CN102586277B - 一组控制水稻抽穗期的dth2基因及其单倍型和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一组控制水稻抽穗期的DTH2基因及其单倍型和应用。该基因编码一个CCT/B-box锌指蛋白，属于CONSTANS-Like转录因子基因家族，显性等位基因序列如SEQ ID NO.1所示，只在长日照条件下促进开花。隐性等位基因的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。通过转基因实验证明了该基因具有使水稻抽穗期提前的功能。通过对79份栽培稻和48份野生稻的测序，发现在DTH2编码区存在5个碱基差异，导致3个氨基酸变化，产生五种单倍型。并证明该基因在驯化中被选择，且起源于中国。

Description

一组控制水稻抽穗期的DTH2基因及其单倍型和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一组控制水稻抽穗期的DTH2基因及其单倍型和应用。

技术背景

抽穗期是一个重要的农艺性状，并且可能在作物的驯化过程中被选择(Izawa T.Journal of ExperimentalBotany 58：3091-3097(2007))。栽培稻目前分布在世界范围内的从北纬53°到南纬40°之间的广大地区(ChangT.T.Euphytica 25，425-441(1976))。然而，亚洲栽培稻的祖先普通野生稻，主要分布在南亚，东南亚和澳大利亚北部，其分布的最北限位于北纬28°的东乡野生稻。水稻驯化的一个重要目的是产生适应各地区种植的水稻品种，从而扩大栽培面积。影响栽培稻向北扩张的主要限制因素就是抽穗期。在高纬度地区(例如亚洲东北部)，早抽穗和对光周期不敏感的特性，保证了水稻能在寒冷天气来临之前种子发育成熟。因此，为满足日益增长的人口对粮食的需求，寻找能扩大栽培稻种植面积的关键基因，并克隆相应基因，阐明其遗传基础和分子机理，对培育广适性水稻品种具有重要的理论和实践意义。

水稻品种的抽穗期主要由其感光性、感温性和基本营养生长性决定(Chang T T，Li C C，Vergara B S.(1969)Euphytica，18：79～91；Tsai K H.(1985)Rice Genet Newslett，2：77～78；Tsai K H.(1986)In：RiceGenetics.International Rice Research Institute，339～349)。水稻品种感光性、感温性和基本营养生长性组合的多样性，使得抽穗期的遗传表现异常复杂，经典遗传学和分子遗传学都证明抽穗期是由少数质量性状基因和多个数量性状基因(QTL Quantitative Trait Locus)控制的。到目前为止，已经有20个水稻抽穗期基因被克隆，其中有6个是通过精细定位图位克隆的途径克隆的。如Hd1，Hd6，Hd3a，Ehd1，Ghd7和DTH8(Yano，M.et al.(2000)Plant Cell 12，2473-2483；Takahashi，Y.，Shomura，A.，Sasaki，T.& Yano，M.(2001)Proc NatlAcad Sci USA 98，7922-7927；Kojima，S，，Takahashi，Y.& Kobayashi，Y.(2002)Plant Cell Physiol 43，1096-1105；Doi，K.et al.(2004)Genes.Dev.18，926-936；Xue，W.Y.et al.(2007)Nat.Genet.40，761-767；Wei，X.J.et al.(2010)Plant.Physiol.153，1747-1758)。对于抽穗期基因来说，由于各地光周期的差异，不同地区的人可能会选择不同类型的光敏感材料以适应当地的光照条件。研究发现Hd1和Ghd7的等位基因的自然变异和水稻的分布区有关，但Hd1和Ghd7的等位变异对于品种抽穗期的改变过于剧烈，对其它基因也有很强的上位作用，因此，在品种抽穗期的改良上很难应用。而微效基因的改变较易适应环境的缓慢变化，更具有适应性，在育种上有重要意义。另外判断一个基因是否是驯化基因，主要看该基因在野生稻中的等位基因类型对人类是无利的，而经过驯化以后栽培稻中的等位基因类型对人类是有利的。即人类驯化选择了对人类有利的性状，但并不是所有的有利性状都是驯化的。

