CN102584809A - 胺基噻唑烷酮化合物及其制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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CN102584809A CN2011100088466A CN201110008846A CN102584809A CN 102584809 A CN102584809 A CN 102584809A CN 2011100088466 A CN2011100088466 A CN 2011100088466A CN 201110008846 A CN201110008846 A CN 201110008846A CN 102584809 A CN102584809 A CN 102584809A
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Abstract

本发明提供了胺基噻唑烷酮化合物，如式I所示：
Figure DSA00000419569400011
其中A1为芳基或杂芳基；A2为苯环或者取代的苯环、萘环或者取代的萘环、吡啶环(包括2-，3-，4-吡啶)或者取代的吡啶环；R1、R2、R3、R4、R5和R6各自为氢、卤素、羟基、氰基、氨基或硝基。或为C1-C6烷基或C1-C6烷氧基等；R7和R8各自为氢、C1-C6烷基或C3-C6环烷基。本发明所述式I的化合物包括其水合物、溶剂合物、立体异构体，N-氧化物和盐、以及其各种存在的晶形。经生物活性测定本发明式I化合物可抑制PLK1体外和体内的活性，可用于制备抗肿瘤药物，本发明提供了式I化合物制备方法。

Description

胺基噻唑烷酮化合物及其制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及药物化学，具体涉及胺基噻唑烷酮化合物及其制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
Polo样激酶(Polo like kinase，Plk)属于丝氨酸苏氨酸激酶家族，它们存在于从酵母到哺乳动物的各种真核生物。在哺乳动物中Polo样激酶包括4种蛋白，Plk1、Plk2、Plk3和Plk4，其中Plk1蛋白执行着Polo、Cdc5和Plo3所具有的大部分功能(Barr，Sillje et al 2004 Nat.Rev.Mol.Cell Beol.5，429-440)。人类Plk1基因于1994年由Golsteyn等最先克隆报道，定位于16p12，mRNA长约2.3kb，编码的蛋白质分子量约为68kD。过去10多年的广泛研究表明，Plk1在许多恶性肿瘤中存在过量表达，与肿瘤的发生、生物学行为及预后有关。Plk1促肿瘤发生的作用与它在细胞周期及监测点信号通路中发挥的重要功能密切相关。Plk1对不同细胞周期监测点的精密调控作用确保了细胞周期事件(如DNA修复、双极纺锤体的形成、染色体的分离及有丝分裂的退出)按照严格的时间和顺序正常进行(Takaki，Trenz et al 2008Curr.Opin.Cell Biol.20：650-660)。
细胞有丝分裂过程是一个复杂而又十分精确的生命过程，如果遗传物质分配出现差错，最终将导致细胞死亡，Plk1在对细胞周期的调控过程中发挥着重要作用(Petronczki，Lenart et al 2008Dev.Cell 2008，14，646-659)。Plk1整体结构包括N末端激酶结构域、C末端PBD结构域(Polo Box结构域)以及中间连接区域。Plk1的N末端为丝氨酸苏氨酸激酶结构域，含有1个T2环结构，其中T210可被磷酸化，并因此而具有激酶活性。将210位苏氨酸突变为天冬氨酸，可模拟其磷酸化状态(Jang，Ma et al 2002Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，1984-1989)。
Plk1在G2/M期转换的过程中，Thr210磷酸化，激酶活性被激活(Lowery，Lim et al 2005 Oncogene 24，248-259)，进而调节多种下游底物，如Cdc25、cyclin B、Wee1和Myt1(van Vugt and Medema 2005，Oncogene 24，2844-2859)。此外，Plk1在中心体成熟和分离过程中发挥重要作用，影响ninein like protein(Nlp)和Kizuna等中心体相关蛋白活性(Casenghi，Meraldi et al.2003Dev.Cell 5，113-25；Oshimori，Ohsugi et al.2006Nature Cell Biology 8，1095-1101)。在分裂前中期，Plk1定位在动粒上，与微管和动粒的粘附有关(Lenart，Petronczki et al.2007Dev cell.2008，14，646-659)。很多纺锤体结构监测点相关蛋白都是Plk1的底物，如Mad3、Bub1和PICH(Baumann，Korner et al.2007，Cell，Volume 128，Issue 1，101-114)，Plk1通过作用于这些底物，在微管结构受损后启动纺锤体监测机制，从而保证有丝分裂的正常进行。
