CN102590308A - 一种孔状生物传感器、制作及应用方法 - Google Patents

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本发明公开一种孔状生物传感器、制作及应用方法，其中孔状生物传感器其特征在于：依次具有基板、电极层、和聚合物薄膜层。基板电极传感区域聚合物薄膜被去除，暴露的基板电极区域与聚合物薄膜层边缘形成井状结构区阵列；呈连孔状结构的氧化锌包裹层填充在各井状结构区内；带负电的生物活性物质分子通过静电作用吸附在氧化锌孔状结构内，呈连孔状结构的包裹层内孔与孔之间的采用纳米级的狭窄瓶颈结构。

Description

一种孔状生物传感器、制作及应用方法
技术领域
本发明涉及一种生物传感器，特别是一种连孔状结构的生物传感器，及该生物传感器制作方法和应用于生物医疗方面的检测方法。
背景技术
生物传感器利用生物活性物质的亲和性，如酶-底物、酶-辅基、抗原-抗体、激素-受体等的分子识別功能，可以有选择地检测待测物。由于生物活性物质具有专一识別功能，使得生物传感器具有较高的选择性，能直接用于复杂样品的检测。生物传感器已被广泛地应用于临床医学检测、工业过程控制、环境检测、化学物质安全性评价以及食品，制药等许多领域。
在生物传感器构建中，其关键技术之一就是如何将生物分子稳定、高活性地固定到换能器表面。納米材料，因其具有较大的表面积、高表面活性、強吸附力及高催化效率等优异特性，可在增加生物分子(酶、抗原或抗体等)的吸附量和稳定性的同時，提高生物分子(酶)的催化活性，提高传感器的反应灵敏度。氧化锌纳米材料，如氧化锌纳米梳，纳米线等已成功应用于生物传感器的构建(如尿酸，过氧化氢，葡萄糖传感器等)，因为氧化锌纳米材料有很好的生物兼容性，而且由于周围有利的微环境，它们能很好地保持生物分子的活性，并且能增強活性位点和电极之间的电子转移能力。
氧化锌具有较高的等电点，低等电点的生物分子(如葡萄糖氧化酶，尿酸酶等)可通过静电作用吸附在高等电点的氧化锌纳米材料表面，起到固定生物活性物质在电极表面的作用。基于氧化锌纳米材料的生物传感器显示出高灵敏度和快速反应的特点，但是测定的线性范围往往较小，限制了其应用范围，比如基于氧化锌纳米线的葡萄糖传感器测定的线性范围是0.01～3.45mM，但是正常的人体血糖含量却在3.5～6.1mM之间。而且随着时间的推移，吸附在氧化锌电极表面的生物分子的活性会降低，导致生物传感器的灵敏度下降，稳定性较差。
发明内容
本发明的目的克服上述现有技术不足，提供一种具有连孔状结构的包裹层的生物传感器，并提供一种该生物传感器制作和应用方法。
本发明通过如下方案实现：
一种孔状生物传感器，依次具有基板、电极层、和聚合物薄膜层。基板电极传感区域聚合物薄膜被去除，暴露的基板电极区域与聚合物薄膜层边缘形成井状结构区阵列；呈连孔状结构的氧化锌包裹层填充在各井状结构区内；带负电的生物活性物质分子通过静电作用吸附在氧化锌孔状结构内。呈连孔状结构的包裹层内孔与孔之间的采用纳米级的狭窄瓶颈结构。生物活性物质为酶、抗原或抗体等，聚合物薄膜层为聚二甲基硅氧烷。
一种制作孔状生物传感器的方法，其特征在于：包括：
步骤一，基板电极制作；
步骤二，将聚合物薄膜材料粘附在基板，并把电极传感区域的聚合薄膜材料去除，使底部的电极区域暴露出来，暴露的基板电极区域与聚合薄膜材料边缘形成井状结构区阵列；
步骤三，将聚苯乙烯微纳米球状模板多层整齐分布在基板电极上，聚苯乙烯微纳米球体之间紧密相连，形成多孔相连状的模板结构；
步骤四，用电沉积的方法在暴露的电极上沉积氧化锌晶体，沉积的氧化锌填充了井状结构区内聚苯乙烯微纳米球体间的间隙；
