CN102584764B - 2′-氯-4′-硝基黄酮及其衍生物以及它们的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种2′-氯-4′-硝基黄酮及其衍生物以及它们的制备方法与应用。所述化合物的结构式如式I所示，式I中，R₁为H，或为苯环上取代的下述基团中的一种或者多种：-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-CH₃，-CH₂CH₃，-NO₂，-NH₂，-OCH₃和-CF₃；R₂为H、-OH，-SH，-Br或-CN；R₃为H，或为苯环上取代的下述基团中的一种或者多种：-CH₃，-OCH₃，-CH₂CH₃和-OH；R₄为-NO₂、-NH₂或本发明的化合物是丝裂原活化蛋白激酶抑制剂，具有选择性抑制肝癌细胞增殖的能力，且对正常肝细胞毒性较低，在制备抗肿瘤试剂、抗菌、抗炎、抗类风湿疾病等领域具有重要的实用价值和应用前景。

Description

2′-氯-4′-硝基黄酮及其衍生物以及它们的制备与应用

技术领域

本发明涉及一种2′-氯-4′-硝基黄酮及其衍生物以及它们的制备与应用。

背景技术

黄酮类化合物广泛存在于自然界，是人们饮食的一个重要组成部分。黄酮类化合物包含一个C6-C3-C6的碳骨架，属于苯并吡喃类化合物。因其结构的特殊性，黄酮类化合物具有广泛的生理活性，包括抗炎、抗雌激素、抗菌、抗过敏、抗氧化、抗肿瘤等。目前，黄酮类化合物的来源主要有两种，一种为直接从天然产物中提取，另一种为合成类黄酮化合物。由于天然产物中黄酮含量一般较低且具有一些不利的药理性质，自主设计并合成结构特异、具有特殊药理活性的黄酮类化合物已经成为药物设计的重要手段。

癌症是严重威胁人们生命健康的一种疾病，具有难治愈、死亡率高等特点。由于传统的化疗存在毒副作用强、易于产生耐药性等不足，寻找高效、低毒的靶向性抗癌药物已经成为业界的共识。小分子蛋白激酶抑制剂是近年发展迅速的一类靶向性抗癌药物，目前已有十几个该类小分子药物成功上市。一个基于黄酮骨架的细胞周期激酶抑制剂flavopiridol已经进入临床研究阶段。因此，设计新型的、基于黄酮骨架的、高效、低毒的蛋白激酶抑制剂具有很好的前景。

肝细胞癌(HCC)是一种高死亡率的癌症，主要原因在于早期发展的抗肿瘤药物均不针对其发病机制而设计。2008年，一个以Raf1激酶为主要靶点的小分子蛋白激酶抑制剂Sorafenib被批准用于晚期肝细胞癌的治疗。这为我们设计新型的针对肝细胞癌发病机制的先导化合物提供了线索。临床实践证明，靶向于细胞信号网络的药物在癌症等复杂疾病的治疗上具有更好的治疗效果。目前已经明确，丝裂原活化蛋白激酶在细胞信号转导中起了非常重要的作用，具有调节细胞存活、增殖、分化、凋亡等多方面的功能。丝裂原活化蛋白激酶被发现在多数癌症中高表达，如超过90％的胰腺癌患者中存在着Raf的高表达，55％的中国肝细胞癌患者中存在着JNK1激酶的高表达。近年来的研究结果表明，Raf1和JNK1激酶在肝细胞癌的发展中起正性调节作用，而p38-α起负性调节作用，因此，丝裂原活化蛋白激酶家族已经被认为是十分有前景的肝细胞癌治疗靶点，设计选择性针对Raf1和JNK1激酶的小分子抑制剂用于肝细胞癌的治疗可能具有靶向性强、毒副作用小，成药性高等特点。

发明内容

本发明的目的是提供2′-氯-4′-硝基黄酮及其衍生物以及它们的制备方法。

本发明所提供的2′-氯-4′-硝基黄酮及其衍生物的结构通式如式I所示：

(式I)

式I中，R₁为H，或R₁为苯环上单取代或者多取代的下述基团中的一种或者多种：-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-CH₃，-CH₂CH₃，-NO₂，-NH₂，-OCH₃和-CF₃；

R₂为H、-OH，-SH，-Br或-CN；

R₃为H，或R₃为苯环上单取代或者多取代的下述基团中的一种或者多种：-CH₃，-OCH₃，-CH₂CH₃和-OH；

R₄为-NO₂、-NH₂或

其中，R₅为H或R₅为苯环上单取代或者多取代的下述基团中的一种或者多种：-F，-Cl，-CF₃，-CN，-CH₃和-CH₂CH₃；

M为-(CH₂)_a-，-NH(CH₂)_b-，-O(CH₂)_c-或-S(CH₂)_d-，下标a为≥1的正整数，b，c，d均为≥0的整数。

所述R₁的多取代是指5，6-二取代，5，7-二取代，5，8-二取代，6，7-二取代，6，8-二取代，7，8-二取代，5，6，7-三取代，5，6，8-三取代，6，7，8-三取代，或5，6，7，8-四取代。

所述R₃的多取代是指3′，5′-二取代，3′，6′-二取代，5′，6′-二取代，或3′，5′，6′-三取代。

所述R₅的多取代是指2，3-二取代，2，4-二取代，2，5-二取代，2，6-二取代，2，3，4-三取代，2，3，5-三取代，2，3，6-三取代，2，3，4，5-四取代，2，3，4，6-四取代，或2，3，4，5，6-五取代。