Plk1在细胞周期及周期监测途径中发挥着重要功能，Plk1异常会引起细胞周期异常，监测点丧失，最终导致细胞的遗传物质不能正确分配，部分细胞死亡，也增加了细胞发生癌变的几率。Plk1在多种肿瘤细胞中高表达，且抑制Plk1在肿瘤组织中的异常活性，可以诱使癌细胞进入凋亡程序，这为其作为癌症治疗的潜在靶标提供了理论依据。例如，用合成的反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸链ASODN转染人结肠癌细胞SW480，能显著抑制Plk1基因及蛋白表达，有效阻止肿瘤细胞的生长增殖，用Plk1 siRNA转染人类肿瘤细胞，导致细胞双极纺锤体形成异常，细胞生长受到抑制及产生细胞凋亡，而且Plk1siRNA对于正常细胞并无显著影响(Guan，Tapang et al.2005Cancer Res.65：2698-2704)。从蛋白水平抑制Plk1，也可以达到周期阻滞效应(Lane and Nigg 1996J.Cell Biol.135：1701-1713.)。但至今尚无有效抑制Plk1的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计PLK1抑制剂。用于制备治疗多种肿瘤疾病的药物。
本发明提供了胺基噻唑烷酮化合物，如式I所示：
Figure BSA00000419569600031
其中
A1为芳基或杂芳基；
A2为苯环或者取代的苯环、萘环或者取代的萘环、吡啶环(包括2-，3-，4-吡啶)或者取代的吡啶环；
R1、R2、R3、R4、R5、和R6各自为氢、卤素、羟基、氰基、氨基或硝基。或为C1-C6烷基或C1-C6烷氧基，其任选地在一个或多个位置以相同或不同的方式被卤素、羟基、C3-C8杂环烷基取代或者被基团-NR7R8或-CO(NR7)-Y取代，所述杂环烷基在环中包含至少一个相同或不同的选自氮、氧或硫的原子，且在环中任选地被一个或多个-(CO)或-SO2基团间断，且在环中任选地可在一个或多个位置以相同或不同的方式被氰基、卤素取代或者在一个或多个位置以相同或不同的方式被卤素取代的C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基或C1-C6-羟基烷基取代，或者被基团-COR7或-NR7R8取代，或为-R7R8、-NR7(CO)-X、-NR7(CO)-NR7-X、-COR7、-CO(NR7)-Y、-NR7(CS)NR7R8、-NR7SO2-X、-SO2-NR7R8或-SO2(NR7)-Y。
R7为氢、羟基、氨基、烷基，芳基或杂芳基。
X和Y各自为C1-C6烷基、芳基或杂芳基，其任选地在一个或多个位置以相同或不同的方式被羟基、C1-C6-羟基烷氧基、C1-C6-烷氧基、C3-C6-杂环烷基取代或者被基团-NR7R8取代，所述杂环烷基在环中包含至少一个相同或不同的选自氮、氧或硫的原子，且在环中任选地可被一个或多个-(CO)-或-SO2-基团间断，且在环中任选地包含一个或多个双键，所述环本身任选地可在一个或多个位置以相同或不同的方式被氰基、卤素取代或者在一个或多个位置以相同或不同的方式被卤素取代的C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基或C1-C6-羟基烷基取代，或者被基团-COR7或-NR7R8取代。
R7和R8各自为氢、C1-C6烷基或C3-C6环烷基。
本发明所述式I的化合物包括其水合物、溶剂合物、立体异构体、N-氧化物和盐、以及其各种存在的晶形。
本发明所述“环烷基”指含有3-6个碳原子的单环的饱和碳环基团，该术语包括，例如，环丙基、环丁基、环戊基和环己基。“芳基”指单环、二环、或三环的碳环芳香基团，并包括含有两个通过共价键直接连接的单环碳环芳香环的基团。这种基团的例子有苯基、联苯基和萘基。“杂芳基”指含有一个或多个选自S、N或O的杂原子的单环、二环或三环芳香基团，并包括含有通过共价键直接相连的两个此类单环或者一个此类单环和一个单环芳基环的基团。这种基团的例子有噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吡咯基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噻唑基、苯并异噻唑基、吡唑基、噁唑基、苯并噁唑基、异噁唑基、苯并异噁唑基、异噻唑基、三唑基、苯并三唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吲哚基或吲唑基。
本发明所述“盐“包括碱加成盐、酸加成盐和季盐。对于酸性的本发明的化合物(I)可与碱、有机碱形成盐，包括药学上可接受的盐，所述碱例如碱金属的氢氧化物如氢氧化钠或氢氧化钾；碱土金属的氢氧化物如氢氧化钙、氢氧化钡或氢氧化镁；所述有机碱例如N-甲基-D-葡糖胺、胆碱三(羟甲基)氨基-甲烷、L-精氨酸、L-赖氨酸、N-乙基哌啶、二苄基胺等。对于碱性的本发明的化合物(I)可与无机酸和有机酸形成盐，包括药学上可接受的盐，所述无机酸如盐酸或氢溴酸、硫酸、硝酸或磷酸等，所述有机酸例如乙酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苹果酸、水杨酸、柠檬酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、苯甲酸、苯磺酸、谷氨酸、乳酸或扁桃酸等。
