CN102586154A - 兼具脱氮除磷功能的根癌土壤杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株兼具异养硝化-好氧反硝化与除磷功能的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens在生活污水处理中的应用。该菌株可以利用有机碳为唯一碳源，氨氮为唯一氮源进行新陈代谢，通过异养硝化-好氧反硝化作用把氨氮直接转为气体产物，达到脱氮的目的；该菌株也能以硝酸盐氮为唯一氮源，通过好氧反硝化作用将硝酸盐氮转化为气体产物；还能在好氧条件下将无机磷摄入体内转化为自身组分进而实现去除污水中磷元素的目的。将该菌株应用于生活污水的处理，可实现单一好氧条件下氮磷的同步去除，较好解决了传统废水处理中生物脱氮除磷需要采取厌氧释磷、缺氧反硝化、好氧硝化吸磷分段处理的难题，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)及其在生活污水处理中的应用。该菌株具有异养硝化-好氧反硝化的功能，可以在同步硝化反硝化脱氮的过程中，同时完成生活污水中含磷污染物的去除，从而达到生活污水同步生物脱氮除磷的目的。
背景技术
随着社会的进步和经济的发展，我国各类水体富营养化污染日益严重，蓝藻赤潮问题频发，对水体安全和人体健康造成了巨大的损害。氮、磷等营养物质过剩是引发水体富营养化的根本原因，当水体中N浓度＞0.2mg/l，P浓度＞0.02mg/l时就会发生富营养化现象。生活污水是氮、磷等营养物质的最大排放源；为此，我国一直致力于开发各种各样的生活污水脱氮除磷工艺以从根本上防止富营养化问题的发生。
生物脱氮技术是目前应用最广的污水脱氮技术，基本原理是在微生物的作用下将污水中的有机氮和氨态氮转化为N2的过程。其中包括硝化和反硝化两个反应过程。硝化反应是由一群自养好氧微生物完成的，它分为两个阶段，分别由亚硝酸菌和硝酸菌两种菌完成。第一步是由亚硝酸菌将NH4 +氧化为NO2 -，第二步是由硝酸菌将NO2 -进一步氧化为NO3 -。反硝化反应是由一群异养型兼性厌氧微生物完成的，是指在无氧或低氧条件下，反硝化细菌将NO2 -和NO3 -还原为氮气的过程。由上述基本原理可以看出，生物脱氮过程本身就存在着矛盾：硝化反应需要较长的污泥龄和好氧条件，大量有机物存在时会造成硝化细菌的流失；而反硝化细菌则需要较短的污泥龄和缺氧条件，高度依赖有机物为其脱氮过程提供电子供体。因硝化细菌和反硝化细菌生理机制的差异导致了基于该理论的污水脱氮技术工艺冗长，能耗大，占地面积大，且对环境变化非常敏感，脱氮效率不佳。
污水除磷的方法有化学除磷、生物除磷以及生化除磷等。化学除磷的基本原理是通过投加化学药剂形成不溶性磷酸盐沉淀物，最终通过固液分离的方法将磷从污水中去除，有石灰沉淀法及金属盐沉淀法。化学除磷操作简单、除磷效果好、抗冲击负荷能力强；但是需要投加大量的化学药剂，处理费用较高，并且会产生二次污染。生物除磷工艺是目前较为经济的除磷方法，其基本原理是聚磷菌(Poly-phosphate-Accumulatuing Organisms，PAOs)的吸/释磷过程：在厌氧条件下，PAOs分解细胞聚磷酸盐的同时产生ATP，并利用ATP将环境中的挥发性脂肪酸等小分子有机物摄入胞内，将其以PHB(聚-β羟基丁酸盐)及糖原等有机颗粒的形式存在于细胞内，同时将聚磷酸盐水解生成的正磷酸盐(PO4 3-)排出细胞外；在好氧条件下，PAOs以氧气为电子受体，利用PHB代谢释放的能量，从污水中吸收超过其生长所需要的磷并以聚磷酸盐的形式贮存在细胞体内。通过排泥的方式将被细菌过量摄取的磷随剩余污泥排出系统即可实现除磷的目的。
生物脱氮除磷发生机制的差异导致了这两个过程本身就是一个矛盾统一体，产生矛盾的根本原因是不同功能的微生物所需要的最佳生长条件不同。硝化需要长泥龄的硝化细菌和好氧条件，反硝化需要短泥龄的反硝化菌和缺氧条件，释磷需要短泥龄的聚磷菌和厌氧条件，而吸磷则需要好氧条件。此外，反硝化菌和聚磷菌之间还存在着因生活污水中碳源不足而产生的竞争关系。生物脱氮除磷工艺的发展也主要是围绕着在同一污水处理系统中实现脱氮与除磷的矛盾展开的。因这些固有矛盾的存在，造成了我国多数污水处理厂运行费用高、脱氮除磷效果不稳定、达标率较低，开发节能高效的城镇污水处理工艺已迫在眉睫。
