CN102600505B - 用于捕捉干细胞的生物材料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于捕捉干细胞的生物材料及其制备方法与应用。本发明提供的方法是将胶原材料与Sca-1抗体共价交联，得到所述用于捕捉干细胞的生物材料。本发明是根据抗体可与细胞上的特异性抗原结合的特性，提出的一种新的功能性生物材料-偶联干细胞特异性抗体的生物材料，以达到体内在特定的损伤部位特异性捕捉自体干细胞的目的。本发明的生物材料不仅可应用于心肌组织的修补，还可应用于其它组织的损伤修复，如血供丰富的脑、肝脏、肾脏、皮肤、骨组织等。因此本发明的生物材料在组织器官损伤修复中有着重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及用于捕捉干细胞的生物材料及其制备方法与应用。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新能力，且具有多向分化潜能的细胞。通常，组织内的干细胞处于静止状态，一旦组织发生损伤，这些静止的干细胞迅速活化并迁移到损伤部位，帮助损伤组织的修复。干细胞对维持组织的自我平衡及损伤后组织的再生十分重要。因此，干细胞被越来越多的应用于多种疾病的治疗中，包括大面积创伤或烧伤、心血管类疾病、神经类疾病等，并取得了一定的修复效果，尤其对于心肌、神经等再生能力有限的组织，干细胞治疗无疑为患者带来了治疗的新希望。
常用的干细胞主要有具有全系分化潜能的胚胎干细胞、多系分化潜能的成体干细胞，包括骨髓间充质干细胞及一些组织特异性干细胞。外源性干细胞的体内移植是干细胞治疗的主要手段。然而，由于免疫排斥反应，大部分移植的细胞会经历凋亡或坏死，仅有5％-8％的外源干细胞可在移植部位存活。再者，体内组织的微环境往往与体外细胞培养的微环境相距甚远，不适宜外源干细胞的增殖与分化，是外源干细胞的移植效率通常较低的另一大原因。此外，胚胎干细胞的体内治疗还存在伦理道德方面的局限性，这些问题大大阻碍了干细胞移植在临床治疗上的应用。由此可见利用外源性干细胞进行损伤组织的修复在短期内还面临很多问题，而利用自体干细胞进行修复可以避免上述问题，在短期内有可能实现临床上的应用。
皮肤等再生能力较强的组织发生小面积损伤时，皮肤组织内静止的干细胞可自行修复受损的组织，为自体干细胞修复受损组织提供了一定的理论依据。然而，对于大面积损伤或是再生能力很差的组织，机体自行可动员的干细胞数量极其有限，并不能有效的修复受损的组织。如何有效引导自体干细胞参与损伤修复及组织再生是摆在科研人员面前的一大难题。血液循环系统是体内干细胞的一大储存库，其内所含造血干细胞、骨髓间充质干细胞及内皮祖细胞等伴随着血液的流动到达全身各处，这些循环系统内的干细胞被认为是自体干细胞治疗的潜在的、理想的种子细胞。目前，自体干细胞治疗的研究多集中于此。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种干细胞动员剂，对造血干细胞、骨髓间充质干细胞均具有广泛的动员效应，被应用于心肌、神经等再生能力差的组织修复过程中。在一些心肌损伤动物模型中，G-CSF注射后可见心肌细胞的增殖及心肌功能的恢复，但是其修复效果一直存在争议。在临床心肌梗塞的治疗中，G-CSF注射后，心肌再生及功能恢复未见实质性的改善。究其缘由，虽然G-CSF可动员自体的造血及骨髓间充质干细胞，但是其动员效应并非特异。干细胞被动员后，广泛分布于各组织内，到达损伤部位的干细胞数量并未有显著的提高，且随着血液的流动这些干细胞随时可能被带走，而并不能特异参与到受损组织的修复与再生过程中。此外，微环境对细胞的增殖分化也非常重要，一系列干细胞及微环境的相互作用对内源自体干细胞的命运决定及功能性分化亦是不可或缺的。