式I中，R₁具体可为5-OH，6-OH，7-OH，6-CH₂CH₃，6-CH₃，6-F，6-NO₂，6-OCH₃，6-Br，6-Cl或6-NH₂；R₂具体可为H；R₃具体可为H；M具体可为-NH或-CH₂，R₅具体可为3，4-二氯，3-Cl，4-Cl，3-F，4-F。

上述式I所示化合物药学上可接受的盐、酯或其溶剂合物也属于本发明的保护范围。

制备式I中R₄＝NO₂的化合物的方法，包括下述步骤：

在碱性催化剂存在下，使式II所示的取代或者未取代的邻羟基苯乙酮和式III所示的取代或者未取代的2-氯-4-硝基苯甲酰氯在干燥的溶剂中进行回流反应，反应结束后除去溶剂，将所得固体产物在浓硫酸和冰醋酸的混合溶液中回流，得到式I中R₄＝NO₂的化合物。

(式II)(式III)

其中，式II中R₁的定义同式I中的R₁；式III中R₃的定义同式I中的R₃。

在上述方法中，所用的碱性催化剂可为无水K₂CO₃、LiOH或吡啶，优选为无水K₂CO₃；所述干燥溶剂为极性溶剂，如丙酮、四氢呋喃、乙腈等，优选为丙酮；所述回流反应的时间为12-24h，优选为16h。

所述浓硫酸为质量分数98％的硫酸；所述混合液中浓硫酸和冰醋酸的体积比为0.5％-10％，优选5％；所得固体产物在浓硫酸和冰醋酸的混合溶液中回流的时间为1-6h，优选2h。

制备式I中R₄＝NH₂的化合物的方法，是将式I中R₄＝NO₂的化合物与还原剂进行反应，得到式I中R₄＝NH₂的化合物。

所述还原剂包括含两个结晶水的氯化亚锡(SnCl₂·2H₂O)，无水氯化亚锡或Pd/C，所述反应可加热回流或者室温反应，优选反应条件为：以无水氯化亚锡为还原剂，在无水乙醇中回流反应2h。

 制备式I中的化合物的方法，包括下述步骤：

1)将式I中R₄＝NH₂的化合物与式IV所示的取代或者未取代的苯乙酸衍生物，在N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，1-羟基苯并三唑(HoBt)和N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)存在下，室温下于干燥溶剂中搅拌反应，得到的化合物，其中a为正整数，a≥1；

2)将式I中R₄＝NH₂的化合物与式V所示的取代或者未取代的苯异氰酸酯衍生物在干燥溶剂中反应，以薄层层析色谱(TLC)监测反应直到式I(R₄＝NH₂)所示化合物的点消失，得到的化合物，其中b为整数，b≥0；

3)将式I中R₄＝NH₂的化合物与(式VI)或(式VII)所示化合物在干燥溶剂、催化剂存在下反应，得到的化合物，其中c或d为整数，c≥0，d≥0。

(式IV)        (式V)       (式VI)             (式VII)

式IV、式V、式VI、式VII中R5的定义同式I中的R₅。

其中，所述干燥溶剂包括二氯甲烷或四氢呋喃；为提高反应产率，在上述反应体系中可加入催化剂，所述催化剂包括4-二甲氨基吡啶(DMAP)，N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，吗啉，N-甲基吗啉，吡啶，三乙胺或哌啶；上述反应可室温搅拌反应，也可加热回流；优选条件为以四氢呋喃为干燥溶剂，DMAP为催化剂，加热回流。

本发明的再一个目的是提供式I所示的化合物或药学上可接受的盐、酯及其溶剂合物的应用。

本发明所提供的应用是式I所示的化合物或药学上可接受的盐、酯及其溶剂合物在下述方面的应用：1)在制备丝裂原活化蛋白激酶抑制剂中的应用，所述丝裂原活化蛋白激酶包括，p38-α，JNK和ERK；2)在制备Raf蛋白激酶抑制剂中的应用；3)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用，所述肿瘤细胞包括肝癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞以及白血病细胞，4)在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括肝癌、结肠癌、肺癌以及血癌，优选用于制备抗肝癌药物；5)在制备抗炎药物中的应用；6)在制备抗菌药物中的应用；7)在制备抗病毒药物中的应用；8)在制备抗氧化药物中的应用。

另外，以本发明提供的式I所示的化合物或药学上可接受的盐、酯及其溶剂合物为活性成分制备的抗肿瘤药物、丝裂原活化蛋白激酶抑制剂以及与丝裂原活化蛋白激酶密切相关的其他激酶(Raf蛋白激酶)抑制剂也均属于本发明的保护范围。

本发明提供的系列化合物，经仪器分析测试，结构正确无误。本发明提供的制备上述系列化合物的方法，原料廉价易得，操作简便。该系列化合物针对肝癌的发病机制、基于丝裂原活化蛋白激酶JNK1和Raf1的高表达在肝细胞癌发展中的正性调节作用和p38-α激酶的负性调节作用而设计，既体现了必要的激酶选择性抑制效果，又体现出高效的、选择性的抑制肝癌细胞增长的活性，对正常肝细胞具有相对较低的毒副作用。设计目的和作用机制明确，毒副作用小，预计在作为抗肝细胞癌药物方面具有远大的前景。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、合成6-甲基-2′-氯-4′-硝基黄酮(式I中R₁＝6-CH₃，R₂＝H，R₃＝H，R₄＝NO₂的化合物)

