CN102580149A

CN102580149A - 一种抗菌涂层及其制备方法

Info

Publication number: CN102580149A
Application number: CN2012100810531A
Authority: CN
Inventors: 曹辉亮; 刘宣勇
Original assignee: Shanghai Institute of Ceramics of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Ceramics of CAS
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2012-03-26
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明提供一种抗菌涂层的制备方法，其中，以医用金属或合金作为基材，先在基材上制备氧化钛涂层，然后采用银等离子体浸没离子注入工艺将银离子注入到氧化钛涂层上，形成银纳米颗粒镶嵌在氧化钛表面的结构。由于其银纳米颗粒为镶嵌于氧化钛涂层表面，被正常细胞吞噬的可能性较小，产生细胞毒性的概率较小，故细胞相容性较好。

Description

一种抗菌涂层及其制备方法

技术领域

本发明涉及医用抗菌涂层和纳米材料技术领域，具体涉及一种抗菌涂层及其制备方法。

背景技术

一些可植入器械，如人工关节，接骨板，种植牙等，在改善骨病患者生活水平方面起到了至关重要的作用。但长期临床跟踪及研究发现，植入体表面无抗菌性，植入相关细菌感染频频发生是致使植入体失效的主要原因之一[Tissue Engineering: Part A 2009, 15:417-426]。接骨板和种植牙的感染率可高达10～30%[Nazhat SN, et al. Sterility and infection. In Biomedical materials, Narayan R edited, Springer, New York, 2009]。由于感染初期诊断困难，一旦感染发生，往往需要重新植入手术才能根除，这必将给病人带来极大痛苦和损失。抗生素是现阶段预防植入手术感染的主要手段，但由抗生素滥用引起的“超级细菌”事件时有发生[Lancet Infect. Dis., 2010, 10:597-602]，这使人们不得不重新审视对抗生素过渡依赖问题。针对细菌膜功能的抗菌策略对耐药性细菌具有显著抑制效果，但现阶段这种策略仅限于有机化合物与细菌膜功能的作用[Nat Rev Microbiol 2011, 9:62-75]，有机抗菌剂稳定性相对较差且很难固载到植入体表面。

银作为抑菌药物使用早已被人们所熟知。早在公元前4000年人们就已开始使用银来预防感染[Surg Infect 2009, 10:289-292]。硝酸银被用以治疗伤口慢性局部溃烂，可以追溯至17世纪[Burns 2000, 26:117-130]。随着20世纪40年代青霉素的发明，银作为抗感染药物使用的频率才有所减少[J Antimicrob Chemother 2007, 59:587-590]。但近年，随着抗生素耐药性问题日趋严重，银的抗菌效用又开始得到人们重视[J Antimicrob Chemother 2006, 57:589-608]。基于纳米材料特殊物理化学性质，银纳米颗粒作为新一代的抗菌材料，在绷带、医疗器械、洗液等方面的应用也有较多报道[Biotechnol Adv 2009, 27:76-83]。虽然银颗粒的抗菌或抑菌效果明显，但其作用机理还没有完全搞清楚，研究显示银可阻碍细菌膜电子转移过程，破坏细菌膜结构[Nat Mater 2008, 7:236-241]，但具体控制方法仍有待开发。此外，游离态的银纳米颗粒容易被正常细胞吞噬并引起生物毒性 [Biomaterials 2011, 32:9810-9817]，故银纳米颗粒生物毒性的控制也是其抗菌性能利用过程中应该兼顾的方面。

具有n型半导体特性的氧化钛由于其光催化效应可破坏细菌膜完整性，具有显著杀菌效果[Surf Sci Rep 2011, 66:185-297]，但在无光激励情况下这种抗菌效应并不显著，因此应用受到限制。研究表明在纯氧化钛中引入“电子阱”(如空位，掺杂等)后, 其基于光催化效应的抗菌性能将因肖特基效应而有显著增强[J Mater Chem 2010, 20:1068-1072]。另有报道显示，银纳米颗粒镶嵌于氧化钛中也会起到“电子阱”的作用，产生肖特基效应[J Am Chem Soc 2005, 127:3928-3934]。但是利用银纳米颗粒/氧化钛界面的肖特基效应获得非光激活的可控抗菌性能涂层还有待开发。