干细胞微环境调控的重要手段之一是通过特异的生物材料来调节细胞命运。此外，生物材料被广泛应用于组织的靶向修复过程中，它们不仅为药物、细胞的靶向递送提供载体，同时又能引导组织的三维重建。比如在心肌的损伤修复中，生物材料可代替受损的心肌组织或疤痕组织以引导心肌组织的再生，改善心肌功能。在神经损伤修复中，生物材料亦可承载细胞或特异性生长因子作为靶向修复的有效载体。研究表明，应用于心肌损伤治疗的组织工程化心肌补片如细胞外基质(ECM)可在一定程度上改善心肌功能，然而仅有生物材料并不足以诱导细胞的浸润、增殖及分化，其心肌修复能力也是有限的。而在神经损伤修复中，承载了外源细胞的生物材料移植入体内后，由于细胞仍带有免疫原性，部分细胞仍会受到机体免疫分子的攻击。因此，如果能在损伤部位的生物材料上捕捉足够数量的自体干细胞必将在很大程度上推进自体干细胞修复受损心肌组织的应用，因为这既能消除外源干细胞带来的免疫排斥反应，另一方面又能克服自体干细胞治疗时损伤部位干细胞数量不足的问题。
抗体可与其抗原特异性结合，这一特性推动了它在靶向治疗中的应用，目前大约有300种抗体类药物被开发，且部分已进入临床评价阶段。在肿瘤治疗中，偶联免疫相关抗原和肿瘤相关抗原的双向抗体可直接募集免疫效应细胞至肿瘤，并杀死肿瘤细胞。在心血管疾病治疗中，偶联造血干细胞特异标志的CD45和心肌特异抗原MLC的双向抗体可携带外源造血干细胞至心脏并帮助受损心肌的再生。
胶原蛋白存在于体内许多组织内，是体内细胞外基质的主要组成成分之一。胶原材料为组织提供机械支撑，维持器官与组织的完整性。此外，胶原是细胞外基质的主要成分，可作为细胞依附、生长的支架，诱导细胞迁移、增殖及分化。Sca-1是Ly-6基因家族的一员，是小鼠造血干细胞的特异标志物。有研究表明，骨髓间充质干细胞、心肌干细胞、骨骼肌干细胞等也表达这一标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于捕捉干细胞的生物材料的制备方法。
本发明提供的用于捕捉干细胞的生物材料的制备方法，是将胶原材料与Sca-1抗体共价交联，得到所述用于捕捉干细胞的生物材料。
上述胶原材料为胶原凝胶、脱细胞骨基质胶原材料或胶原膜。
上述共价交联是通过化学交联剂作用完成的。
上述化学交联剂为Sulfo-SMCC和Traut’s Reagent。
上述共价交联的步骤包括如下：
1)将Traut’s Reagent与胶原材料一起反应2小时，获得胶原-Traut’s化合物；将Sulfo-SMCC与Sca-1抗体孵育1小时，获得抗体-Sulfo-SMCC化合物；
2)再将上述步骤1)中获得的胶原-Traut’s化合物和抗体-Sulfo-SMCC化合物混合孵育，孵育的时间为0.5-2小时，优选为1小时，得到所述用于捕捉干细胞的生物材料。
步骤1)中，上述胶原材料、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体为如下(1)-(3)中任一所述：
(1)胶原材料为胶原凝胶，胶原凝胶、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的质量比为0.2-0.4mg∶0.2-0.3mg∶0.4-0.7μg∶2-3μg；
(2)胶原材料为脱细胞骨基质胶原材料，脱细胞骨基质胶原材料、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的比例为：1簇∶0.3-0.6mg∶1.5-1.8μg∶4-6μg；所述1簇的规格是20-40mm3，优选是30mm3；
(3)胶原材料为胶原膜，胶原膜、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的比例为：1簇∶0.3-0.6mg∶3-4μg∶8-12μg，所述1簇的规格是5-15mm2，优选是9mm2。
其中，上述(1)中Traut’s Reagent的浓度为2-3mg/ml，Sca-1抗体的浓度为0.4-0.6μg/μl，Sulfo-SMCC的浓度为0.4-0.6mg/ml；
上述(2)中Traut’s Reagent的浓度为4-6mg/ml，Sca-1抗体的浓度为0.4-0.6μg/μl，Sulfo-SMCC的浓度为0.4-0.6mg/ml；