近年来，生物脱氮除磷在技术与理论方面也有了新的进展和突破。在生物脱氮技术上，开发出了SHARON、CANON、OLAND和ANNAMOX等新型脱氮工艺，这些工艺在某种程度上解决了脱氮过程对碳源的依赖，但仍未摆脱好氧厌氧结合的两段式生物脱氮的限制。异氧硝化-好氧反硝化菌能够在单一好氧条件下完成污水中氮的去除，因此成为了近年来生物脱氮领域的研究热点，经过众多研究者的努力，不断开发出具有异氧硝化-好氧反硝化功能的微生物，如Pseudomonas Spp、Alcaligenes faecalis、Agrobacterium sp和Comamonassp.。在生物除磷理论上，发现了特殊的反硝化聚磷菌(DPB)，其基本原理为在厌氧阶段，DPB充分利用环境中的挥发性脂肪酸等小分子有机物进行大量繁殖，同时水解细胞内的聚磷酸盐将产生的无机磷酸盐排出细胞外，并利用此过程产生的ATP合成PHB贮存体内；在缺氧阶段，DPB以硝酸盐氮作为氧化PHB的电子受体，降解PHB所产生的能量一部分用于维持生命活动，一部分则用于过量摄取水中无机磷酸盐并以聚合磷酸盐的形式储存于细胞体内，同时将硝酸盐氮还原为氮气。相比传统除磷理论，反硝化除磷过程能够节省一定的COD与曝气量，进而减少了污泥产量。然而，无论是PAOs理论还是DPB理论，都需要好氧/缺氧/厌氧交替的环境来提供微生物的生长条件。无论是异氧硝化-好氧反硝化生物脱氮理论还是PAOs/DPB生物除磷理论，都是建立在单一的脱氮或除磷功能研究基础之上，至今没有研究表明一种微生物同时具有异氧硝化-好氧反硝化脱氮和除磷的功能。
本申请的发明人在垃圾渗滤液处理系统中分离出一株土壤杆菌(Agrobacterium sp.，CN200910083014.3)，发现其具有异养硝化-好氧反硝化的能力；发明人进一步发现这种细菌在单一好氧条件下兼有除磷的能力。利用这类具有特殊性质的细菌的生理特性和代谢机理，基于硝化过程可以是异养细菌的生理行为，而反硝化和除磷过程可以在好氧条件下进行，使得可以在同一好氧环境下完成脱氮除磷，能够较好的克服上述提到的传统工艺中存在的矛盾问题，由此完成了本发明。
发明内容
本发明突破了传统生物脱氮除磷理论的限制，提供了一种具有天然生长优势的高效的具有异养硝化-好氧反硝化和好氧摄磷能力的菌株及其在生活污水处理中的应用，克服了现有方法中存在的硝化、反硝化、吸磷和释磷四个过程不能统一的瓶颈问题。
本发明的核心在于，基于利用异养细菌，而不是自养细菌参与硝化过程；基于利用好氧细菌，而不是厌氧细菌参与反硝化过程；基于利用好氧摄磷菌，而不是聚磷菌完成除磷过程；通过利用兼具异养硝化-好氧反硝化与好氧摄磷功能的菌株根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，使得硝化、反硝化和除磷过程在同一好氧环境下完成，而不是由不同的细菌在好氧、缺氧和厌氧三种环境下分步完成，进而使得有机碳和/或无机氮和/或无机磷在该细菌的作用下被去除，由此实现了发明目的。
本发明所提供的菌株，具有以下特征：在37℃下，营养琼脂培养基上培养24h后，菌落凸起，全缘光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，大小为(1.5～0.3)μm×(0.6～1.0)μm，单个成对排列，不形成芽孢；该菌株的16S rRNA基因序列特征：其16S rRNA具有如序列表示所示的核苷酸序列，序列长度为1418bp，在Genbank中的登录号为FJ639330。
根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列在Genbank中的检索结果，鉴定该菌株为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。
本发明所述的根癌土壤杆菌，于2008年3月19日，在北京保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.2962。
本发明所提供的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)能够以有机物为电子受体，NH4 +为电子供体，将NH4 +氧化为NO2 -或NO3 -；能够在好氧的条件下，以有机物为电子供体，NO2 -或NO3 -为电子受体，将其还原为氮气；还能够在好氧条件下，将无机磷摄入体内转化为自身组分进而实现去除污水中磷元素的目的。
本发明提供一种用于生物脱氮除磷的微生物菌剂，其活性成分为所述的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，该菌剂可用于污水处理。
本发明提供的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)可以与其它微生物(如芽孢杆菌、假单细胞菌、放线菌等)和活性污泥进行混合，并以其为成份形成具有同时去除P、C、N功能的混合微生物制品，命名为PCN系列微生物。PCN系列微生物的制备方法为：将根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)按照常规实验方法发酵后离心，在低温下烘干，按重量比1∶10-1∶80与粮食秸秆的粉末进行混合。