本发明提供的胺基噻唑烷酮化合物包括式Ia和Ib的化合物。
其中R5和R6各自为氢、卤素、羟基、氰基、氨基或硝基；或C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基，其任选地在一个或多个位置以相同或不同的方式被卤素、羟基或C1-C6烷基取代，或为NR7R8、CO(OR7)、CO(NR7R8)或SO2(NR7R8)。R7和R8各自为氢、C1-C6烷基或C3-C6环烷基。
本发明的另一目的是提供了所述胺基噻唑烷酮化合物的制备方法，该方法包括下列步骤：
在下列使用的缩写：
g        克
mg       毫克
mmol     毫摩尔
℃       摄氏度
DMF      N，N-二甲基甲酰胺
NMP      N-甲基吡咯烷酮
Et3N     三乙胺
DIPEA    二异丙基乙基胺
EA       乙酸乙酯
MeOH     甲醇
步骤a：采用2-胺基噻唑酮为原料与芳基甲醛或者取代的芳基甲醛经Knoevenagel condensation反应制备2-胺基-5-(芳基亚甲基)-4(5H)-噻唑酮；2-胺基噻唑酮与芳基甲醛或者取代的芳基甲醛的摩尔比为1∶1.5，反应温度为100℃-110℃，反应时间4-6小时。反应溶剂为醋酸。反应过程中使用的碱可以为氨基酸类或者哌啶等，优选为胺基酸类，碱与2-胺基噻唑酮的摩尔比为0.7∶1。
步骤b：步骤a得到的2-胺基-5-(3-芳基亚甲基)-4(5H)-噻唑酮与取代的苯磺酰氯在碱性条件下反应，得到2-(取代苯磺酰基)胺基-5-(芳基亚甲基)-4(5H)-噻唑酮。反应溶剂为DMF或NMP等。反应过程中使用的碱为Et3N、吡啶或者DIPEA等，优选为DIPEA。2-胺基-5-(3-芳基亚甲基)-4(5H)-噻唑酮，取代的苯磺酰氯和反应过程中使用的碱的摩尔比为1∶1.2∶3。反应温度为25℃-30℃，反应时间10-16小时。
本发明的又一目的是提供了所述胺基噻唑烷酮化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明化合物对癌细胞增殖抑制作用是基于抑制Plk1的激酶活性，从而造成阻止细胞有丝分裂周期中的G2/M期细胞完成正常的有丝分裂的可能性，进而促使癌细胞走向程序性凋亡。细胞周期的G2/M期是通过与有丝分裂调节有关的特定激酶启动的，抑制某些特定的激酶可以影响细胞的分裂进程。
本发明化合物可抑制PLK1体外和体内的活性。
本发明化合物可用于治疗血癌和实体肿瘤。
本发明所述药物为由化合物I、或其药学上可接受的盐、N-氧化物、立体异构体、水合物或溶剂合物与药用辅料按照常规方法制成的片剂、胶囊、粉末、颗粒、锭剂、液体、凝胶剂或注射剂。
本发明涉及的化合物可被制成通过任何与其药代动力学特性一致的任何途径给予。并制成任何药学上可以接受的给药形式，如血液给药、口服给药、肠内、非肠道和口服给药等等。可口服给予的组合物的形式可以是片剂、胶囊、粉末、颗粒、锭剂、液体或凝胶制品如口服、局部或无菌肠胃外溶液或悬浮液。供口服给药的片剂或胶囊可采用单位剂型，并可含有常规赋形剂，如粘合剂，如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄耄胶或聚乙烯吡咯烷酮；填料，如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；润滑剂，如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；崩解剂，如马铃薯淀粉；润湿剂如月桂基硫酸钠。可按照常规制药实践中熟知的方法将片剂包衣。口服液体制剂的形式可以是，例如，水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或者可呈现为在使用前用水或其它合适载体重建的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，如悬浮剂，例如山梨糖醇、糖浆、家肌纤维素、葡萄糖浆、明胶、氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、去水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(可包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、油性酯如甘油、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，需要的话还可含有常规的调味剂或着色剂。以及各种注射剂给药形式，冻干、粉针、针剂、输液、微蕊微针表皮给药等等。
对于非肠道给药，特别是注射溶液剂或混悬剂，尤其是活性化合物在聚羟基乙氧基化蓖麻油中的水溶液为适宜的。
作为载体系统，也可使用表面活性助剂，比如胆汁酸的盐或动物或植物磷脂，和其混合物，以及脂质体或其成分。