上述(3)中Traut’s Reagent的浓度为4-6mg/ml，Sca-1抗体的浓度为0.4-0.6μg/μl，Sulfo-SMCC的浓度为0.4-0.6mg/ml。
上述共价交联的步骤中各物质的用量和浓度优选为：所述(1)中胶原凝胶、Traut’sReagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的质量比为0.3mg∶0.25mg∶0.58μg∶2.5μg，所述Traut’s Reagent的浓度为2.5mg/ml，Sca-1抗体的浓度为0.5μg/μl，Sulfo-SMCC的浓度为0.5mg/ml；
所述(2)中脱细胞骨基质胶原材料、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的比例为：1簇∶0.5mg∶1.66μg∶5μg，所述Traut’s Reagent的浓度为5mg/ml，Sca-1抗体的浓度为0.5μg/μl，Sulfo-SMCC的浓度为0.5mg/ml；
所述(3)中胶原膜、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的比例为：1簇∶0.5mg∶3.32μg∶10μg，所述Traut’s Reagent的浓度为5mg/ml，Sca-1抗体的浓度为0.5μg/μl，Sulfo-SMCC的浓度为0.5mg/ml。
上述的Sulfo-SMCC是溶解于一缓冲液中的，该缓冲液的配置方法如下：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶于1L蒸馏水，然后再将4mmol的EDTA溶于上述蒸馏水中，最后调pH至7.2。
上述的Traut’s Reagent是溶解于另一缓冲液中的，该缓冲液的配置方法如下：将8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶于1L蒸馏水，然后再将4mmol的EDTA溶于上述蒸馏水中，最后调pH至8.0。
上述的Sca-1抗体是溶解于又一缓冲液中的，该缓冲液的配置方法如下：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶于1L蒸馏水，调pH至7.0。
上述制备方法得到的用于捕捉干细胞的生物材料也属于本发明的保护范围。
上述本发明方法制备得到的生物材料在制备组织修复材料中的应用也属于本发明的保护范围。具体的组织修复材料可以是心肌补片。
本发明是根据抗体可与细胞上的特异性抗原结合的特性，提出的一种新的功能性生物材料——偶联干细胞特异性抗体的生物材料，以达到体内在特定的损伤部位特异性捕捉自体干细胞的目的。本发明使用的胶原材料可以为一种免疫原性低、可降解及生物相容性良好的天然生物材料，能够引导组织再生。本发明通过化学交联的方法将Sca-1单克隆抗体锚定到胶原材料上。
实验证明：通过体外实验发现交联有Sca-1抗体的胶原材料可有效捕捉Sca-1阳性的造血干细胞，且这种通过抗原抗体相互作用的捕捉方法并不影响干细胞的分化能力；通过肌肉包埋实验发现这种交联了Sca-1抗体的胶原材料亦可在体内捕捉相当数量的Sca-1阳性细胞；对本发明进行了功能性评价，将这种交联有Sca-1抗体的胶原材料作为心肌补片应用于心肌修复实验中，手术90天后可观察到明显的心肌再生且伴随着心肌功能的恢复，取得了良好的修复的效果。
由于血液循环系统遍及全身，因此本发明的生物材料不仅可应用于心肌组织的修补，还可应用于其它组织的损伤修复，如血供丰富的脑、肝脏、肾脏、皮肤、骨组织等。所以本发明的生物材料在组织器官损伤修复中有着重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1使用的交联反应的示意图。
图2为本发明的生物材料捕捉干细胞示意图。
图3为不同处理下抗体在胶原材料上的存留量，图中A，胶原为胶原凝胶时的结果；B，胶原为DBM胶原材料时的结果；C，胶原为胶原膜时的结果；C/PBS表示单纯胶原组；C/Sca-1表示胶原和Sca-1抗体简单吸附；C×BSA表示胶原和BSA蛋白共价交联；C×Sca-1表示胶原和Sca-1抗体共价交联。