此外，虽然应用离子注入方法在玻璃、有机及其他一些基材上制备银纳米颗粒已有很多报道[Adv Mater 2001, 13:1431-1444]。但是一般认为，不结合外部热处理过程，很难单独利用这种方法获得尺寸和分布可控的纳米颗粒[Nano Lett 2005, 5:373-377; Phys Rev Lett 2009, 102:146101]。然而，我们注意到等离子体浸没离子注入工艺的非视线注入特点及其伴随注入过程产生的浸没式原子加热效应，将有助于纳米颗粒在无外部加热情况下形成。

发明内容

本发明基于银纳米颗粒/氧化钛界面的肖特基效应以及细菌壁本质负电性特点，针对植入体表面抗菌性能不佳，游离态银纳米颗粒抗菌行为和生物毒性不易控制的问题，采用银等离子体浸没离子注入工艺将银离子注入到氧化钛涂层上，使银纳米颗粒镶嵌在氧化钛表面，以此提高涂层的抗菌效果，无需外部加热过程，可控制游离态的银纳米颗粒所引起的生物毒性。

为此，本发明提供一种抗菌涂层的制备方法，其中，以医用金属或合金作为基材，先在基材上制备氧化钛涂层，然后采用银等离子体浸没离子注入工艺将银离子注入到氧化钛涂层上，形成银纳米颗粒镶嵌在氧化钛表面的结构。由于其银纳米颗粒为镶嵌于氧化钛涂层表面，被正常细胞吞噬的可能性较小，产生细胞毒性的概率较小，故细胞相容性较好。

在本发明中，所述银纳米颗粒尺寸可以在2-25nm范围可调。这样，可以提高比表面积，从而提高抗菌力。

所述银等离子体浸没离子注入工艺，可以采用脉冲弧源，并以纯银为阴极，在真空室内进行。这样的制备工艺可控性好，易于推广应用。

在银等离子体浸没离子注入工艺中，真空室温度优选为20～80℃，真空度优选为3×E-3～5×E-3Pa。注入电压优选为10～40kV, 脉宽优选为300～800μs, 频率优选为5～10Hz。真空室内的处理时间优选为0.5～1.5h。通过在形成于基材的氧化钛涂层表面采用银等离子体浸没离子注入工艺使涂层表层形成银纳米颗粒镶嵌于氧化钛涂层表层的结构，离子注入工艺过程不需要外部加热过程辅助，银纳米颗粒形成决定于离子注入工艺且颗粒尺寸可调。

在所述注入工艺中，所述制备氧化钛涂层的方法优选采用大气等离子体喷涂方法。选择合适的氧化钛涂层制备方法，可以确保基材与氧化钛涂层之间的结合强度，提高喷涂效果。

所述医用金属或合金优选为医用纯钛或钛合金。钛或钛合金的密度小、比强度高、具有极好的生物相容性和耐腐蚀性的特点。

此外，本发明在基材上制备的氧化钛涂层相结构由金红石、锐钛矿及低氧氧化钛组成。

另外，本发明还提供一种抗菌涂层，所述抗菌涂层由上述制备方法制备。

本发明的抗菌涂层具有以下优点：其银纳米颗粒为镶嵌于氧化钛涂层表面，被正常细胞吞噬的可能性较小，故细胞相容性较好；其抗菌行为非光激活型，适合植入体表面使用；其抗菌行为可调，适合不同抗菌场合使用；其对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)和大肠杆菌(革兰氏阴性)均有抗菌效果，具有广谱抗菌特点。本发明制备方法由于银纳米颗粒形成决定于离子注入工艺，不需要外部加热过程辅助，制备工艺可控性好，易于推广应用。