利用源于粳稻品种Asominori和籼稻品种IR24的重组自交系(RILs)群体，我们之前的研究检测到多个抽穗期QTL(Wei XJ，et al.(2010)Mol Breeding 25：287-298)，其中我们关注位于第二染色体长臂末端RM318和RM240之间的微效抽穗期QTL(该QTL在本发明中被命名为DTH2)，在自然长日照条件下，包含Asominori等位基因的植株比包含IR24等位基因的植株提前抽穗。到目前为止，还没有发现通过QTL克隆的基因属于在长日照条件下促进开花的类型(Tsuji H，Taoka KI and Shimamoto K(2010)Current Opinion in Plant Biology14：1-8)。精细定位水稻抽穗期QTL最好的办法就是构建染色体片段置换系(CSSL)或近等基因系(NIL)，使目标QTL位点之外的绝大部分背景保持一致，使该位点表现为典型的孟德尔遗传，即数量性状质量化。但是对于微效QTL来说，在F₂群体里，由于杂合型单株和隐性纯合型单株的表型差异较小，在构建NIL的基础上，还需要把F₂群体繁衍成F_2:3家系群体，使表型易于鉴定。之后把QTL分解为单个基因并进行图位克隆，即通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定目的基因在染色体上的物理位置。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供了一组控制水稻抽穗期的DTH2基因及其单倍型和应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一个控制水稻抽穗期基因DTH2，它来自水稻，长度为7867bp，相应编码CCT/B-box锌指蛋白的407个氨基酸，显性等位基因DTH2-a(DTH2等位基因来自一个日本的粳稻品种Asominori)全序列为SEQ IDNO.1，其CDS序列如SEQ ID NO.2所示，属于DTH2基因的单倍型5(Haplotype5，Hap5)。

所述的控制水稻抽穗期基因DTH2在水稻品种改良中的应用。

所述的基因DTH2的隐性等位基因DTH2-i(DTH2等位基因来自一个国际水稻所的籼稻品种IR24)，核苷酸全序列如SEQ ID NO.3所示，其CDS序列如SEQ ID NO.4所示，属于DTH2基因的单倍型1(Haplotypel，Hapl)。

所述的基因DTH2的隐性等位基因DTH2-i在水稻品种改良中的应用。

所述的基因DTH2的单倍型2(Hap2)，其CDS序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

所述的基因DTH2的单倍型2在水稻品种改良中的应用。

所述的基因DTH2的单倍型3(Hap3)，其CDS序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

所述的基因DTH2的单倍型3在水稻品种改良中的应用。

所述的基因DTH2的单倍型4(Hap4)，其CDS序列如序列表SEQ ID NO.7所示。

所述的基因DTH2的单倍型4在水稻品种改良中的应用。

根据图1的技术路线，本发明为精细定位QTL DTH2，利用以Asominori为背景亲本，IR24为供体亲本的染色体片段置换系(CSSLs)群体(南京农业大学水稻研究所保存)，鉴定出晚抽穗的携带DTH2-i插入片段的家系CSSL18。从CSSL18与Asominori杂交构建的次级F₂群体中，再次检测到DTH2(LOD值24.70，贡献率26.22％)。进一步利用分子标记辅助选择的方法(MAS)，构建了仅携带DTH2的近等基因系--NIL(DTH2)并利用NIL(DTH2)×Asominori的次级F₂、F_2:3以及F_3:4群体，最终将DTH2限定在标记dCAPS3与dCAPS5之间约37.6kb的区间范围内，共有9个候选基因。序列分析发现第5个基因，编码CCT/B-box锌指蛋白，且与拟南芥COL9同源，暗示着该基因可能是目的基因。通过构建一个包含该基因的7867bp基因组区段的转基因组全长互补载体，转入NIL(DTH2)中，发现T₂代转基因家系抽穗提前。通过Real-time RTPCR发现，DTH2在水稻抽穗期途径中位于Hd3a和RFT1的上游。随后通过对79份栽培稻和48份野生稻的测序，发现在DTH2编码区存在5个碱基差异，导致3个氨基酸变化，产生5种单倍型。并证明DTH2在驯化中被选择，且起源于中国。