步骤五，将聚苯乙烯微纳米球状模板用化学腐蚀的方法去除，得到连孔状结构氧化锌包裹层；
步骤六，使生物活性物质分子带上负电，在氧化锌包裹层的正电吸附作用和渗透原理，生物活性物质分子进入氧化锌包裹层的连孔状结构内。
作为优化，所述的步骤一，传统半导体工艺在基板上制备一层惰性金属或石墨电极阵列，然后用光刻技术在玻璃基板上腐蚀出电极阵列图案形成；
所述的步骤二，所述聚合物薄膜材料为聚二甲基硅氧烷；
所述的步骤三，将聚苯乙烯微球粉末与去离子水均匀混合得到亲水胶体，然后将聚苯乙烯粉末亲水胶体滴入井状结构区内，并经水分蒸发形成多孔相连状的模板结构；
所述的步骤五，将聚苯乙烯微纳米球被苯溶液溶解去除，基板电极取出后反复用去离子水冲洗。
另外，应用本发明的孔状生物传感器进行目标分析物检测时，先将孔状生物传感器浸入含有目标分析物的溶液中，然后采用三电极体系，以孔状生物传感器电极为工作电极，以Ag/AgCl电极为参比电极，以白金Pt电极为辅助电极，检测孔状生物传感器电极表面发生氧化反应产生的电流信号以检测含有目标分析物溶液的浓度。
综上所述本发明具有如下显著特点和效果：
1).特殊的连孔状结构的氧化锌包裹层可以将大量的生物活性物质(酶、抗原或抗体等)稳定、高活性地固定到电极表面上；由于具有有利的微孔环境，它们能很好地保持包裹在孔内的生物活性物质分子的活性，并且能增強生物活性物质分子活性位点和电极之间的电子转移能力。
2).孔与孔之间的连接处是纳米级的狭窄瓶颈结构，包裹在孔内的生物活性物质不易从瓶颈处逸出；减缓了目标分析物进入孔内的渗透速度，即使是在目标分析物样品浓度高的情况下，也能使目标分析物进入电极孔内的渗透速度和孔内的生物活性物质的催化反应速度保持一致，从而确保生物传感器有较大的测定线性范围。
3).微孔结构中可以存储大量的生物活性物质，即使一部分的生物活性物质随着时间的推移而失去活性，其剩余生物分子的生物活性也足以起到识别或催化的作用，使渗入孔内的目标分析物全部参与氧化或还原反应，将目标物浓度转换成可被检测到的电流信号，确保了高灵敏性和稳定性。
附图说明
图1孔状生物传感器制备流程及结构示意图；
图2孔状生物传感器电极及包裹层截面示意图；
图3采用循环伏安法举例实验数据图；
图4电流信号与目标分析物浓度的线性关系测试数据图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步描述：
首先是孔状生物传感器的制作方法。
参考图1，制作孔状生物传感器主要包括如下步骤
步骤一：基板电极制作。电极材料可以用贵金属、石墨等材料制作。以贵金属电极制作为例，首先采用蒸发镀膜设备在玻璃基板的表面沉积一层贵金属，然后用光刻技术在玻璃基板上腐蚀出电极阵列图案，每个电极通过基板上的导电连线与恒电位仪等伏安法分析电路相连。
步骤二：聚合物薄膜层井状结构区阵列井阵列制作。将一层1毫米厚(可以根据需要选取其它厚度)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜贴附在基板表面，按照基板电极的图案制作成PDMS井状结构区阵列，将电极区域暴露出来。(参考图1)。
步骤三：将聚苯乙烯微纳米球状模板多层整齐有序地分布在基板电极上。所使用的模板球体需具有一致的直径，在本实施例中，优选方案，聚苯乙烯微纳米球体具有1微米的均匀直径(可以根据实际选取其它直径)。聚苯乙烯微纳米球呈现粉末状态，为了方便操作，可以将0.08克的聚苯乙烯微球粉末与20mL的去离子水均匀混合得到亲水胶体。然后将聚苯乙烯粉末亲水胶体滴入井状结构区中的电极表面上。为了让聚苯乙烯微纳米球均匀多层分布，将基板放在95℃的热板上加速水分蒸发，而水分蒸发产生的表面张力使得每个聚苯乙烯微纳米球都能与邻近的微球体彼此相连，形成多孔相连状的模板结构(参考图1)。