100mL单口烧瓶，加入等摩尔量的5-甲基邻羟基苯乙酮和2-氯-4-硝基苯甲酰氯(各50mmol)，20mL无水丙酮，4倍当量的无水碳酸钾(200mmol)，加热回流15h；悬蒸除去丙酮后，加入20mL醋酸，1mL浓硫酸(质量分数98％)，加热回流2h，过滤除去生成的无机盐沉淀，滤液以1mol.L^-1NaOH调节pH至7左右，乙酸乙酯萃取(2×25mL)，无水硫酸钠干燥，柱分离(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶3(v/v))得到纯净的6-甲基-2’-氯-4’-硝基黄酮。产率62％；白色固体，熔点：179-180℃。

结构确证数据如下：Ms(EI)315.01.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.42(d，J＝1.38Hz，1H)，8.27(dd，J＝8.94，1.38Hz，1H)，8.04(s，1H)，7.87(d，J＝8.94Hz，1H)，7.56(dd，J＝8.94，1.38Hz，1H)，7.43(d，J＝8.94Hz，1H)，6.70(s，1H)，2.50(s，3H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ177.79，160.01，154.85，149.10，137.69，136.02，135.70，131.64，126.04，125.26，123.53，122.11，118.04，113.73，21.10.

实施例2、合成7-羟基-2′-氯-4′-硝基黄酮(式I中R₁＝7-OH，R₂＝H，R₃＝H，R₄＝NO₂的化合物)

100mL单口烧瓶，加入50mmol 2，4-二羟基苯乙酮和100mmol 2-氯-4-硝基苯甲酰氯，20mL无水丙酮，4倍当量的无水碳酸钾(200mmol)，加热回流15h；悬蒸除去丙酮后，加入20mL醋酸，1mL浓硫酸(质量分数98％)，加热回流2h，趁热过滤除去生成的无机盐沉淀，滤液4℃冰箱冷却，得到黄色晶体7-羟基-2′-氯-4′-硝基黄酮；或者向滤液中加入100mL去离子水，生成黄色沉淀，过滤，滤渣用乙酸乙酯洗涤，得到纯净的黄色固体7-羟基-2′-氯-4′-硝基黄酮。产率26％；淡黄色固体，熔点＞300℃。

结构确证数据如下：Ms(EI)316.99.¹H NMR(400MHz，DMSO)δ10.96(s，1H)，8.48(d，J＝1.7Hz，1H)，8.34(dd，J＝8.5，1.7Hz，1H)，8.09(d，J＝8.5Hz，1H)，7.94(d，J＝8.7Hz，1H)，6.98(dd，J＝8.7，1.6Hz，1H)，6.90(s，1H)，6.63(s，1H).¹³C NMR(101MHz，DMSO)δ175.61，163.12，159.50，157.72，148.96，136.90，132.79，132.48，126.69，125.18，122.52，115.93，115.52，112.77，102.38.

实施例3、合成5-羟基-2′-氯-4′-硝基黄酮(式I中R₁＝5-OH，R₂＝H，R₃＝H，R₄＝NO₂的化合物)

100mL单口烧瓶，加入50mmol 2，4-二羟基苯乙酮和100mmol 2-氯-4-硝基苯甲酰氯，20mL无水丙酮，4倍当量的无水碳酸钾(200mmol)，加热回流15h；悬蒸除去丙酮后，所得黄褐色固体用热水洗涤，得到淡黄色固体5-羟基-2′-氯-4′-硝基黄酮。产率：30％，淡黄色固体，熔点：193-194℃。

结构确证数据如下：Ms(EI)317.03.¹H NMR(400MHz，DMSO)δ12.39(s，1H)，8.52(d，J＝2.1Hz，1H)，8.43-8.34(m，1H)，8.12(d，J＝8.5Hz，1H)，7.74(t，J＝8.4Hz，1H)，7.15(d，J＝8.4Hz，1H)，6.99-6.84(m，2H).¹³C NMR(101MHz，DMSO)δ182.59，161.61，159.82，156.16，149.28，136.50，136.22，132.88，132.72，125.24，122.56，111.91，111.42，110.16，107.53.

合成其他非羟基取代的2′-氯-4′-硝基黄酮类衍生物，合成步骤参照实施例1，得到下述相应的2′-氯-4′-硝基黄酮类衍生物，但不仅限于这些化合物。

2′-氯-4′-硝基黄酮，结构确证数据如下：产率55％，白色固体，mp：143-144℃；Ms(EI)301.00.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.43(d，J＝2.2Hz，1H)，8.28(ddd，J＝7.9，4.6，1.9Hz，2H)，7.87(d，J＝8.5Hz，1H)，7.75(ddd，J＝8.7，7.2，1.7Hz，1H)，7.59-7.45(m，2H)，6.72(s，1H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ177.53，160.13，156.55，149.20，137.56，134.41，134.37，131.55，126.00，125.97，125.83，123.91，122.05，118.20，113.87.

6-乙基-2′-氯-4′-硝基黄酮，结构确证数据如下：产率60％，白色固体，mp：152-153℃；Ms(EI)329.04.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.42(d，J＝2.2Hz，1H)，8.27(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H)，8.08(d，J＝2.1Hz，1H)，7.86(d，J＝8.5Hz，1H)，7.59(dd，J＝8.6，2.2Hz，1H)，7.46(d，J＝8.6Hz，1H)，6.70(s，1H)，2.80(q，J＝7.6Hz，2H)，1.31(t，J＝7.6Hz，3H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ177.87，160.04，155.03，149.16，142.35，137.75，134.70，134.44，131.62，126.07，124.12，123.69，122.10，118.14，113.74，28.51，15.58.