有益效果

1.本发明通过构建近等基因系NIL(DTH2)，并利用NIL(DTH2)×Asominori的次级F₂、F_2:3以及F_3:4群体，通过图位克隆的方法，最终克隆了一个扩大栽培稻向北分布区及控制水稻抽穗期的微效基因DTH2，此基因是第一个通过图位克隆的方法克隆的在长日条件下促进水稻抽穗的基因，为扩大栽培稻向北分布区提供新的基因资源，也为其他作物利用电子克隆法克隆相关基因提供了基因序列，进一步分析发现该基因是一个驯化基因，为水稻的进化研究提供新的思路。

2.将DTH2-a导入包含DTH2-i的育种材料中，可以使该材料的抽穗期提前，种植范围由其原产地向北迁移，扩大栽培稻的向北分布区。

3.本发明克隆的基因与驯化相关，其驯化模式可为水稻、玉米和大豆等农作物的光周期反应和分子进化研究提供参照。

附图说明

图1.本发明的总体技术流程图

图2.DTH2的精细定位和转基因全长互补T₂代和干扰T₂代的结果。

A图是DTH2精细定位图；B图表示DTH2的基因结构；C-D图表示转基因全长互补T₂代和干扰T₂代及两亲本Asominori和NIL(DTH2)的表型(C)和抽穗期数据(D)，P¹和P²分别指全长互补转基因植株和NIL(DTH2)及干扰植株和Asominori之间的P值，采用威尔科克森符号秩检验，P³指两亲本之间的P值，采用双尾t检测，n指实验中检测的植株数，平均值±s.e.m。

图3.本发明中用到的双元载体pCAMBIA1305.1的载体图。

图4.DTH2编码区的自然变异和地理分布分析。

图A是对79个栽培稻和48个野生稻的DTH2编码区测序的结果，显示了5个SNP和5种单倍型；图B显示了5种单倍型的地理分布；图C显示了5种单倍型的转基因结果，平均值±s.e.m，P值采用双尾t检测得出；图D显示了5种单倍型在不同亚种之间的分布和它们之间的进化关系。

具体实施方式

实施例1 DTH2近等基因系的构建

1.DTH2的QTL检测，回交与选择

利用Asominori和IR24的RILs群体，我们之前的研究检测到多个控制抽穗期的基因位点，其中的一个位点DTH2，在自然长日照(natural long-day，NLD)条件下，包含DTH2-a的植株比包含DTH2-i的植株提前抽穗。利用以Asominori为背景亲本，IR24为供体亲本的CSSLs群体，我们发现CSSL18比背景亲本Asominori具有极显著迟熟且表达稳定，由于CSSL18与背景亲本Asominori相比，仅在某些片段上插入了IR24片段，因此插入的籼稻片段IR24是导致CSSL18具有极显著迟熟的根本原因。我们将CSSL18与Asominori杂交一次，连续回交4次，然后自交构建一个包含374个单株的CSSL18/Asominori BC₄F₂群体，采用IciMapping v2.1软件，从中再次检测到DTH2。目标区段确定在两个SSR(Simple Sequence Repeat)标记RM318和RM240之间(RM系列引物公知公用，见网站www.gramene.org)，遗传距离9.6cM(厘摩)。从表1可以看出在这个区间存在一个控制抽穗期的QTL，贡献率26.22％，运用MAS技术，选择在DTH2区段为纯合IR24基因型，而在其他区段为纯合Asominori背景的单株即为NIL(DTH2)。

表1.位于RM318和RM240之间控制抽穗期的QTL

％PVE：解释表型变异率；a：加性效应；d：显性效应。

2.微卫星标记基因型鉴定方法(SSR技术)

PCR标准程序参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社。PCR采用20μl反应体系如下：DNA模版20-50ng，引物0.5μM，dNTP100μM，1×buffer(Mg²⁺ plus)和1U rTaqDNA聚合酶(购自日本Takara公司)。PCR扩增条件为：98°预变性3分钟；94°30秒，55°30秒，72°1分钟，35个循环；72°延伸7分钟。PCR产物在6％的聚丙烯酰胺凝胶上分离后进行银染(Basam，et al.(1991)Anal.Biochem.196：80-83)。