用于任何特定患者的具体剂量水平将取决与各种因素，其中包括采用的具体化合物的活性、年龄、体重、健康状态、性别、饮食、给药次数、给药途径、排泄率、药物组合以及接受治疗的特定疾病的严重性。最佳剂量水平和给药频率将由临床试验来确定。
本发明化合物可与许多已知的药学活性物质联合使用。例如，本发明化合物可与细胞毒剂、HDAC抑制剂、激酶抑制剂、氨基肽酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、bcl-2拮抗剂，mTor抑制剂和单克隆抗体(例如靶向生长因子受体的单克隆抗体)联合使用。优选的细胞毒剂包括例如，紫杉烷，铂，抗代谢物如5-氟尿嘧啶，拓扑异构酶抑制剂等。包含式(I)氨基酸衍生物、其立体异构体或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物或溶剂合物。本发明药物通常还包含细胞毒剂、HDAC抑制剂、激酶抑制剂、氨基肽酶抑制剂和、或单克隆抗体。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实例不是对本发明的任何限制。
在下列实施例中使用的缩写：
g         克
mg        毫克
mmol      毫摩尔
℃        摄氏度
DMF       N，N-二甲基甲酰胺
NMP       N-甲基吡咯烷酮
Et3N      三乙胺
DIPEA     二异丙基乙基胺
EA       乙酸乙酯
MeOH     甲醇
所有实施例中，化合物的1H-NMR由Bruke AM-400型核磁共振仪测定，以TMS为内标，化学位移以δ(ppm)表示；质谱用Finnign-MAT212型质谱仪测定。
柱层析所用硅胶为青岛海洋化工厂生产(薄层层析H型)，薄层层析板为烟台芝罘实验化工厂生产的HSGF 254型。
Figure BSA00000419569600081
实施例1中间体2-胺基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮的制备
室温下向13.4g(125mmol)3-吡啶甲醛和9.67g(83.36mmol)噻唑胺的60mL醋酸悬浮液中加入5.2g(58.4mmol)丙氨酸。该悬浮液在100℃下加热4小时。然后悬浮的固体经过滤后滤饼先用少量的醋酸洗涤再用水洗，真空干燥(40℃，10mmHg)得白色2-胺基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮固体(16g，收率：62.5％)。
实施例2中间体2-胺基-5-(3-(5-氟吡啶)亚甲基)-4(5H)-噻唑酮的制备方法同实施例1。使用3-(5-氟吡啶)甲醛为原料。
实施例3中间体2-胺基-5-(3-(2，4-二甲氧基吡啶)亚甲基)-4(5H)-噻唑酮的制备方法同实施例1。使用3-(2，4-二甲氧基吡啶)甲醛为原料。
实施例4中间体2-胺基-5-(4-氯苯基)亚甲基-4(5H)-噻唑酮的制备方法同实施例1。使用4-氯苯甲醛为原料。
实施例5中间体2-胺基-5-(4-三氟甲氧基苯基)亚甲基-4(5H)-噻唑酮的制备方法同实施例1。使用4-三氟甲氧基苯基甲醛为原料。
实施例6中间体2-胺基-5-(1-萘)亚甲基-4(5H)-噻唑酮的制备方法同实施例1。使用1-萘甲醛为原料。
实施例7中间体2-胺基-5-(2-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮的制备方法同实施例1。使用2-吡啶甲醛为原料。
Figure BSA00000419569600091
Figure BSA00000419569600101
Figure BSA00000419569600111
实施例8：化合物2-(3-氯苯磺酰基)胺基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮的制备
Figure BSA00000419569600112
室温(25℃)下，向2-胺基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮(200mg，0.97mmol)和3-氯苯磺酰氯的NMP(4mL)溶液中加入DIPEA(0.5mL).反应液搅拌过夜后加入水(5mL)，氯仿(5mL)萃取三次。有机层合并后，经水洗，饱和碳酸氢钠水溶液洗和饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩。所得粗经硅胶柱分离(所用洗脱机为EA∶MeOH＝10∶1)的棕色固体为2-(3-氯苯磺酰基)胺基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮(148mg，收率：18％)。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ：8.90(1H，s)，8.66(1H，d，J＝4.4Hz)，8.04(1H，d，J＝8.4Hz)，7.90-7.89(2H，m)，7.80-7.78(2H，m)，7.69-7.62(2H，m).MS(ESI)：calcd for[C15H11N303S2]-(m/z)：379.8，found：378.2.