图4为交联Sca-1抗体的胶原凝胶体外捕捉Sca-1阳性细胞及鉴定，图中A：交联Sca-1抗体的胶原凝胶体外可捕捉大量细胞；图中C/PBS：单纯胶原组；C/Sca-1：胶原/Sca-1抗体简单吸附；C×BSA：胶原/BSA蛋白共价交联；C×Sca-1：胶原/Sca-1抗体共价交联；B：克隆形成实验；C：流式分选结果。
图5为肌肉包埋实验验证交联Sca-1抗体的胶原材料在体内具有捕捉干细胞的能力，图中C×BSA：胶原/BSA蛋白共价交联；C×Sca-1：胶原/Sca-1抗体共价交联。
图6为手术4周后小鼠心肌修复的病理学检测分析，图中A，胶原和BSA交联组的HE染色；B，胶原和Sca-1抗体交联组的HE染色；C，胶原和BSA交联组的细胞数目；D，胶原和Sca-1抗体交联组的细胞数目；E，胶原和BSA交联组的血管数目；F，胶原和Sca-1抗体交联组的血管数目；G，细胞数目统计；H，血管数目统计，G、H中C×BSA表示胶原/BSA蛋白共价交联；C×Sca-1表示胶原/Sca-1抗体共价交联。
图7为手术12周后小鼠心肌修复的病理学及功能学检测分析，图中A，胶原和BSA交联组的HE染色；B，胶原和Sca-1抗体交联组的HE染色；C，胶原和BSA交联组的细胞数目；D，胶原和Sca-1抗体交联组的细胞数目；E、G，胶原和BSA交联组的肌纤维染色；F、H，胶原和Sca-1抗体交联组的肌纤维染色；I，细胞数目统计；J，肌纤维阳性率的统计；K，超声心动射血分数统计；L，超声心动缩短分数统计。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、用于捕捉干细胞的生物材料的制备
1、化学交联剂准备和共价交联原理
本实施例中选用的化学交联剂是2-亚氨基噻吩(Traut’s Reagent，购自Sigma公司)和璜基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环乙烷(Sulfo-SMCC，购自Sigma公司)。
共价交联作用的原理：通过共价交联的方法用交联剂2-亚氨基噻吩(Traut’sReagent)和璜基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环乙烷(Sulfo-SMCC)将细胞特异的抗体固定在胶原材料上，从而在体外和体内捕捉干细胞。其中Traut’s Reagent是一种环形的交联剂，可与胶原分子中N末端的氨基(-NH2)发生反应，将巯基(-SH2)基团添加到胶原分子上；而Sulfo-SMCC是一种双功能交联剂，分子两端分别含有羟基琥珀酰亚胺基(N-hydroxysuccinimide ester group，NHS)和马来酰亚胺基(maleimidegroup)，Sulfo-SMCC中的NHS可与氨基(-NH2)反应，而Sulfo-SMCC中的马来酰亚胺基可与巯基(-SH)反应。本实施例中，Sulfo-SMCC通过一端的NHS基团与Sca-1抗体的氨基反应与抗体相连，而另一端的马来酰亚胺基团则可与含有巯基(-SH)基团的胶原分子反应，将Sca-1抗体与胶原分子共价交联在一起(如图1所示)。其生物材料捕捉干细胞的状态如图2所示，A为未进行共价交联干细胞特异性抗体的胶原材料捕捉干细胞的情况，B为本发明共价交联了干细胞特异性抗体的生物材料捕捉干细胞的情况。
本实施例中：①Traut’s Reagent：采用pH 8.0，含4mM EDTA的PBS缓冲液(配置方法如下：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶于1L蒸馏水，然后再将4mmol的EDTA溶于上述蒸馏水中，最后调pH至8.0)溶解，取2.5mg和5mg的Traut’sReagent分别溶于1ml pH 8.0，EDTA 4mM PBS缓冲液中，得到2.5mg/ml和5mg/ml的Traut’s试剂。