实施例2 DTH2的精细定位与图位克隆

1.两亲本的抽穗期表型鉴定

抽穗期指单株的第一个穗子抽出的日期；抽穗期天数指单株自播种到第一个穗子抽出的天数；极端晚抽穗单株指抽穗期与亲本NIL(DTH2)相同或更晚的单株；极端晚抽穗家系指一个随机家系中大部分单株抽穗都相同或晚于亲本NIL(DTH2)的家系。在北京NLD条件下(中国农业科学院作物科学研究所东门网室)，NIL(DTH2)比Asominori晚抽穗7.4天(表1，图2C)。而在海南自然短日照(natural short-day，NSD)条件下(海南陵水南京农业大学南繁基地)，两亲本抽穗没有显著差异。经过光照培养箱严格的长日照(LD，14小时光照/10小时黑暗)与短日照(SD，10小时光照/14小时黑暗)处理，结果分别与在NLD和NSD条件下的一致(表2)。

表2.Asominori和NIL(DTH2)在不同光照条件下的抽穗期表现

^a双尾t检测

2.DTH2的精细定位与候选基因分析

为进一步缩小DTH2的区间，我们在2006年构建了NIL(DTH2)×Asominori F₂群体，获得2712个F₂单株。为使极端单株的表型易于观察，我们把F₂群体繁衍成F_2:3家系群体。即每个F₂单株收的种子种两行，每行10株。我们在2007年种植了2712个F_2:3家系共54240株，其中挑选到652个极端晚抽穗家系，符合单个孟德尔因子的3∶1分离比(χ²＝1.33，P＝0.249)，表明在此群体里，抽穗期早晚是由一个单基因控制的，并且早抽等位基因对晚抽等位基因表现为显性。因为652个极端家系不足以精细定位，因此我们通过分子标记在剩余的F_2:3家系中选择了10株在DTH2位点杂合的单株，全部收种，经过冬天在海南南繁加代，在2008年种植了1600个F_3:4家系，从中又选出了447个极端晚抽穗家系。随后，我们利用1099个极端晚抽穗家系对DTH2进行精细定位，利用RM318和RM240分别找到21个和190个交换单株。再利用开发的6个SSR标记RM13896、RM6290、RM13904、RM13924、RM13929、RM530，和1个InDel标记ind6对这211个交换单株进行筛选，发现在RM13896和RM530之间存在129个交换单株，在RM6290和RM13929之间存在18个交换单株，在RM13904和ind6之间存在13个交换单株。继续开发标记，最终将DTH2定位在dCAPS标记dcaps3和dcaps5之间的37.6Kb的范围内，存在4个交换单株，和CAPS标记caps1共分离(图2A)。这些标记的序列信息见表3。

表3.用于本发明精细定位的引物

利用日本水稻注释计划数据库(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)和美国密西根州立大学水稻基因组注释计划(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，发现在37.6Kb的区间内存在9个候选基因，其中ORF5编码一个CCT/B-box锌指蛋白，和拟南芥开花基因COL9氨基酸同源率达到50.95％，都属于CONSTANS-Like转录因子基因家族，该基因家族成员广泛参与植物光周期调控的开花路径(Griffiths S.et al.(2003)PlantPhysiol 131：1855-1867)。因此ORF5(LOC Os02g49230)被首选为DTH2的候选基因。

实施例3 DTH2的转基因功能互补实验

1.基因组全长互补载体的构建

根据预测的候选基因序列，以日本晴(英文名Nipponbare，一个完成全基因组测序的水稻品种)序列为模板，设计引物，对源自Asominori中的DTH2基因组进行测序，发现在该区段它们的序列一致。于是以日本晴BAC克隆OsJNBa33B21(购自中国科学院国家基因研究中心)为模板，扩增DTH2全基因组(引物见表4)获得了一个7867bp的DNA片段。使用同源重组试剂盒(http://bioinfo.clontech.com/infusion/，购自日本Takara公司)把该片段重组至pCAMBIA1305.1(来自澳大利亚的一个公开报道和使用的质粒，图3)的Sma I(购自加拿大Fermentas公司)位点。

2.农杆菌介导的水稻遗传转化

将得到的测序正确的重组质粒，通过农杆菌菌株EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)介导的水稻遗传转化体系，转入隐性基因型亲本NIL(DTH2)的愈伤中。经过愈伤诱导，继代，预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移载，得到转基因植株。农杆菌介导的粳稻遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(Hiei Y.et al.，1996)，并在此基础上进行优化。具体步骤如下：