附图说明

图1为本发明中的一实施例的氧化钛涂层表面扫描电镜（SEM）形貌照片，氧化钛表面形成了尺寸为2-9纳米的颗粒；

图2为图1的氧化钛涂层表面X光电子能谱（XPS）测得的银3d高分辨谱；

图3为金黄色葡萄球菌在图1的氧化钛涂层表面培养、脱水干燥后的SEM照片；

图4为本发明另一实施例的氧化钛涂层表面的SEM形貌照片，氧化钛表面形成了尺寸为2-6纳米的颗粒；

图5为金黄色葡萄球菌在图4的氧化钛涂层表面培养、脱水干燥后的SEM照片；

图6为本发明中又一实施例的氧化钛涂层表面的SEM形貌照片，氧化钛表面形成了尺寸为3-9纳米的颗粒；

图7为本发明中又一实施例的氧化钛涂层表面的SEM形貌照片，氧化钛表面形成了尺寸为10-25纳米的颗粒；

图8为金黄色葡萄球菌在图7的氧化钛涂层表面培养、脱水干燥后的SEM照片；

图9为本发明中又一实施例的氧化钛涂层表面的SEM形貌照片，氧化钛表面形成了尺寸为5-25纳米的颗粒；

图10为金黄色葡萄球菌在图9的氧化钛涂层表面培养、脱水干燥后的SEM照片；

图11为大肠杆菌种在图9的氧化钛涂层表面培养、脱水干燥后的SEM照片；

图12为MG63细胞在图9的氧化钛涂层表面培养1、3、9天的AlamarBlue评价结果；

图13为本发明中又一实施例的氧化钛涂层表面的SEM形貌照片，氧化钛表面形成了尺寸为4-24纳米的颗粒；

图14为金黄色葡萄球菌在图13的氧化钛涂层表面培养、脱水干燥后的SEM照片；

图15为大肠杆菌种在图13的氧化钛涂层表面培养、脱水干燥后的SEM照片；

图16为MG63细胞在图13的氧化钛涂层表面培养1天、脱水干燥后的SEM照片；

图17为MG63细胞在图13的氧化钛涂层表面培养1、3、9天的AlamarBlue评价结果。

具体实施方式

参照说明书附图，并结合下述实施方式进一步说明本发明，应理解，说明书附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

作为示例，本发明抗菌涂层的制备方法可以具有如下步骤：

（a）先在基材表面制备氧化钛涂层；（b）然后采用银等离子体浸没离子注入技术(Ag PIII)在氧化钛涂层表面制备“镶嵌式”纳米银颗粒。

Ag PIII处理，可以采用脉冲弧源, 以纯银为阴极。Ag PIII处理工艺参数可以为：真空室温度为20～80℃，真空度为3×E-3～5×E-3Pa，注入电压为10～40kV，脉宽为300～800μs，频率为5～10Hz，处理时间为0.5～1.5h。

作为形成氧化钛涂层的基材，可使用适用于作为植入器械，如作为人工关节，接骨板，种植牙等的医用金属或合金，优选地为钛或钛合金。可采用商业二氧化钛粉末为原料、以各种适于在基材上形成涂层的工艺预先在基材上形成氧化钛涂层，例如采用大气等离子体喷涂技术。在基材上形成的氧化钛涂层相结构由金红石、锐钛矿及低氧氧化钛组成。然后在所述氧化钛涂层上，采用银等离子体浸没离子注入技术(Ag PIII)在氧化钛涂层表面制备“镶嵌式”纳米银颗粒。

本发明制备的银纳米颗粒/氧化钛复合抗菌涂层，主要具有以下特点：（1）银纳米颗粒为“镶嵌式”存在于涂层表面，其进入正常细胞产生细胞毒性的概率较小；（2）涂层表面银纳米颗粒的尺寸在2~25nm范围可调，且颗粒尺寸分布仅依赖Ag PIII处理工艺，不需要外部加热环节；（3）抗菌性能不依赖银离子释放，在黑暗中具有针对细菌壁不同功能的抗菌行为，且具有广谱抗菌特点；（4）MG63细胞能够在涂层表面快速粘附、铺展和增殖，具良好细胞相容性。