实施例9：化合物2-(2-萘磺酰基)胺基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮的制备
Figure BSA00000419569600113
25℃下，向2-胺基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮(200mg，0.97mmol)和2-萘磺酰氯(330mg，1.46mmol)的NMP(4mL)溶液中加入DIPEA(0.5mL).反应液搅拌过夜后加入水(5mL)，氯仿(5mL)萃取三次。有机层合并后，经水洗，饱和碳酸氢钠水溶液洗和饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩。所得粗品经硅胶柱分离(所用洗脱机为EA∶MeOH＝10∶1)的棕色固体为2-(2-萘磺酰基)胺基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮(80.5mg，收率：21％)。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ：8.78(1H，s)，8.55(1H，d，J＝4.4Hz)，8.48(1H，s)，8.15(1H，d，J＝7.8Hz)，8.05-7.87(4H，m)，7.66-7.63(2H，m)，7.56-7.54(1H，m)，7.43(1H，s).MS(ESI)：calcd for[C19H13N3O3S2]-(m/z)：395.5，found：394.3.
实施例10：化合物2-(3-氯苯磺酰基)胺基-5-(3-(5-氟-吡啶)亚甲基)-4(5H)-噻唑酮的制备
Figure BSA00000419569600121
室温(25℃)下，向2-胺基-5-(3-(5-氟-吡啶)亚甲基)-4(5H)-噻唑酮(100mg，0.45mmol)和3-氯苯磺酰氯(114mg，0.53mmol)的NMP(1mL)溶液中加入DIPEA(0.28mL).反应液搅拌过夜后加入水(5mL)，氯仿(5mL)萃取三次。有机层合并后，经水洗，饱和碳酸氢钠水溶液洗和饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩。所得粗经硅胶柱分离(所用洗脱机为EA∶MeOH＝10∶1)的棕色固体为2-(3-氯苯磺酰基)胺基-5-(3-(5-氟-吡啶)亚甲基)-4(5H)-噻唑酮(61mg，收率：34％)。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ：8.78(1H，s)，8.55(1H，d，J＝4.4Hz)，8.48(1H，s)，8.15(1H，d，J＝7.8Hz)，8.05-7.87(4H，m)，7.66-7.63(2H，m)，7.56-7.54(1H，m)，7.43(1H，s).MS(ESI)：calcd for[C19H13N3O3S2]-(m/z)：395.5，found：394.3.
实施例11：化合物2-(2-萘磺酰基)胺基-5-[3-(2，6-二甲氧基吡啶)亚甲基]-4(5H)-噻唑酮的制备
Figure BSA00000419569600131
室温(25℃)下，向2-胺基-5-(3-(2，6-二甲氧基吡啶)亚甲基)-4(5H)-噻唑酮(100mg，0.33mmol)和2-萘磺酰氯(102mg，0.45mmol)的NMP(1mL)溶液中加入DIPEA(0.19mL).反应液搅拌过夜后加入水(5mL)，氯仿(5mL)萃取三次。有机层合并后，经水洗，饱和碳酸氢钠水溶液洗和饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩。所得粗经硅胶柱分离(所用洗脱机为EA∶MeOH＝10∶1)的棕色固体为2-(2-萘磺酰基)胺基-5-[3-(2，6-二甲氧基吡啶)亚甲基]-4(5H)-噻唑酮(23mg，收率：13％)。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ：7.92(1H，d，J＝8.4Hz)，7.84(1H，d，J＝8.4Hz)，7.78(1H，s)，7.69(1H，d，J＝8.4Hz)，6.65(1H，d，J＝8.4Hz)，4.01(3H，s)，3.96(3H，s).MS(ESI)：calcd for[C20H21N3O5S2]-(m/z)：447.5，found：445.9.