步骤四：用电沉积的方法在暴露的电极上沉积氧化锌晶体，沉积的氧化锌填充了井状结构区内聚苯乙烯微纳米球体间的间隙。具体为将排布了聚苯乙烯微纳米球模板的电极基板浸入0.04mL Zn(NO3)2的水溶液中，聚苯乙烯微球表面经化学处理后呈现亲水性，Zn(NO3)2溶液可以轻易地渗透进分层排布的聚苯乙烯微球阵列的间隙之间。将一个白金Pt电极作为基准电极浸入在电解溶液中。将-1V的直流电压加在基板电极上开始氧化锌电化学沉积。氧化锌从基板电极开始沉积，约半小时后，逐渐填满聚苯乙烯微纳米球状模板之间的间隙(参考图1)。
步骤五：去除聚苯乙烯微纳米球状模板，得到连孔状结构氧化锌包裹层。具体为，将沉积好氧化锌的电极基板浸入甲苯溶液中，约24小时后，聚苯乙烯微纳米球全部被化学腐蚀溶解在甲苯中，然后将基板电极取出，反复用去离子水冲洗干净，再放在烘干炉中进行干燥处理，得到具有多孔的连孔状结构氧化锌包裹层(参考图1和图2)。孔与孔之间的采用纳米级的狭窄瓶颈结构(参考图2)。
步骤六：使生物活性物质分子带上负电，在氧化锌包裹层的正电吸附作用和渗透原理，生物活性物质分子进入氧化锌包裹层的连孔状结构内。具体为，将生物活性物质溶于pH缓冲溶液，将溶液的pH值调至到适当范围(可以参考现有技术确定)，使得生物活性物质分子有较好的活性，同时使生物活性物质分子在溶液中带上负电，而让连孔状氧化锌表面带上正电，通过静电作用吸附作用将生物活性物质分子包裹在氧化锌孔状结构内。以制备葡萄糖传感器中葡萄糖氧化酶GOx为例，在0.01ML磷酸盐PBS缓冲液(pH7.4)中混入葡萄糖氧化酶GOx(3900U/mL)，低等电点的GOx(IEP～4.2)在(pH7.4)的缓冲液中表面带上负电荷。将制备好的葡萄糖氧化酶GOx溶液滴入孔状电极井状结构区内，利用带负电的葡萄糖氧化酶分子与带正电的氧化锌产生静电吸附作用和渗透原理，将葡萄糖氧化酶GOx载入到电极孔状结构内。该过程需在适度的温度(4℃)中进行，以保证生物分子的活性，载入过程持续一天的时间。然后用磷酸盐PBS缓冲液反复冲洗电极表面，去除未被载入孔内的葡萄糖氧化酶分子。
综上所述，本制作孔状生物传感器步骤中，生物活性物质、包裹层材料、聚合物薄膜层、电极等材料可以根据现有技术选用等效或相近的材料，在不脱离本发明方案核心的等效替代应属于其保护范围内。
一种孔状生物传感器，为上述步骤制作而形成的生物传感器。首先，参考图1，它自下至上，依次具有基板、电极层、和聚合物薄膜层。其中，基板电极传感区域聚合物薄膜被去除后，暴露的基板电极区域与聚合物薄膜层边缘形成井状结构区阵列；呈连孔状结构的氧化锌包裹层被填充在各井状结构区内；带负电的生物活性物质分子通过静电作用吸附在氧化锌孔状结构内形成。呈连孔状结构的氧化锌包裹层内，孔与孔之间的采用纳米级的狭窄瓶颈结构(参考图2)。生物活性物质可以为酶、抗原或抗体等，聚合物薄膜层可以为聚二甲基硅氧烷或等效替代材料。孔状生物传感器内的生物活性物质不同，可以制作形成不同功能的生物传感器，如葡萄糖等。
参考图3和图4，本发明的孔状生物传感器用在测量葡萄糖溶液浓度的实验数据图。使用孔状生物传感器检测目标分析物的方法时，将孔状生物传感器浸入含有目标分析物的溶液中，然后采用三电极体系，以孔状生物传感器电极为工作电极，以Ag/AgCl电极为参比电极，以白金Pt电极为辅助电极。当加载在孔状氧化锌工作电极上的电压大于0.1V时，能检测到明显的氧化反应电流。孔状电极中氧化反应电流大小随着葡萄糖浓度的增加而增加，在峰电位基本不变的情况下，峰电流大小与葡萄糖的浓度呈线性增加的关系(见图3和图4)。实施例中的孔状氧化锌电极的葡萄糖孔状生物传感器具有较高的灵敏度和稳定性，比其他氧化锌纳米电极，如氧化锌纳米线和纳米梳电极等具有更大的线性测定范围。