6-甲氧基-2′-氯-4′-硝基黄酮，结构确证数据如下：产率35％，白色固体，mp：208-209℃；Ms(EI)331.00.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.42(d，J＝2.2Hz，1H)，8.27(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H)，7.86(d，J＝8.5Hz，1H)，7.62(d，J＝3.1Hz，1H)，7.48(d，J＝9.2Hz，1H)，7.34(dd，J＝9.2，3.1Hz，1H)，6.71(s，1H)，3.93(s，3H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ177.67，159.99，157.57，151.48，149.19，137.67，134.44，131.65，126.09，124.66，124.56，122.12，119.76，113.05，104.99，56.14.

6-氟-2′-氯-4′-硝基黄酮，结构确证数据如下：产率50％，白色固体，mp：191-192℃；Ms(EI)319.02.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.43(d，J＝2.2Hz，1H)，8.28(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H)，7.90(dd，J＝8.0，3.0Hz，1H)，7.86(d，J＝8.5Hz，1H)，7.55(dt，J＝9.6，4.8Hz，1H)，7.47(ddd，J＝9.2，7.5，3.1Hz，1H)，6.70(s，1H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ110.53，110.764，112.839，120.11(J＝8.08Hz)，121.816，122.34(J＝25.65Hz)，124.86(J＝7.37Hz)，125.772，131.28，134.17，149.03，152.46，158.44，160.52(J＝78.17Hz)，176.49.

6-溴-2′-氯-4′-硝基黄酮，结构确证数据如下：产率46％，白色固体。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.43(d，J＝2.2Hz，1H)，8.39(d，J＝2.4Hz，1H)，8.28(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H)，7.90-7.79(m，2H)，7.43(d，J＝8.9Hz，1H)，6.73(s，1H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ176.22，160.42，155.27，149.31，137.37，137.15，134.42，131.55，128.59，126.04，125.16，122.09，120.15，119.38，113.86.

6-碘-2′-氯-4′-硝基黄酮，结构确证数据如下：产率40％，白色固体。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.59(d，J＝2.0Hz，1H)，8.43(d，J＝2.2Hz，1H)，8.28(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H)，8.00(dd，J＝8.8，2.2Hz，1H)，7.85(d，J＝8.5Hz，1H)，7.29(t，J＝7.5Hz，1H)，6.73(s，1H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ176.10，160.43，156.02，149.34，143.05，137.23，134.95，134.49，131.62，126.13，125.52，122.17，120.30，114.09，89.87.

合成羟基取代的2′-氯-4′-硝基黄酮类衍生物合成步骤参照实施例2和实施案例3。

实施例4、合成6-甲基-2′-氯-4′-氨基黄酮(式I中R₁＝6-CH₃，R₂＝H，R₃＝H，R₄＝NH₂的化合物)

100mL单口烧瓶中，加入10mmol的6-甲基-2′-氯-4′-硝基黄酮，4倍当量的无水氯化亚锡(40mmol)，20mL无水乙醇，加热回流2h，冷却至室温后以浓氨水(0.88g/mL)调节pH至11，悬蒸除去无水乙醇，加入50mL去离子水，过滤除去白色絮状沉淀，以二氯甲烷萃取(2×20mL)，无水硫酸钠干燥，悬蒸除去溶剂后柱分离(二氯甲烷∶甲醇＝40∶1(v/v))得到纯净的6-甲基-2′-氯-4′-氨基黄酮。产率：92％，黄色固体，熔点：165-166℃。

结构确证数据如下：HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺286.0636，found 286.0639.¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ8.02(s，1H)，7.45-7.47(m，2H)，7.40(d，J＝4.44Hz，1H)，6.79(s，1H)，6.65(m，3H)，4.06(s，2H)，2.36(s，3H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ178.50，163.00，154.82，149.68，135.01，134.85，133.87，131.69，124.93，123.40，120.88，117.86，116.09，113.09，111.61，20.94.

实施例5、合成7-羟基-2′-氯-4′-氨基黄酮(式I中R₁＝7-OH，R₂＝H，R₃＝H，R₄＝NH₂的化合物)

100mL单口烧瓶中，加入10mmol的7-羟基-2′-氯-4′-硝基黄酮，4倍当量的无水氯化亚锡(200mmol)，20mL无水乙醇，加热回流2h，冷却至室温后以浓氨水调节pH至11，加入1.50g硅胶(100-200目)，悬蒸除去溶剂后柱分离(二氯甲烷∶甲醇＝8∶1(v/v)，另加1％体积的0.88g/mL氨水)，得到纯净的7-羟基-2′-氯-4′-氨基黄酮。产率72％，黄色固体，mp：281-283℃。

结构确证数据如下：HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺288.0428，found 288.0451.¹HNMR(400MHz，DMSO)δ10.79(d，J＝15.6Hz，1H)，7.89(t，J＝8.0Hz，1H)，7.47(d，J＝8.5Hz，1H)，7.01-6.81(m，2H)，6.74(d，J＝2.0Hz，1H)，6.63(dd，J＝8.5，2.1Hz，1H)，6.42(d，J＝17.3Hz，1H)，6.08(s，2H).¹³C NMR(101MHz，DMSO)δ175.93，162.53，162.31，157.57，152.26，132.24，131.75，126.42，116.93，115.84，114.83，114.13，112.26，109.95，102.25.