实施例12：化合物2-(3-氯-4-氟苯磺酰基)胺基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮的制备
室温(25℃)下，向2-胺基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮(120mg，0.59mmol)和3-氯-4-氟苯磺酰氯(175mg，0.76mmol)的NMP(3mL)溶液中加入DIPEA(0.5mL).反应液搅拌过夜后加入水(5mL)，氯仿(5mL)萃取三次。有机层合并后，经水洗，饱和碳酸氢钠水溶液洗和饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩。所得粗经硅胶柱分离(所用洗脱机为EA∶MeOH＝10∶1)的棕色固体为2-(3-氯-4-氟苯磺酰基)胺基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮(40mg，收率：17.2％)。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ：8.88(1H，s)，8.66(1H，d，J＝4.0Hz)，8.10-8.04(2H，m)，7.98-7.92(1H，m)，7.81(1H，s)，7.68-7.61(2H，m).MS(ESI)：calcd for[C19H18N4O6S2]+(m/z)：397.8，found：398.6.
实施例13：化合物2-(4-甲基苯磺酰基)胺基-3-苯基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮
Figure BSA00000419569600141
-10℃下，NaH(165.3mg，6.88mmol)加入4-甲基苯磺酰胺的DMF(8.0mL)溶液中。反应液搅拌30分钟后加入异硫氰酸苯酯(465mg，3.44mmol)。反应在0℃下搅拌2小时后0℃下溴代乙酸乙酯(574.5mg，3.44mmol)加入反应液中。搅拌3小时后反应液倒入冰水中，析出的固体过滤后得到黄色固体为2-(4-甲基苯磺酰基)胺基-3-苯基-5-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮(650mg，产率54.7％)。β-胺基丙酸(51.3mg，0.58mmol)、2-(4-甲基苯磺酰基)胺基-3-苯基-5-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮(100mg，0.288mmol)和3-吡啶甲醛的醋酸溶液在1000℃下搅拌8小时后冷却25℃.析出的固体过滤后得到黄色固体为2-(4-甲基苯磺酰基)胺基-3-苯基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮(110mg，收率：87.5％)1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.97(s，1H)，8.73(d，J＝5.6Hz，1H)，8.13(d，J＝8.0Hz，1H)，8.01(s，1H)，7.74(d，J＝8.0Hz，2H)，7.67-7.70(m，1H)，7.48-7.54(m，3H)，7.38-7.42(m，4H)，2.39(s，3H)ppm；MS：m/z＝436.3(M+，ESI+).
下述2-(取代苯磺酰基)胺基-5-(3-吡啶亚甲基)-4(5H)-噻唑酮衍生物类的制备。
实施例14-181按实施例8的方法，使用相应的取代的苯磺酰氯或吡啶磺酰氯。
实施例182和183按实施例13的方法。
Figure BSA00000419569600142
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Figure BSA00000419569600561
本发明化合物生物活性测试
对于细胞周期的深入研究，尤其是有丝分裂相关的激酶信号通路的鉴定，为癌症的治疗带来新的切入点。Polo-like丝氨酸苏氨酸激酶家族最近被作为抗癌药物的研究热点，该家族包括Plk1、Plk2、Plk3和Plk4四个激酶，其中Plk1是被研究的最为深入的成员。Plk1作为一个抗癌药物的靶点已经得到广泛的认定。与家族的其他成员相似，Plk1具有一个位于N端的调节功能区(Polo BoxDomain)和位于C端的催化功能区，在真核生物有丝分裂的多个重要步骤中起到重要调节作用，在多种肿瘤细胞系和肿瘤组织中，如乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌和喉癌中，呈现异常的过度表达。
本发明对于丝氨酸苏氨酸激酶Plk1的抑制活性是通过体外重组蛋白测得，在该测定中，化合物对于Plk1具有良好至极好的抑制作用，例如IC50＜100nM。
(1)Plk1体外重组酶活性测定