本发明指出的兼具异养硝化-好氧反硝化与除磷功能的菌株在生活污水处理中的应用，其特点是利用PCN系列微生物对传统生活污水处理工艺中的活性污泥进行群落结构改善和性能优化，进而在传统工艺的基础上形成新型的节能高效的生物脱氮除磷技术，命名为NICH工艺。该技术只需通过一个曝气单元即可实现氨氮、总氮、总磷和COD的同步去除，能够有效解决传统工艺中存在的瓶颈问题，确保处理出水的达标排放。
以PCN系列微生物改善活性污泥结构为核心形成的NICH工艺具有突出的优势：
(1)根据兼具异养硝化-好氧反硝化与除磷功能细菌的生理特征和代谢机理，实现了好氧条件下氮磷的同步去除，解决了传统废水处理中生物脱氮除磷需要采取厌氧释磷、缺氧反硝化、好氧硝化吸磷分段处理的瓶颈问题；
(2)硝化和反硝化偶联进行，反硝化过程中产生的碱度可以很好的弥补硝化过程中产生的酸度，整个过程无需加碱调节pH；相比自养硝化细菌，异养硝化细菌的生长速率快、细胞产率高，可以有效解决自养硝化细菌增值缓慢、系统水力停留时间长的问题；
(3)脱氮和除磷同步进行，解决了反硝化菌和聚磷菌对碳源的竞争问题；
(4)采用本发明，在传统活性污泥法的二级生化处理系统，可以完成碳氮磷的同步去除，无须构建新的反应器，最大限度的简化了工艺流程，节省了设备和投资的成本，因此，具有较好的经济效益和环保效益；
(5)本发明适用于各种废水的脱氮除磷处理，应用前景广阔，具有很好的社会效益。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。本领域的普通技术人员可以理解，实施例仅仅是举例说明的目的，本发明的范围并不以具体实施方法为限，而是由权利要求的范围加以限定。
附图说明
附图1根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)对磷酸盐的降解曲线
附图2根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)对氮素和磷酸盐的降解曲线
附图3中试装置工艺流程图
附图4中试反应器与广东某污水处理厂总氮去除效果对比
附图5中试反应器与广东某污水处理厂总磷去除效果对比
附图6中试反应器与广东某污水处理厂氨氮去除效果对比
附图7中试反应器与广东某污水处理厂COD去除效果对比
具体实施方式
实施例中各种污染物的监测分析方法参考《水和废水监测分析方法》(第四版，中国环境科学出版社，2002)。温度和溶解氧通过便携式溶氧测定仪(YSI550A，USA)进行测定。污泥浓度(MLSS)和挥发性悬浮固体浓度(MLVSS)根据重量法测定。
实施例中使用的各种单位，统一采用国家标准。
实施实例1：根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens在好氧条件下的除磷能力测定
将根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株(于2008年3月19日，在北京保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.2962，下同)接种于1L的LB培养基中，防止杂菌的侵入并保持菌体的生长活力，进行富集培养。将培养得到的菌液离心，用无菌水洗涤三次，制成光密度(OD600)为1-2的菌悬液。
取5mL上述菌悬液加入两个含有120mL测试培养基(每L含5g丁二酸钠，0.1911gNH4Cl，0.044g KH2PO4，0.2g CaCl2·2H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.006g FeSO4·7H2O，pH7.0～7.5)的锥形瓶中，用9层纱布封口，30℃ 150rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、24h和36h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心5min，取上清液测定磷酸根的浓度。
实验结果见附图1。由图可见，菌株根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)在前12h处于迟缓期，生长较为缓慢，培养基中磷酸盐浓度几乎不变；从12h开始，菌株进入对数生长期，菌体含量快速增长，与此同时培养基中的磷酸盐浓度呈直线下降趋势，并在之后的6h内降至零左右，去除效率达到100％。由此说明，在单一好氧条件下，本发明的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株即可完成对磷酸盐的高效去除。