合成其他非羟基取代的2′-氯-4′-氨基黄酮类衍生物，合成步骤如实施例4，得到下述相应的化合物，但不仅限于这些化合物。

2′-氯-4′-氨基黄酮，淡黄色固体，Yield 90％，黄色固体，mp：147-148℃；HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺272.0479，found 272.0477.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.24(dd，J＝8.0，1.6Hz，1H)，7.68(ddd，J＝8.7，7.1，1.7Hz，1H)，7.54-7.45(m，2H)，7.45-7.39(m，1H)，6.80(d，J＝2.3Hz，1H)，6.72-6.62(m，2H)，4.07(s，2H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ178.36，163.04，156.55，149.52，133.98，133.61，131.76，125.69，125.06，123.84，121.08，118.11，116.14，113.11，111.92.

6-乙基-2′-氯-4′-氨基黄酮，淡黄色固体，Yield 88％；yellow solid，mp：96-97℃；HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺300.0792，found 300.0788.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.05(d，J＝2.0Hz，1H)，7.52(dd，J＝8.6，2.2Hz，1H)，7.44(dd，J＝14.4，8.5Hz，2H)，6.79(d，J＝2.3Hz，1H)，6.69-6.62(m，2H)，4.07(s，2H)，2.77(q，J＝7.6Hz，2H)，1.30(t，J＝7.6Hz，3H).¹³C NMR(101MHz，CDCl3)δ178.34，162.72，154.77，149.25，141.16，133.74，133.62，131.53，123.61，123.35，121.01，117.75，115.92，112.90，111.53，28.21，15.37.

6-甲氧基-2′-氯-4′-氨基黄酮，淡黄色固体，Yield 80％；yellow solid，mp：142-143℃；HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺302.0585，found 302.0580.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.60(d，J＝3.0Hz，1H)，7.50-7.41(m，2H)，7.28(d，J＝3.1Hz，1H)，6.79(d，J＝2.3Hz，1H)，6.70-6.62(m，2H)，4.09(s，2H)，3.91(s，3H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ178.21，162.82，156.93，151.41，149.47，133.93，131.73，124.39，123.71，121.15，119.54，116.13，113.12，111.14，104.78，55.97.

6-氟-2′-氯-4′-氨基黄酮，淡黄色固体，Yield 85％；yellow solid，mp：176-177℃；HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺289.0306，found 289.0303.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.87(dd，J＝8.2，3.1Hz，1H)，7.51(dd，J＝9.1，4.2Hz，1H)，7.46(d，J＝8.5Hz，1H)，7.40(ddd，J＝9.1，7.7，3.1Hz，1H)，6.80(d，J＝2.3Hz，1H)，6.70-6.62(m，2H)，4.09(s，2H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)177.53(J＝2.22Hz)，163.39，159.60(J＝247.65Hz)，152.78，149.77，134.04，131.76，125.05(J＝7.37Hz)，121.75(J＝25.55Hz)，120.48(J＝53.53Hz)，116.18，113.14，111.16，110.70，110.47.

6-溴-2′-氯-4′-氨基黄酮，淡黄色固体，Yield 82％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.35(d，J＝2.4Hz，1H)，7.75(dd，J＝8.9，2.4Hz，1H)，7.42(dd，J＝22.7，8.7Hz，2H)，6.79(d，J＝2.2Hz，1H)，6.73-6.60(m，2H)，4.16(br，2H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ176.94，163.36，155.30，149.83，136.55，134.04，131.74，128.34，125.19，120.52，120.07，118.49，116.18，113.13，111.78.

6-碘-2′-氯-4′-氨基黄酮，淡黄色固体，yield 80％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.56(d，J＝2.2Hz，1H)，7.93(dd，J＝8.7，2.2Hz，1H)，7.46(d，J＝8.4Hz，1H)，7.28(s，1H)，6.79(d，J＝2.2Hz，1H)，6.72-6.62(m，2H)，4.08(s，2H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ176.47，163.03，155.75，149.45，141.90，134.42，133.82，131.51，125.30，120.46，119.93，115.94，112.87，111.73，88.60.

合成其他羟基取代的2′-氯-4′-氨基黄酮类衍生物，合成步骤如实施例5。

实施例6、合成1-(6-乙基-2′-氯-4′-氨基黄酮)-3-(4-氯苯基)脲(式I中R₁＝6-CH₂CH₃，R₂＝H，R₃＝H，的化合物)

50mL单口烧瓶中，加入0.33mmol的6-乙基-2′-氯-4′-氨基黄酮，1.2倍当量的DMAP(0.40mmol)，1.2倍当量的4-氯苯异氰酸酯，10mL干燥的THF，加热回流，TLC监测反应进程至6-乙基-2′-氯-4′-氨基黄酮完全消失为止(大约需12h)。旋蒸除去THF，所得固体用甲苯和二氯甲烷各洗两次(2×5mL)，得到纯净的目标产物。产率：75％，黄色固体，mp：258-259℃。

结构确证数据如下：HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺453.0773，found 453.0767.¹H NMR(400MHz，DMSO)δ9.29(s，1H)，9.06(s，1H)，7.90(dd，J＝6.2，1.8Hz，2H)，7.78-7.68(m，2H)，7.62(d，J＝8.6Hz，1H)，7.50(dd，J＝12.4，5.4Hz，3H)，7.36(d，J＝8.8Hz，2H)，6.61(s，1H)，2.76(q，J＝7.5Hz，2H)，1.24(t，J＝7.6Hz，3H).¹³C NMR(101MHz，DMSO)δ177.25，162.60，154.93，152.63，143.65，141.97，138.68，134.97，132.54，132.17，129.18，126.48，124.59，123.46，123.39，120.69，119.40，118.91，117.32，112.09，28.06，15.98.