以hPLK1的cDNA为模板，上游引物P1(TAC TTC CAA TCC ATC GCC GCG AAAGAG ATC CCG GA GGT CCT AG)，下游引物P2(TTA TCC ACT TCC ATC GTT AGG AGGCCT TGA GAC GGT TGC TGG CCG A)扩增目的基因片段。PCR扩增反应条件：94℃3min；94℃30s，54℃30s，68℃2min，30个循环；68℃10min。扩增结束后1％琼脂糖凝胶电泳和溴化已锭染色法鉴定PCR产物。Ligation-independentcloning(LIC)克隆方法将PCR产物连接到表达载体pFastbac-Htb，连接产物转化感受态细胞Top10菌株，涂板后37℃过夜培养，利用菌液PCR和测序鉴定，挑选阳性克隆，并提取重组质粒，转化DH10Bac感受态细胞，37℃培养48h，蓝白斑筛选阳性克隆(白斑)进行菌液PCR鉴定，阳性结果提质粒得到重组转移载体Bacmid。重组Bacmid与转染试剂cellfectin混匀，转染sf9昆虫细胞，120h后得一代病毒储液P1。为获得高滴度的病毒以达到良好感染效果，用一代病毒感染sf9昆虫细胞得二代病毒P2，用P2按Multiplicity of Infection(MOI)＝0.5感染sf9细胞，分别于48h、72h、96h取样，SDS-PAGE电泳和WesternBlot分析重组蛋白可溶性及表达情况。用P3感染sf9昆虫细胞，分别按MOI＝0.1、1、5感染sf9昆虫细胞，并分别于感染48h、72h、96h取样，细胞离心取上清，Western Blot分析优化MOI和感染时间。Western Blot结果显示得目的蛋白在病毒感染后72h，MOI＝1时表达效果最好，按照该优化条件，将表达体系扩大到10L。4℃离心收集细胞，利用PBS(pH 7.3，140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4)洗涤细胞后，超声破碎细胞，离心后上清通过2mlNi-NTA亲和柱纯化，TEV酶切除蛋白标签，阳离子柱纯化。Bradford方法测定蛋白浓度，纯化的重组蛋白于-80℃保存。
将下述组分混合在384孔白色测试板中(Cat#6007299，PerkinElmer)：-2μl可变浓度的待测化合物(如开始为20μM，然后按1∶3梯度稀释)，溶于20％DMSO，20mM HEPES中。
-2μl的酶稀释液(酶储备液在6.54mM 2-甘油磷酸二钠，2mM L-半胱氨酸，20mM HEPES)
-6μl的底物多肽和ATP混合物(300nM的底物多肽和10μM的ATP溶解于6.54mM 2-甘油磷酸二钠，2mM L-半胱氨酸，20mM HEPES中)
反应通过加入底物多肽和ATP混合物开始，在室温下静置反应30分钟，反应通过加入5μl 60mM的EDTA终止。然后加入5μl的4x LANCE DetectionMixture(Cat：CR91-100，PerkinElmer)，静置反应1小时后置于Envision(PerkinElmer)上读数。激发波长340nm，发射波长分别为615和665nm。测定数据使用GraphPad Prism软件进行评价。
PLK1的抑制活性以运载体响应百分比表示，IC50值表示抑制运载体响应50％时的化合物浓度。IC50结果归入以下3个范围：
A：IC50＜100nM
B：IC50从100nM到500nM
C：IC50＞500nM
下表列出了本文部分实施例化合物的结果。
  实施例   对PLK1的抑制活性
  9   A
  14   B
  15   B
  16   A
  17   A
  18   C
  19   A
  39   B
  44   A
  166   A
  175   B
  176   B
  177   A
  178   C
  179   A
  180   A
  181   A
表中列出的17个实施例化合物对Plk1酶活性均具有一定的抑制作用，其中化合物9，16，17，19，44，166，177，179，180和181对Plk1酶活性半抑制浓度IC50小于100nM，与阳性化合物Wortmannin和BI2536对Plk1的IC50值分别为24nM和0.8nM非常接近，显示出对Plk1酶活性的强烈抑制效果。

Claims (10)

1.胺基噻唑烷酮化合物，其特征在于，所述化合物如式I所示：
Figure FSA00000419569500011
其中
A1为芳基或杂芳基；
A2为苯环、取代的苯环、萘环、取代的萘环、吡啶环、取代的吡啶环或2-，3-，4-取代的吡啶环；
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自为氢、卤素、羟基、氰基、氨基或硝基，或为C1-C6烷基或C1-C6烷氧基，其任选地在一个或多个位置以相同或不同的方式被卤素、羟基、C3-C8杂环烷基取代或者被基团-NR7R8或-CO(NR7)-Y取代，所述杂环烷基在环中包含至少一个相同或不同的选自氮、氧或硫的原子，且在环中任选地被一个或多个-(CO)或-SO2基团间断，且在环中任选地可在一个或多个位置以相同或不同的方式被氰基、卤素取代或者在一个或多个位置以相同或不同的方式被卤素取代的C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基或C1-C6-羟基烷基取代，或者被基团-COR7或-NR7R8取代，或为-R7R8、-NR7(CO)-X、-NR7(CO)-NR7-X、-COR7、-CO(NR7)-Y、-NR7(CS)NR7R8、-NR7SO2-X、-SO2-NR7R8或-SO2(NR7)-Y；