②Sulfo-SMCC：采用pH 7.2，含4mM EDTA的PBS缓冲液(配置方法如下：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶于1L蒸馏水，然后再将4mmol的EDTA溶于上述蒸馏水中，最后调pH至7.2)溶解，取2mg的Sulfo-SMCC溶于4ml pH 7.2，EDTA4mM PBS缓冲液，得到0.5mg/ml的Sulfo-SMCC试剂。
③Sca-1抗体：购自RD公司(MAB1226)，500μg溶于1ml PBS缓冲液(配置方法如下：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶于1L蒸馏水，调pH至7.0)使其终浓度为0.5μg/μl。
2、用于捕捉干细胞的生物材料的获得
本实施例中设置了3组实验，分别制备3种生物材料，该生物材料分别是胶原凝胶×Sca-1抗体材料(即胶原凝胶与Sca-1抗体共价交联的生物材料)、DBM×Sca-1抗体材料(即DBM胶原材料与Sca-1抗体共价交联的生物材料)和胶原膜×Sca-1抗体材料(即胶原膜与Sca-1抗体共价交联的生物材料)。
每组实验做3次平行，3组实验材料分别安排如下：
(1)胶原凝胶×Sca-1组：实验所用的胶原凝胶由100μl，3mg/ml的I型胶原铺96孔板吹干而得到，其中I型胶原由鼠尾提取经2M/L醋酸溶解得到(制备方法如下：取新鲜大鼠尾，洗净，在酒精中浸泡15分钟消毒。将鼠尾用剪刀分成大约2cm的若干段。将鼠尾腱挤出，放于蒸馏水中，避免风干。用PBS(pH＝7.0-7.5，1.5M NaCl)浸泡尾腱，4度处理2天，换液4-6次。用预冷的2mol/L乙酸浸泡，体积根据最终需要的浓度掌握。4℃酸抽提2天，4℃离心，2000g 10分钟。上清即为鼠尾胶原。)。
Traut’s试剂的浓度为2.5mg/ml，每个反应取100μl；Sulfo-SMCC的浓度为0.5mg/ml，每个反应取1.16μl；Sca-1抗体浓度为0.5μg/μl，每个反应取5μl。即胶原凝胶、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的质量比为0.3mg∶0.25mg∶0.58μg∶2.5μg。
(2)DBM×Sca-1组：胶原材料采用脱细胞骨基质胶原材料(DBM胶原材料)(购自山东正海生物有限公司)，经Co60灭菌，用量为1簇，规格是5×3×2mm，即30mm3；Traut’s试剂的浓度为5mg/ml，每个反应取100μl；Sulfo-SMCC的浓度为0.5mg/ml，每个反应取3.32μl；Sca-1抗体浓度为0.5μg/μl，每个反应取10μl。即脱细胞骨基质胶原材料、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的比例为：1簇∶0.5mg∶1.66μg∶5μg。
(3)胶原膜×Sca-1组：胶原材料采用胶原膜(购自山东正海生物有限公司，1簇的规格是3×3mm，即9mm2)，经Co60灭菌；Traut’s试剂的浓度为5mg/ml，每个反应取100μl；Sulfo-SMCC的浓度为0.5mg/ml，每个反应取6.64μl；Sca-1抗体浓度为0.5μg/μl，每个反应取20μl。即胶原膜、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的比例为：1簇∶0.5mg∶3.32μg∶10μg。
按上述3组实验安排的胶原材料、化学交联剂的浓度以及Sca-1抗体的用量进行制备上述三种生物材料，具体步骤如下：
1)取Traut’s试剂与胶原材料于室温反应2小时，生成胶原-Traut’s化合物；同时取Sulfo-SMCC试剂与Sca-1抗体孵育1小时，生成抗体-Sulfo-SMCC化合物。
2)然后将上述步骤1)中得到的胶原-Traut’s化合物和抗体-Sulfo-SMCC化合物混合于室温孵育1小时，将Sca-1抗体共价交联到胶原材料上，即得到本发明的用于捕捉干细胞的生物材料。