实施实例2：根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens最佳除磷条件的确定
采用摇瓶实验的模式，依据正交实验原理，以pH值、摇床培养温度、摇床转速和碳氮比四个因素为影响因子，建立了4因素3水平共计9次正交试验以确定菌株根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens的最佳除磷条件。实验中选用的培养基除去丁二酸钠含量根据需要改变外，其余组分和浓度一律与实施例1相同。
正交实验设计及结果见表1所示。
表1正交实验设计及结果
通过对正交实验的结果分析发现四个因子对菌株除磷效果的影响强弱为：pH＞转速＞碳氮比＞温度。菌株的最佳除磷效果组合为A2B2C1D3，即pH为8，温度为30℃，摇床转速为100r/min，碳氮比为12。
实施实例3：根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens的同步脱氮除磷能力测定
将根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株接种于1L的LB培养基中，防止杂菌的侵入并保持菌体的生长活力，进行富集培养。将培养得到的菌液离心，用无菌水洗涤三次，制成光密度(OD600)为1-2的菌悬液。
取5mL上述菌悬液加入两个含有120mL测试培养基(每L含5g丁二酸钠，0.1911gNH4Cl，0.044g KH2PO4，0.2g CaCl2·2H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.006g FeSO4·7H2O，pH7.0～7.5)的锥形瓶中，用9层纱布封口，30℃ 150rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、24h、36h、48h和60h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心5min，取上清液测定各种含氮化合物和磷酸根的浓度。
实验结果见附图2。如图所示，菌株在前10h处于迟缓期，生长较为缓慢，培养基中氨氮和磷酸盐浓度基本保持不变；在10～24h内，菌株进入对数生长期，菌体含量快速增长，与此同时氨氮和磷酸盐浓度也呈同步快速下降趋势，去除率分别为99.3％和70.8％；在24～48h内，菌株进入内源呼吸期，磷酸盐浓度继续降低，48h时去除率达到最大，浓度值从最初的8.38mg/L下降至1.01mg/L；在48～60h内，菌株进入衰亡期，OD600呈下降趋势，氨氮和磷酸盐浓度出现了一定的反弹，可能与菌体死亡后的二次释放有关。
在60h的实验周期内，氨氮的最大去除率达99.3％，并且几乎没有发现亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的积累，说明发生了异养硝化-好氧反硝化现象。此外，磷酸盐的最大去除率达87.9％，说明菌株在具有异养硝化-好氧反硝化能力的同时兼有较强的除磷功能。
实施实例4：根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens用于处理实际生活污水
(1)试验装置
本实施例中采用的污水处理装置为中试规模的完全混合式反应器，构筑物包括曝气池和沉淀池(见附图3)，日处理量31m3。曝气池尺寸为2400×2000mm×1400mm，有效容积6.48m3，水力停留时间为4.5h；沉淀池尺寸为2400×1000mm×1400mm，有效容积2.96m3，水力停留时间为1.5h。进水从曝气池一端潜流进水，出水由另一端溢流进入沉淀池。
(2)试验用水
实验以广东某污水处理厂沉砂池出水为进水，主要水质指标平均值如下：进水COD浓度240mg/L，氨氮浓度23.5mg/L，TN浓度26.11mg/L，TP浓度4.44mg/L，pH值在7.0～7.5之间。
(3)实施方式
接种活性污泥取自该厂曝气池的回流污泥，其典型特征如下：SV30值为8～15ml，MLSS值为1.7～2.4g/L，SVI值为40～80，沉降性较好，所取直接装载于中试设备曝气池。
首先，利用PCN系列微生物对活性污泥结构进行改善(本实验中采用的是一种包含了根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens的具有同时去除P、C、N功能的混合微生物制品，命名为PCN系列微生物)。具体方式为：在曝气池中，将PCN系列微生物与活性污泥充分混合，闷曝3天，使PCN系列微生物有充足的时间对活性污泥性能进行改善。