2.1 愈伤诱导

2.1.1 将成熟的NIL(DTH2)种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)对种子表面消毒15分钟；

2.1.2 用灭菌水洗种子4-5次；

2.1.3 将种子放在诱导培养基上；

2.1.4 将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1°。

2.2 愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，置于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1°。

2.3 预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，置于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1°。

2.4 农杆菌培养

在带有对应抗性选择的LB培养基上预培养农杆菌EHAi05两天，温度28°。

2.5 农杆菌侵染

2.5.1 将预培养的愈伤转移至灭好菌的三角瓶内；

2.5.2 调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

2.5.3 将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

2.5.4 转移愈伤至灭好菌的滤纸上吸干；然后置于共培养基上培养3天，温度19-20°。

2.6 愈伤洗涤和选择培养

2.6.1 用灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2.6.2 将愈伤浸泡在含400毫克/L羧苄亲霉素的灭菌水中30分钟；

2.6.3 转移愈伤至灭好菌的滤纸上吸干；

2.6.4 转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

2.7 分化

2.7.1 将抗性愈伤转移至预分化培养基上置于黑暗处培养5-7天；

2.7.2 转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26°。

2.8 生根

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26°。

2.9 移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗移栽入大田。

3.转基因植株的检测和基因功能验证

本发明进行了两次独立的转化，共获得了全长互补转基因T₀代植株85株，2009年种植于北京中国农业科学院作物科学研究所东门网室，通过PCR分子检测(前引物在插入片段上设计，后引物在载体上设计，见表4)获得阳性植株62株，抽穗期比转空载体植株显著提前(表5)。2010年在北京大田种植单拷贝的T₀代阳性植株收的种子，发现T₁代家系呈现良好的单基因分离比，阳性植株比阴性植株抽穗期显著提前(表5)。2011年在北京大田继续种植T₂代家系，发现转基因的性状稳定比NIL(DTH2)抽穗提前(图2C-D)。证明了该候选基因就是DTH2 QTL的目的基因。同时也证明了该基因可以通过遗传转化来改良水稻品种。

4.DTH2的基因结构和功能预测

通过RT-PCR技术获得了DTH2-a的全长CDS，共1224bp，测序发现其与日本晴的序列完全一致，序列如SEQ ID NO.2所示。通过比较全长CDS和7867bp基因组序列得到了DTH2基因的结构，编码区在基因组中的序列为2775bp，包括4个外显子和3个内含子(图2B)。

水稻基因组注释计划(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)预测该基因编码一个CCT/B-box锌指蛋白，属于CONSTANS-Like转录因子基因家族，由407个氨基酸组成。根据InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)对DTH2蛋白结构进行预测，发现5-47，48-90，350-392个氨基酸分别编码一个B-box结构域，一个锌指结构域和一个CCT结构域。利用植物转录因子数据库(http://pIntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/)发现DTH2在拟南芥和水稻中分别存在17个同源基因。它们中多个已报道和植物开花调控相关(Yano，M.et al.(2000)Plant Cell 12，2473-2483；Lee YS，et al.(2010)Plant J63：18-30；Datta S.et al.(2006)The Plant Cell 18：70-84；Kim SK，et al.(2008)Planta 228：355-365；Cheng XF.etal.(2006)Plant J 43：758-768)。

表4.用于本发明DTH2互补载体构建的引物

表5.本发明转基因组全长T₀代和T₁代转基因结果

^a转基因植株和空载体之间的双尾t检测

(+)与(-)代表转基因阳性和阴性植株，^b威尔科克森符号秩检验

实施例4 DTH2的转基因干扰实验

1.转基因干扰载体的构建

通过引物(表6)使用Warthmann N等报道的方法(Warthmann N.et al.，(2008)PLoS One 3(3)：e1289)扩增一段包含DTH2人工miRNA序列的261bp片段，通过同源重组的方法把该片段重组至pCAMBIA2300(来自澳大利亚的一个公开报道和使用的质粒)的Sma I(购自加拿大Fermentas公司)位点。

2.农杆菌介导的水稻遗传转化

将得到的序列正确的重组质粒通过农杆菌菌株EHA105介导的水稻遗传转化体系转入显性基因型亲本Asominori的愈伤中。具体的转化方法同基因组全长互补载体的转化。