通过Elisa检测制备得到的三种生物材料(胶原凝胶×Sca-1抗体材料、DBM×抗体材料和胶原膜×Sca-1抗体材料)中Sca-1抗体共价交联到胶原材料上的效率。具体方法为Sca-1抗体固定到材料后，5％BSA溶液(购自Sigma公司)室温孵育1小时。加入100μl抗大鼠碱性磷酸酶二抗(PBS缓冲液1∶20000稀释)(购自Sigma公司)室温孵育1小时后PBS缓冲液清洗3次，加入溶于碱性磷酸酶缓冲液(100mM Tris-HCl；100mM NaCl；10mM MgCl2，pH 9.6)的2mg/ml的显色底物对氧磷(p-NPP，购自Ameresco公司)进行显色。酶标仪OD405nm进行读数，分别检测了不同处理下抗体在胶原材料上的存留量。
针对每种生物材料设置以下3个对照：
单纯胶原组(C/PBS)：胶原凝胶、DBM胶原材料、胶原膜分别在室温下浸泡于PBS缓冲液中1小时。
胶原材料简单吸附Sca-1抗体组(C/Sca-1)：胶原凝胶室温下浸泡于含有2.5μgSca-1抗体溶液中1小时；DBM胶原材料室温下浸泡于含有5μg Sca-1抗体溶液中1小时；胶原膜室温下浸泡于含有10μg Sca-1抗体溶液中1小时。
胶原×BSA蛋白材料(C×BSA)：取Traut’s试剂与各个胶原材料(胶原凝胶、DBM胶原材料或胶原膜)于室温反应2小时，生成胶原-Traut’s化合物；同时取Sulfo-SMCC试剂与和Sca-1抗体等摩尔数的BSA孵育1小时，生成抗体-Sulfo-SMCC化合物。然后将胶原-Traut’s化合物和BSA蛋白-Sulfo-SMCC化合物混合于室温孵育1小时，将BSA蛋白共价交联到胶原材料上。其中，当胶原材料为胶原凝胶时，除BSA以外的各物质用量与上述(1)胶原凝胶×Sca-1组中的用量相同，BSA用量与(1)组中Sca-1抗体用量等摩尔；当胶原材料为DBM胶原材料时，除BSA以外的各物质用量与上述(2)DBM×Sca-1组中的用量相同，BSA用量与(2)组Sca-1抗体等摩尔；当胶原材料为胶原膜时，除BSA以外的各物质用量与上述(3)胶原膜×Sca-1组中的用量相同，BSA用量与(3)组中Sca-1抗体等摩尔。
结果如图3所示，共价交联后Sca-1抗体在各类胶原材料上存留显著高于其它各组，可见共价交联能够有效的将抗体固定在胶原材料上。
实施例2、用于捕捉干细胞的生物材料的功能检测
一、体外实验
在体外验证固定有Sca-1抗体的胶原材料是否具有捕捉Sca-1阳性细胞的能力。由于C57BL/6小鼠的骨髓腔是Sca-1阳性细胞的聚集处，可在体外分离C57BL/6的骨髓腔中的细胞，本实施例中具体采用C57BL/6小鼠全骨髓细胞，将C57BL/6小鼠全骨髓细胞加到功能材料上以验证体外情况下功能材料捕捉干细胞的能力。
本实验所用的生物材料是胶原凝胶×Sca-1抗体材料；同时以上述的C/PBS、C/Sca-1和C×BSA为对照。具体实验如下：
将5％牛血清白蛋白(BSA)室温孵育1小时，同时制备C57BL/6小鼠全骨髓细胞，用含22号针头的注射器将骨髓从C57BL/6小鼠的后腿的股骨和胫骨中冲出，随后用红细胞裂解液(1.5M NH4Cl、100nM KHCO3、10nM Na4EDTA)去除红细胞，得到C57BL/6小鼠全骨髓细胞。BSA孵育材料完毕后，将105cells/孔的全骨髓细胞加入至不同处理的胶原凝胶(胶原凝胶×Sca-1抗体材料、C/PBS、C/Sca-1或C×BSA)上，室温摇床孵育30分钟，去除细胞悬液，PBS清洗3次。用0.2％胶原酶将滞留在凝胶上的细胞消化下来，进行克隆形成实验并进行流式细胞仪分析。