合成黄酮脲的其他衍生物，合成步骤如实施例6，得到下述相应的化合物，但不仅限于这些化合物。

1-(2′-氯-4′-氨基黄酮)-3-(3-氯苯基)脲，结构确证数据如下：Yield 70％，黄色固体，mp：290-292℃，HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺425.0460，found 425.0457.¹H NMR(400MHz，DMSO)δ9.33(s，1H)，9.13(s，1H)，8.08(dd，J＝7.9，1.5Hz，1H)，7.91(d，J＝2.0Hz，1H)，7.84(ddd，J＝8.7，7.2，1.6Hz，1H)，7.76(d，J＝8.6Hz，1H)，7.71(dd，J＝6.8，4.9Hz，2H)，7.57-7.46(m，2H)，7.38-7.26(m，2H)，7.11-7.01(m，1H)，6.64(s，1H).¹³CNMR(101MHz，DMSO)δ177.23，162.74，156.49，152.61，143.60，141.25，134.99，133.73，132.58，132.22，130.95，126.19，125.39，124.62，123.68，122.54，119.51，118.99，118.54，117.60，117.42，112.28.

1-(2′-氯-4′-氨基黄酮)-3-(3，4-二氯苯基)脲，结构确证数据如下：Yield 51％，浅黄色固体，mp：286-288℃，HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺459.0071，found 459.0086.¹HNMR(400MHz，DMSO)δ9.39(s，1H)，9.24(s，1H)，8.08(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，7.90(dd，J＝7.1，2.2Hz，2H)，7.87-7.80(m，1H)，7.76(d，J＝8.6Hz，1H)，7.69(d，J＝8.3Hz，1H)，7.59-7.47(m，3H)，7.38(dd，J＝8.8，2.4Hz，1H)，6.64(s，1H).¹³C NMR(101MHz，DMSO)δ177.22，162.71，156.48，152.56，143.47，139.95，134.99，132.57，132.22，131.59，131.13，126.19，125.39，124.74，124.27，123.68，120.29，119.62，119.30，118.99，117.51，112.29.

1-(6-乙基-2′-氯-4′-氨基黄酮)-3-(3-氯苯基)脲，结构确证数据如下：Yield 67％，黄色固体，mp：229-230℃，HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺453.0773，found 453.0772.¹HNMR(400MHz，DMSO)δ9.36(s，1H)，9.16(s，1H)，7.91(d，J＝10.4Hz，2H)，7.74(dt，J＝17.9，8.8Hz，3H)，7.62(d，J＝8.6Hz，1H)，7.52(t，J＝12.1Hz，1H)，7.40-7.24(m，2H)，7.06(d，J＝3.4Hz，1H)，6.63(d，J＝12.9Hz，1H)，2.76(q，J＝7.4Hz，2H)，1.24(t，J＝7.5Hz，3H).¹³C NMR(101MHz，DMSO)δ177.24，162.58，154.93，152.62，143.56，141.96，141.27，134.96，133.73，132.55，132.16，130.94，129.39，124.69，123.39，122.51，119.49，118.90，118.52，117.58，117.40，112.10，28.07，15.98.

1-(6-甲氧基-2′-氯-4′-氨基黄酮)-3-(3-氯苯基)脲，结构确证数据如下：Yield 67％，黄色固体，mp：240-243℃，HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺455.0565，found 455.0562.¹HNMR(400MHz，DMSO)δ9.33(s，1H)，9.13(s，1H)，7.91(d，J＝1.8Hz，1H)，7.81-7.69(m，2H)，7.67(d，J＝8.8Hz，1H)，7.56-7.40(m，3H)，7.40-7.26(m，2H)，7.12-7.00(m，1H)，6.62(s，1H)，3.88(s，3H).¹³C NMR(101MHz，DMSO)δ176.34，161.76，156.61，151.97，150.58，142.90，140.64，133.13，131.93，131.49，130.29，124.01，123.76，123.29，121.88，119.93，118.88，117.89，116.93，116.75，110.79，104.69，55.66.

1-(6-甲氧基-2′-氯-4′-氨基黄酮)-3-(3，4-二氯苯基)脲，结构确证数据如下：Yield 54％，黄色固体，mp：256-258℃，HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺489.0176，found 489.0190.¹H NMR(400MHz，DMSO)δ9.37(s，1H)，9.23(s，1H)，7.89(s，2H)，7.75(d，J＝8.8Hz，1H)，7.66(d，J＝8.9Hz，1H)，7.53(dd，J＝17.5，8.9Hz，2H)，7.44(d，J＝9.5Hz，2H)，7.38(d，J＝8.9Hz，1H)，6.62(s，1H)，3.88(s，3H).¹³C NMR(101MHz，DMSO)δ176.96，162.41，157.26，152.55，151.21，143.39，139.95，132.53，132.17，131.59，131.13，124.82，124.39，124.26，123.96，120.59，120.28，119.61，119.29，117.50，111.45，105.33，56.31.

1-(6-氟-2′-氯-4′-氨基黄酮)-3-(3-氯苯基)脲，结构确证数据如下：Yield 40％，黄色固体，mp＞300℃，HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]^-441.0208，found 442.0217.¹H NMR(400MHz，DMSO)δ9.34(s，1H)，9.14(s，1H)，7.92(d，J＝2.0Hz，1H)，7.86-7.81(m，1H)，7.79-7.70(m，4H)，7.51(dd，J＝8.6，2.0Hz，1H)，7.37-7.30(m，2H)，7.07(dt，J＝4.9，2.2Hz，1H)，6.69(s，1H).¹³C NMR(101MHz，DMSO)δ176.00，162.40，152.32，151.99，143.10，140.62，133.13，132.00，131.68，130.36，124.25(J＝7.07Hz)，123.78，122.60，122.35，121.96，121.25(J＝9.09Hz)，118.90，117.93，117.00，116.80，110.96，109.43(J＝24.24Hz).