3.转基因植株的检测和基因功能验证

通过转基因获得了4株T₀代转基因阳性植株(转基因检测前引物在载体上设计，后引物在插入片段上设计，见表6)，2009年种植于海南三亚中国农业科学院作物科学研究所南滨农场进行繁种。收获后2010年种植T₁代转基因植株于光照培养箱LD条件下，发现T₁代家系呈现良好的单基因分离比，阳性植株比阴性植株抽穗期显著延迟(表7)。2011年在北京中国农业科学院作物科学研究所东门网室种植T₂代家系，发现转基因的性状稳定比Asominori抽穗延迟(图2C-D)。进一步证明了该基因就是目的基因。

表6.用于本发明DTH2干扰载体构建的引物

表7.本发明转DTH2干扰T₁代转基因结果

(+)与(-)代表转基因阳性和阴性植株

^a威尔科克森符号秩检验

实施例5 DTH2在早期人类水稻改良中的应用

1.栽培稻和野生稻核心种质中DTH2的等位类型

为进一步确定DTH2的变异类型，我们对127份代表性的栽培和野生稻进行了该基因的全长测序，测序样品包括栽培稻两个亚种79份(33份indica和46份japonica)和覆盖整个天然分布区的野生稻47份(34份O.rufipogon和13份O.nivara)以及一个O.barthii作为外类群。通过对DTH2的编码区在基因组中的序列(2275bp)进行测序分析，共发现5个变异位点，分别位于第25、169、461、1645和1721个碱基(图4A)。其中169变异位点只存在于5份野生稻中(频率为4％)，1645变异位点没有引起氨基酸变异(为同义突变)，所以这2个位点上的变异对该基因功能变化没有贡献。根据剩余3个变异位点把127份栽培和野生稻分成5种单倍型，Hap1(即DTH2-i)，Hap2，Hap3，Hap4和Hap5(即DTH2-a)(图4A)。

2.自然界中现有DTH2等位类型的功能分析

随后我们对上述5种自然界中存在的等位类型进行转基因实验来研究它们的功能差异，根据不同单倍型设计引物(表8)构建了5个相应的定点突变载体。具体构建方法为：先用NCO I(购自加拿大Fermentas公司)酶切DTH2全长转基因互补载体，然后用T4 DNA连接酶(购自美国NEB公司)使载体自连，之后在引物上引入突变位点以DTH2-i为模板进行PCR扩增，产生相应的突变片段后同源重组至BstE II(购自加拿大Fermentas公司)位点，然后用T4DNA连接酶使载体自连产生相应构造。将得到的序列正确的重组质粒通过农杆菌菌株EHA105介导的水稻遗传转化体系转入隐性基因型亲本NIL(DTH2)的愈伤中。具体的转化方法同基因组全长互补载体的转化。

通过转基因分别得到了36、28、27、24和22株Hap1-Hap5的转基因阳性植株(转基因检测引物见表8)，2011年种植于北京中国农业科学院作物科学研究所院内网室。我们发现Hap2和Hap1的抽穗期相近；Hap3和Hap4的抽穗期相近，早于Hap1和Hap2；Hap5的抽穗期比前4个都早(图4C)。证明Hap2没有功能，Hap3、Hap4和Hap5均有功能。

3.DTH2不同等位类型在早期人类水稻改良中的应用

我们对这3个单倍型在栽培稻和野生稻中的分布频率进行了分析发现：Hap3和Hap4在中国野生稻和栽培稻中均存在，而Hap5只在温带栽培稻(temperate japonica)中存在，并且Hap5由Hap4发生一个碱基改变而来(图4D)。我们对Hap5的地理分布分析，进一步发现Hap5的所有样品均分布于北纬35度以北(自然长日照)(图4B)，而且通过上述的功能试验我们也证明Hap5具有很强的在长日条件下促进水稻开花的能力，故推测Hap5是早期人类筛选固定下来的，对增强栽培稻适应高纬度的能力从而扩大栽培稻北部分布区具有重要的作用。

表8.用于本发明DTH2驯化分析的引物

Claims (1)

1.SEQ ID NO.1所示的控制水稻抽穗期基因DTH2在获得抽穗期提前的水稻品种中的应用。

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