实验结果如图4所示，在体外，交联了Sca-1抗体的胶原凝胶(即胶原凝胶×Sca-1抗体材料)可富集大量细胞，而单纯胶原组(C/PBS)、胶原材料简单吸附Sca-1抗体组(C/Sca-1)及BSA蛋白/胶原材料共价交联蛋白组(C×BSA)细胞零星分布，说明对照组并不具有富集细胞的能力。随后，将滞留在Sca-1抗体共价交联胶原凝胶上的细胞进行了克隆形成率实验，发现这些细胞具有多向分化潜能，能够分化为红细胞系集落形成单位(CFU-E)、红细胞裂解形成单位(BFU-E)、粒细胞巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、粒细胞-幼红细胞-单核细胞-巨核细胞集落形成单位(CFU-GEMM)等克隆，而单纯的全骨髓细胞主要形成CFU-GM。流式细胞仪分析结果，如图4中C所示，Sca-1抗体共价交联胶原组的细胞Sca-1的阳性率为69.2±6.5，而未分选的细胞阳性率为14.5±1.3，两者具有极其显著差。
二、体内验证
在上述步骤一中的体外实验验证了共价交联Sca-1抗体的胶原材料具有捕捉Sca-1阳性细胞的能力之后，本步骤二中进一步进行了体内验证。具体为首先，采用肌肉包埋的方法验证本发明的生物材料在体内是否具有捕捉干细胞的能力，随后，将本发明的生物材料以心肌补片的形式移植入小鼠心脏以验证其在心肌损伤上的修复效果。
1、肌肉包埋实验
取5×3×2mm的DBM胶原材料经Co60灭菌，将Sca-1抗体及与Sca-1抗体等量的BSA蛋白经交联反应锚定在DBM胶原材料上，构成DBM×Sca-1抗体材料和DBM×BSA蛋白材料(C×BSA)对照。将C57BL/6小鼠大腿肌肉进行横断，破坏其动脉，随后将制备好的DBM×Sca-1抗体材料或C×BSA对照移植入小鼠大腿肌肉内。48小时后，将移植后的胶原支架取出，胶原酶消化后进行流式细胞仪分析。
实验结果如图5所示，DBM×Sca-1抗体材料包埋入C56/BL6小鼠肌肉内2天后，胶原酶消化获得细胞。流式细胞仪分析结果，显示DBM×Sca-1抗体材料内Sca-1干细胞阳性率为11.96±1.62，而C×BSA对照胶原内Sca-1干细胞阳性率为3.59±1.01，具有极显著性差异。
2、心肌补片实验
取3×3mm的胶原膜经Co60灭菌，将Sca-1抗体及与Sca-1抗体等量的BSA蛋白经交联反应分别锚定在胶原膜上，构成胶原膜×Sca-1抗体材料和胶原膜×BSA蛋白材料。将C57/BL6小鼠麻醉后，进行开胸手术。待心脏暴露后，在无血管左心室壁上切除2×2.5×0.5mm心肌组织，将本发明生物材料(胶原膜×Sca-1抗体材料或胶原膜×BSA蛋白材料对照)分别作为心肌补片缝合在伤口部位。手术后30天、90天取材进行病理学切片分析，手术后90天进行超声心动功能分析。
实验结果如图6和图7所示，在小鼠心肌补片手术4、12周后，将包埋有材料的心脏取出并进行一系列病理学及功能学检测分析。结果显示，手术4周后，胶原Sca-1抗体交联组中胶原已出现转型重构(remodeling)，胶原纤维排列有序，而胶原BSA交联组中胶原排列杂乱无章。且胶原Sca-1抗体交联组中材料内浸润的细胞数目明显多于胶原BSA交联组，具有显著性差异。此外，我们还检测了材料内血管网络的重建，发现胶原Sca-1抗体交联组中材料内的血管数目亦显著多于胶原BSA交联组(如图5所示)。手术12周后，胶原Sca-1抗体交联组中胶原材料排列已完全降解，其排列与正常心肌组织类似，且出现心肌细胞的再生。而胶原BSA交联组中胶原材料仍未全部降解，其排列杂乱无章，且几乎未见心肌细胞的再生。同时，我们通过超声心动检测了心脏功能。胶原Sca-1抗体交联组中，小鼠的左心室射血分数及缩短分数均高于胶原BSA交联组(如图7所示)。
综上，干细胞特异性抗体Sca-1抗体通过共价交联的方法锚定在胶原材料上，得到的本发明的生物材料，无论在体外实验还是体内实验中均可捕捉足够数量的Sca-1阳性干细胞，且并不影响干细胞的活性。当该功能性胶原材料移植入受损心肌部位，手术90天后可观察到明显的心肌再生且伴随着心肌功能的恢复。
Claims (6)
1.用于捕捉干细胞的生物材料的制备方法，是将胶原材料与Sca-1抗体共价交联，得到所述用于捕捉干细胞的生物材料；
所述胶原材料为胶原凝胶、脱细胞骨基质胶原材料或胶原膜；
所述共价交联是通过化学交联剂作用完成的；
所述化学交联剂为Sulfo-SMCC和Traut’s Reagent；
所述共价交联的步骤包括如下：