其次，采用连续进水的方式运行，每天分别在9:00、12:00、15:00、18:00取沉淀池出水并分别测定各指标的浓度。同时以该污水处理厂AB工艺的B段曝气池作为空白参照进行对比实验。AB工艺是由德国Bohuke教授首先开发，分为A段和B段，其中A段为吸附段，B段为生物氧化段。A段和B段拥有各自独立的污泥回流系统，因此有各自独特的微生物种群，A段以生物絮凝吸附作用为主，生物主要为短世代的细菌群落，B段与常规的活性污泥法相似，生物主要为世代时间较长的细菌群落。
中试设备的具体运行参数如表2所示。
表2中试装置运行参数表
(4)实验结论
实验期间该处理厂AB工艺的B段沉淀池出水以及中试设备沉淀池出水各项指标如图4至图7所示。结果表明，实验期间中试设备的各项出水指标均优于该水厂AB工艺出水，这说明，本申请所述的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens可以用于生活污水的处理，可以在处理的同时实现单一好氧环境下对COD、氨氮、总氮及总磷的去除，同时利用以根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens为活性成分的生物制剂可以改善曝气池中活性污泥的群落结构，基于PCN微生物的NICH工艺发挥了较好的作用，实现了单一好氧环境下对COD、氨氮、总氮及总磷的去除，使出水各项指标稳定达到了国家一级A标准的要求。
实践证明，本发明投资少，无需增加土建投资和相应的设备设施；运行成本低(仅在进水碳源不足时需要补加碳源)；占地面积少，因为无需增加土建，因此不需新占土地；改造周期短，只需完成微生物对活性污泥的改善过程；运行管理比较简单；工艺运行可靠稳定。
Claims (9)
1.一种兼具异养硝化-好氧反硝化和除磷功能的菌株在生活污水处理中的应用，其特征是选用根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens对生活污水进行处理，实现同步脱氮和除磷的目标。
2.权利要求1所述的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens，其特征在于：该土壤杆菌菌株的16S rRNA基因具有如序列表SEQ ID：1所示的核苷酸序列，序列长度为1418bp，在Genbank中的登录号为FJ639330，所述土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens的保藏号为CGMCC No.2962。
3.权利要求1所述的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens，其特征在于：在30-40℃下，营养琼脂培养基上培养16-32h后，菌落凸起，全缘光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，大小为(1.5～0.3)μm×(0.6～1.0)μm，单个成对排列，不形成芽孢。
4.权利要求1所述的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens，其特征在于：能够以有机物为电子受体，NH4 +为电子供体，将NH4 +氧化为NO2 -或NO3 -；能够在好氧的条件下，以有机物为电子供体，NO2 -或NO3 -为电子受体，将其还原为氮气；还能够在好氧条件下，将无机磷摄入体内转化为自身组分进而实现去除污水中磷元素的目的。
5.权利要求1所述的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens的应用，其特征在于：其所述的污水的碳氮比范围为4-12，优选为8-12。
6.权利要求1所述的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens的应用，其特征在于：其所述的污水的温度范围为20-40℃，优选为20-30℃。
7.权利要求1所述的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens的应用，其特征在于：其所述的污水的pH范围为6.5-9.5，优选为7-8。
8.权利要求1所述的应用，其特征是利用以根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens为成份的PCN系列微生物对生活污水处理工艺中的活性污泥进行群落结构改善，并在传统工艺的基础上形成NICH工艺，进而完成对生活污水中的氮磷污染物的去除。
9.权利要求8所述的NICH工艺，其特征是可在同一好氧环境下完成硝化、反硝化和除磷过程，进而实现氨氮、总氮及总磷的同时去除。
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