式。
16.根据权利要求6所述的方法，其中所述步骤a)-e)在单一反应混合物中进行。
17.一种用于对固体支持物上的RNA反义探针进行检测的方法，其包括：
a)将其上具有包含RNA分子的互补核苷酸序列的反义探针的固体支持物与通过根据权利要求6所述的方法产生的经过标记的靶RNA分子接触；
b)将所述固体支持物和经过标记的靶RNA分子在足以使所述经过标记的靶RNA分子与所述RNA反义探针杂交的时间和温度下进行孵育；
c)洗涤所述固体支持物以去除未杂交的经过标记靶mRNA；以及
d)检测来自所述杂交的经过标记靶RNA分子的信号，从而检测了固体支持物上的RNA反义探针。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述经过标记的靶RNA分子是miRNA分子。
19.一种用于产生经过标记的靶DNA分子的方法，其包括：
a)提供具有5'和3'末端的单链DNA分子；
b)将寡核苷酸尾连接于所述单链DNA分子的3'末端；
c)提供具有正义链和反义链的部分双链核酸序列，其中所述正义链包含核酸标记分子，所述核酸标记分子在其3'末端包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子，并且所述反义链包含单链3'突出端，所述突出端包含与所述寡核苷酸尾互补的序列；
d)通过与所述3'突出端序列进行的互补碱基配对而使所述部分双链核酸序列与所述寡核苷酸尾退火；以及
e)将所述部分双链核酸序列的正义链的5'末端与所述寡核苷酸尾的3'末端进行连接，从而将包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子的所述核酸标记分子连接于所述DNA分子的3'末端，从而产生经过标记的靶DNA分子。
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