1-(7-羟基-2′-氯-4′-氨基黄酮)-3-(3-氯苯基)脲，结构确证数据如下：Yields 45％，黄色固体，mp＞300℃，HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺441.0409，found 441.0406.¹HNMR(400MHz，DMSO)δ9.87(s，1H)，9.64(s，1H)，7.92(dd，J＝17.9，9.1Hz，2H)，7.73(d，J＝8.6Hz，2H)，7.48(dd，J＝8.6，2.0Hz，2H)，7.32(d，J＝4.9Hz，2H)，7.09-7.01(m，1H)，6.96(dd，J＝8.7，2.2Hz，1H)，6.91(d，J＝2.1Hz，1H)，6.49(s，1H).¹³C NMR(101MHz，DMSO)δ175.90，162.83，161.40，157.67，152.14，142.90，140.77，133.13，131.90，131.54，130.36，126.51，124.04，121.77，118.61，117.62，116.69，116.55，115.84，115.15，111.32，102.33.

1-(7-羟基-2′-氯-4′-氨基黄酮)-3-(4-氯苯基)脲，结构确证数据如下：Yield：75％，浅黄色固体，mp＞300℃，HRMS(ESI)m/z calcd for[M+H]⁺441.0409，found 441.0417.¹HNMR(400MHz，DMSO)δ10.90(s，1H)，9.29(s，1H)，9.08(s，1H)，8.04-7.82(m，2H)，7.72(d，J＝8.4Hz，1H)，7.51(t，J＝11.1Hz，3H)，7.36(d，J＝8.5Hz，2H)，6.96(d，J＝7.6Hz，1H)，6.90(s，1H)，6.50(s，1H).¹³C NMR(101MHz，DMSO)δ175.92，162.85，161.39，157.70，152.05，142.93，138.12，131.91，131.47，128.59，126.56，125.88，124.07，120.08，118.83，116.73，115.87，115.17，111.34，102.34.

实施例7、合成N-(6-乙基-2′-氯-4′-氨基黄酮)-1-(3-氟苯基)乙酰胺(式I中R₁＝6-CH₂CH₃，R₂＝H，R₃＝H，的化合物)

50mL单口烧瓶中，加入0.33mmol的6-乙基-2′-氯-4′-氨基黄酮，等摩尔量的3-氟苯乙酸(0.33mmol)，1.2倍当量的DIC(0.40mmol)，1.2倍当量的DIEA(0.40mmol)，1.1倍当量的HoBt(3.63mmol)，15mL干燥的THF，室温搅拌18h，旋蒸，除去溶剂后柱分离(二氯甲烷∶甲醇＝45∶1(v/v))，得到纯净的目标产物。

结构确证数据如下：Yield 45％，黄色固体，mp：181-182℃，HRMS(ESI)m/z calcdfor[M+H]⁺436.1116，found 436.1125.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.35(s，1H)，8.04(d，J＝2.0Hz，1H)，7.81(d，J＝1.2Hz，1H)，7.62-7.51(m，3H)，7.44(d，J＝8.6Hz，1H)，7.33(td，J＝7.9，6.1Hz，1H)，7.13(d，J＝7.7Hz，1H)，7.08(dd，J＝9.5，2.0Hz，1H)，7.01(td，J＝8.4，2.1Hz，1H)，6.65(d，J＝6.2Hz，1H)，3.78(s，2H)，2.77(q，J＝7.6Hz，2H)，1.29(t，J＝7.6Hz，3H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ178.60，168.96，163.09(J＝248.46Hz)，162.34，155.08，141.84，140.94，136.40(J＝7.07Hz)，134.31，133.50，131.10，130.66(J＝9.09Hz)，127.24，125.06(J＝2.02Hz)，123.77，123.49，121.42，118.14，117.95，116.46(J＝22.22Hz)，114.72(J＝21.21Hz)，112.42，44.30，28.41，15.47.

合成其他黄酮乙酰胺类衍生物，合成步骤如实施例7。

实施例8、化合物体外抑制肿瘤细胞增殖活性

取对数生长期的人肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7、白血病细胞K562，结肠癌细胞HCT116和肺癌细胞A549(上述细胞均购自于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库、中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。以2×10⁵个/mL的密度接种于96孔板中，99μL/孔，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养4小时后，每孔加入本发明实施例制备的化合物，使各个化合物的终浓度分别50μmol/L，25μmol/L，10μmol/L，5μmol/L，1μmol/L，0.5μmol/L的6个浓度梯度。每种化合物设五个复孔，同时设阴性和阳性对照，其中，阴性对照为体积比为1％的DMSO溶液。作用48小时后加入MTT(5mg/ml)溶液，10μL/well，继续培养4-6小时后，2000rpm，4℃，离心5分钟，吸去上清后加入DMSO，100μL/well，37℃保温约10分钟，并用微量振荡器振荡约5分钟使结晶溶解完全，用酶标仪于495nm处测量OD值，按如下公式计算细胞增殖抑制率(Inhibition Rate，IR％)：