孔状生物传感器传感过程中，电极利用包裹在孔内的葡萄糖氧化酶(GOx)的催化特性将葡萄糖(Glucose)氧化生成葡萄糖酸，同时葡萄糖氧化酶(GOx)中的黄素基团(FAD)自身被还原成(FADH2)基团，GOx(FADH2)基团被溶液中溶解的氧气分子再次氧化成GOx(FAD)，在此过程中生成过氧化氢(H2O2)产物，过氧化氢(H2O2)在电极表面发生氧化反应，产生的氧化电流信号用于表示溶液中葡萄糖的浓度。
这样通过检测孔状生物传感器电极表面发生氧化反应产生的电流信号以检测含有目标分析物溶液的浓度。

Claims (9)

1.一种孔状生物传感器，其特征在于：电极表面具有呈连孔状结构的包裹层。
2.如权利要求1所述的孔状生物传感器，其特征在于，生物活性物质被吸附并存储在包裹层的孔内。
3.如权利要求3所述的孔状生物传感器，其特征在于，所述包裹层孔与孔之间的连接处是纳米级的狭窄瓶颈结构。
4.如权利要求1至3任一所述的孔状生物传感器，其特征在于，所述包裹层材料为氧化锌。
5.如权利要求4所述的孔状生物传感器，其特征在于，依次具有基板、电极层、和聚合物薄膜层，基板电极传感区域聚合物薄膜被去除，暴露的基板电极区域与聚合物薄膜层边缘形成井状结构区阵列；呈连孔状结构的氧化锌包裹层填充在各井状结构区内；生物活性物质分子通过静电作用吸附在氧化锌孔状结构内。
6.如权利要求5所述的孔状生物传感器，其特征在于，所述生物活性物质为酶、抗原、抗体或适配体；所述聚合物薄膜层为聚二甲基硅氧烷。
7.一种制作孔状生物传感器的方法，其特征在于：包括：
步骤一，基板电极制作；
步骤二，将聚合物薄膜材料粘附在基板，并把电极传感区域的聚合薄膜材料去除，使底部的电极区域暴露出来，暴露的基板电极区域与聚合薄膜材料边缘形成井状结构区阵列；
步骤三，将聚苯乙烯微纳米球状模板多层整齐分布在基板电极上，聚苯乙烯微纳米球体之间紧密相连，形成多孔相连状的模板结构；
步骤四，用电沉积的方法在暴露的电极上沉积氧化锌晶体，沉积的氧化锌填充了井状结构区内聚苯乙烯微纳米球体间的间隙；
步骤五，将聚苯乙烯微纳米球状模板用化学腐蚀的方法去除，得到连孔状结构氧化锌包裹层；
步骤六，使生物活性物质分子带上负电，在氧化锌包裹层的正电吸附作用和渗透原理，生物活性物质分子进入氧化锌包裹层的连孔状结构内。
8.如权利要求7所述的制作孔状生物传感器的方法，其特征在于，
所述的步骤一，基板电极制作，采用传统半导体工艺在基板上制备一层惰性金属或石墨电极阵列；
所述的步骤二，所述聚合物薄膜材料为聚二甲基硅氧烷；
所述的步骤三，将聚苯乙烯微球粉末与去离子水均匀混合得到亲水胶体，然后将聚苯乙烯粉末亲水胶体滴入井状结构区内，并经水分蒸发形成多孔相连状的模板结构；
所述的步骤五，将聚苯乙烯微纳米球被苯溶液溶解去除，基板电极取出后反复用去离子水冲洗。
9.一种孔状生物传感器检测目标分析物的方法，其特征在于：将孔状生物传感器浸入含有目标分析物的溶液中，然后采用三电极体系，以孔状生物传感器电极为工作电极，以Ag/AgCl电极为参比电极，以白金Pt电极为辅助电极，检测孔状生物传感器电极表面发生氧化反应产生的电流信号以检测含有目标分析物溶液的浓度。
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