1）将所述Traut’s Reagent与所述胶原材料一起反应2小时，获得胶原-Traut’s化合物；将所述Sulfo-SMCC与所述Sca-1抗体孵育1小时，获得抗体-Sulfo-SMCC化合物；
2）再将上述步骤1）中获得的胶原-Traut’s化合物和抗体-Sulfo-SMCC化合物混合孵育，所述孵育的时间为0.5-2小时，得到所述用于捕捉干细胞的生物材料；
步骤1）中，所述胶原材料、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体为如下（1）-（3）中任一所述：
（1）胶原材料为胶原凝胶，胶原凝胶、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的质量比为0.2-0.4mg：0.2-0.3mg：0.4-0.7μg：2-3μg；
（2）胶原材料为脱细胞骨基质胶原材料，脱细胞骨基质胶原材料、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的比例为：1簇：0.3-0.6mg：1.5-1.8μg：4-6μg；所述1簇的规格是20-40mm3；
（3）胶原材料为胶原膜，胶原膜、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的比例为：1簇：0.3-0.6mg：3-4μg：8-12μg，所述1簇的规格是5-15mm2；
所述（1）中Traut’s Reagent的浓度为2-3mg/ml，Sca-1抗体的浓度为0.4-0.6μg/μl，Sulfo-SMCC的浓度为0.4-0.6mg/ml；
所述（2）中Traut’s Reagent的浓度为4-6mg/ml，Sca-1抗体的浓度为0.4-0.6μg/μl，Sulfo-SMCC的浓度为0.4-0.6mg/ml；
所述（3）中Traut’s Reagent的浓度为4-6mg/ml，Sca-1抗体的浓度为0.4-0.6μg/μl，Sulfo-SMCC的浓度为0.4-0.6mg/ml。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述孵育的时间为1小时。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：胶原材料为脱细胞骨基质胶原材料，所述1簇的规格是30mm3；
（3）胶原材料为胶原膜，所述1簇的规格是9mm2。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述（1）中胶原凝胶、Traut’sReagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的质量比为0.3mg：0.25mg：0.58μg：2.5μg，所述Traut’s Reagent的浓度为2.5mg/ml，Sca-1抗体的浓度为0.5μg/μl，Sulfo-SMCC的浓度为0.5mg/ml；
所述（2）中脱细胞骨基质胶原材料、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的比例为：1簇：0.5mg：1.66μg：5μg，所述Traut’s Reagent的浓度为5mg/ml，Sca-1抗体的浓度为0.5μg/μl，Sulfo-SMCC的浓度为0.5mg/ml；
所述（3）中胶原膜、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗体的比例为：1簇：0.5mg：3.32μg：10μg，所述Traut’s Reagent的浓度为5mg/ml，Sca-1抗体的浓度为0.5μg/μl，Sulfo-SMCC的浓度为0.5mg/ml。
5.权利要求1-4中任一所述制备方法得到的用于捕捉干细胞的生物材料。
6.权利要求5所述的生物材料在制备组织修复材料中的应用。
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