IR％＝(空白对照OD-样品OD)/空白对照OD×100％

经计算，本发明实施例1-5制备得到的化合物对HepG2细胞具有较好的选择性抑制作用，它们的半数抑制剂量IC₅₀见表1。

表1：合成黄酮类化合物对HepG2、MCF-7、K562、A549和HCT116细胞的半数增殖抑制率

使用秋水仙素作为HepG2和K562细胞的阳性对照药；Sorafenib作为A549和HCT116细胞的阳性对照药；Imatinib作为K562细胞的阳性对照药。nd指没有测试。

实施例9、化合物对正常肝细胞毒性评价

由于合成的化合物体现出对HepG2细胞的选择性抑制，我们评价了化合物对正常肝细胞QSG7701和HL7702生长的影响。QSG7701和HL7702细胞均购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。实施步骤按实施例8进行，化合物终浓度分别为100和50μmol/L，在这两个浓度下，实施例所得化合物对正常肝细胞的生长抑制率见表2。

表2合成黄酮类化合物对QSG7701和HL7702细胞生长抑制率

实施例10、化合物体外激酶抑制实验

化合物体外激酶抑制实验的一般程序如下：在一个384孔板中，加入含有酶、底物、ATP和待测化合物的缓冲溶液(pH＝7.4，25mM HEPES，10mM MgCl₂，0.01％TritonX-100，100μg/mL BSA，2.5mM DTT)，每孔总体积为10μL。30℃孵育1h之后，加入等体积的激酶glo plus试剂使反应停止。测试反应系统的荧光数据，所得数值与反应系统中所剩的ATP数量成正比，与激酶活性成反比。结果见表3，数据显示，化合物1-(6-乙基-2′-氯-4′-氨基黄酮)-3-(4-氯苯基)脲在50μM浓度下，分别抑制了65.57％的Raf1活性，67.40％的JNK1的活性和13.51％的p38α的活性，体现出必要的激酶选择性。

表3化合物1-(6-乙基-2′-氯-4′-氨基黄酮)-3-(4-氯苯基)脲在50μM下对Raf1、JNK1和p38α激酶的抑制率(％)

 Sorafenib、Staurosporine和SB202190分别作为Raf1、JNK1和p38α的阳性对照药。nd指没有测试。

Claims (9)

1.结构通式如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：

式I中，R₁为H，或R₁为苯环上单取代或者多取代的下述基团中的一种或者多种：-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-CH₃，-CH₂CH₃，-NO₂，-NH₂，-OCH₃和-CF₃；

R₂为H、-OH，-SH，-Br或-CN；

R₃为H，或R₃为苯环上单取代或者多取代的下述基团中的一种或者多种：-CH₃，-OCH₃，-CH₂CH₃和-OH；

R₄为

其中，R₅为H或R₅为苯环上单取代或者多取代的下述基团中的一种或者多种：-F，-Cl，-CF₃，-CN，-CH₃和-CH₂CH₃；

M为-NH或-CH₂。

2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述R₁为苯环上多取代的基团，其中多取代是指5,6-二取代，5,7-二取代，5,8-二取代，6,7-二取代，6,8-二取代，7,8-二取代，5,6,7-三取代，5,6,8-三取代，6,7,8-三取代，或5,6,7,8-四取代；

所述R₃为苯环上多取代的基团，其中多取代是指3′,5′-二取代，3′,6′-二取代，5′,6′-二取代，或3′,5′,6′-三取代；

所述R₅为苯环上多取代的基团，其中多取代是指2,3-二取代，2,4-二取代，2,5-二取代，2,6-二取代，2,3,4-三取代，2,3,5-三取代，2,3,6-三取代，2,3,4,5-四取代，2,3,4,6-四取代，或2,3,4,5,6-五取代。

3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述式I中，所述R₁为5-OH，6-OH，7-OH，6-CH₂CH₃，6-CH₃，6-F，6-NO₂，6-OCH₃，6-Br，6-Cl或6-NH₂；所述R₂为H；所述R₃为H；

R₅为3,4-二氯，3-Cl，4-Cl，3-F或4-F。

4.制备权利要求1所述化合物的方法，分为下述1)-2)两种方法：

1)将所述式I中R₄＝NH₂的化合物与式Ⅳ所示的化合物，在N,N-二异丙基乙胺、1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基碳二亚胺存在下，室温下于干燥溶剂中反应，得到式I所示化合物，其中a为1；

2)将所述式I中R₄＝NH₂的化合物与式Ⅴ所示的化合物在干燥溶剂中反应，以薄层层析色谱监测反应直到式I中R₄＝NH₂的化合物的点消失，得到式I所示化合物，其中b为0；

式Ⅳ、式Ⅴ中R₅的定义同式I中的R₅。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述干燥溶剂为二氯甲烷或四氢呋喃。

6.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在下述方面的应用：1)在制备丝裂原活化蛋白激酶抑制剂中的应用；2)在制备Raf蛋白激酶抑制剂中的应用；3)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用，所述肿瘤细胞为肝癌细胞、结肠癌细胞或肺癌细胞，4)在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为肝癌、结肠癌或肺癌。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述丝裂原活化蛋白激酶选自下述至少一中：p38-α、JNK和ERK。

8.一种药物，其活性成分为权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐；所述药物为1)丝裂原活化蛋白激酶抑制剂；2)Raf蛋白激酶抑制剂；3)真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂；4)预防和/或治疗肿瘤的药物；所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为肝癌细胞、结肠癌细胞或肺癌细胞；

所述肿瘤为癌；所述癌为肝癌、结肠癌或肺癌。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述丝裂原活化蛋白激酶选自下述至少一中：p38-α、JNK和ERK。