X和Y各自为C1-C6烷基、芳基或杂芳基，其任选地在一个或多个位置以相同或不同的方式被羟基、C1-C6-羟基烷氧基、C1-C6-烷氧基、C3-C6-杂环烷基取代或者被基团-NR7R8取代，所述杂环烷基在环中包含至少一个相同或不同的选自氮、氧或硫的原子，且在环中任选地可被一个或多个-(CO)-或-SO2-基团间断，且在环中任选地包含一个或多个双键，所述环本身任选地可在一个或多个位置以相同或不同的方式被氰基、卤素取代或者在一个或多个位置以相同或不同的方式被卤素取代的C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基或C1-C6-羟基烷基取代，或者被-COR7或-NR7R8取代；R7和R8各自为氢、C1-C6烷基或C3-C6环烷基。
2.如权利要求1所述化合物，其特征在于，所述式I的化合物包括其水合物、溶剂合物、立体异构体、N-氧化物和盐、以及其各种的晶形。
3.如权利要求2所述化合物，其特征在于，所述盐为碱加成盐、酸加成盐或季盐。
4.如权利要求3所述化合物，其特征在于所述碱加成盐的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡、氢氧化镁、N-甲基-D-葡糖胺、胆碱三(羟甲基)氨基-甲烷、L-精氨酸、L-赖氨酸、N-乙基哌啶、二苄基胺；所述酸加成盐的酸为盐酸或氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苹果酸、水杨酸、柠檬酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、苯甲酸、苯磺酸、谷氨酸、乳酸或扁桃酸。
5.如权利要求1所述化合物，其特征在于，所述环烷基为环丙基、环丁基、环戊基、或环己基；芳基为苯基、联苯基或萘基；杂芳基为噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吡咯基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噻唑基、苯并异噻唑基、吡唑基、噁唑基、苯并噁唑基、异噁唑基、苯并异噁唑基、异噻唑基、三唑基、苯并三唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吲哚基或吲唑基。
6.如权利要求1所述化合物，其特征在于，所述化合物包括式Ia和Ib的化合物：
Figure FSA00000419569500021
其中R5和R6各自为氢、卤素、羟基、氰基、氨基或硝基；或C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基，其任选地在一个或多个位置以相同或不同的方式被卤素、羟基或C1-C6烷基取代，或为NR7R8、CO(OR7)、CO(NR7R8)或SO2(NR7R8)；R7和R8各自为氢、C1-C6烷基或C3-C6环烷基。
7.如权利要求1所述胺基噻唑烷酮化合物的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
Figure FSA00000419569500031
步骤a：采用2-胺基噻唑酮为原料与芳基甲醛或者取代的芳基甲醛经Knoevenagel condensation反应制备2-胺基-5-(芳基亚甲基)-4(5H)-噻唑酮；所述2-胺基噻唑酮与芳基甲醛或者取代的芳基甲醛的摩尔比为1∶1.5，碱与2-胺基噻唑酮的摩尔比为0.7∶1；反应温度为100℃-110℃；反应时间4-6小时；反应溶剂为醋酸；碱为氨基酸类或哌啶，优选为胺基酸类；
步骤b：步骤a得到的2-胺基-5-(3-芳基亚甲基)-4(5H)-噻唑酮与取代的苯磺酰氯在碱性条件下反应，得到2-(取代苯磺酰基)胺基-5-(芳基亚甲基)-4(5H)-噻唑酮；所述2-胺基-5-(3-芳基亚甲基)-4(5H)-噻唑酮，取代的苯磺酰氯和碱的摩尔比为1∶1.2∶3；碱为Et3N、吡啶或DIPEA，优选为DIPEA；反应温度为25℃-30℃；反应时间10-16小时；反应溶剂为DMF或NMP。
8.如权利要求1或6所述胺基噻唑烷酮化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为化合物I或其药学上可接受的盐、N-氧化物、立体异构体、水合物或溶剂合物作为活性成份与药用辅料按照常规方法制成的片剂、胶囊、粉末、颗粒、锭剂、液体、凝胶剂或注射剂。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制PLK1活性或治疗血癌和实体肿瘤的药物。
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