下面进一步列举实施例以详细说明本发明的示例制备工艺。应理解，下述实施例是为了更好地说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

（a）以医用纯钛为基材，采用大气等离子体喷涂技术在其表面喷涂氧化钛涂层，喷涂工艺参数为：等离子体气体Ar 的流量为40 slpm，等离子体气体H₂流量为12slpm，送粉气体Ar流量为3.0slpm，喷涂电压为60V，喷涂电流为600A，送粉角度为90^o，送粉率为20g/min，喷涂距离为100mm；X射线衍射分析表明喷涂所得氧化钛涂层相结构为金红石、锐钛矿及低氧氧化钛组成。（b）采用脉冲弧源, 以纯银为阴极，进一步对氧化钛涂层进行等离子体浸没离子注入处理，离子注入工艺参数为：真空室温度为20～30℃，真空度为3×E-3～4×E-3Pa，注入电压为10～15kV，脉宽为300～450μs，频率为5～7Hz，处理时间为0.5h；

图1为实施例1经等离子体浸没离子注入处理氧化钛涂层表面扫描电镜(SEM)形貌照片，可见离子注入处理后，氧化钛表面形成了尺寸为2-9纳米的颗粒，且尺寸集中分布于6nm附近；图2为实施例1经等离子体浸没离子注入处理氧化钛涂层表面X光电子能谱（XPS）测得的银3d高分辨谱，可见银在氧化钛表面以单质形式存在，氧化钛表面形成的纳米颗粒为金属银纳米颗粒。图3为实施例1金黄色葡萄球菌在所制得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层表面培养24h（黑暗中），脱水干燥后的对细菌形貌SEM照片，可见样品表面有细菌内容物质流出，显示该复合表面可破坏细菌壁完整性（形成孔洞），从而杀死细菌。

实施例2

（a）以医用纯钛为基材，采用大气等离子体喷涂技术在其表面喷涂氧化钛涂层，喷涂工艺参数为：等离子体气体Ar流量为40slpm，等离子体气体H₂流量为12slpm，送粉气体Ar流量为3.0slpm，喷涂电压为60V，喷涂电流为600A，送粉角度为90^o，送粉率为20g/min，喷涂距离为100mm；X射线衍射分析表明喷涂所得氧化钛涂层相结构为金红石、锐钛矿及低氧氧化钛组成。（b）采用脉冲弧源，以纯银为阴极，进一步对氧化钛涂层进行等离子体浸没离子注入处理，离子注入工艺参数为：真空室温度为25～35℃，真空度为4×E-3～5×E-3Pa，注入电压为10～15kV，脉宽为400～450μs，频率为6～8Hz，处理时间为1.0h；

图4为实施例2经等离子体浸没离子注入处理氧化钛涂层表面的SEM形貌照片，可见离子注入处理后，氧化钛表面形成了尺寸为2-6纳米的颗粒，且尺寸集中分布于5nm附近，XPS检测显示，这些颗粒为金属银颗粒。图5为实施例2金黄色葡萄球菌在所制得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层表面培养24h(黑暗中)，脱水干燥后的SEM照片，表明样品表面有细菌壁表面有“肿瘤状”凸起形成，显示该复合表面破坏了细菌壁的正常生理行为。

实施例3

（a）以医用钛合金(TC4)为基材，采用大气等离子体喷涂技术在其表面喷涂氧化钛涂层，喷涂工艺参数为：等离子体气体Ar流量为40slpm，等离子体气体H₂流量为12 slpm，送粉气体Ar流量为3.0slpm，喷涂电压为60V，喷涂电流为600A，送粉角度为90^o，送粉率为20g /min，喷涂距离为100 mm；X射线衍射分析表明喷涂所得氧化钛涂层相结构为金红石、锐钛矿及低氧氧化钛组成。（b）采用脉冲弧源，以纯银为阴极，进一步对氧化钛涂层进行等离子体浸没离子注入处理，离子注入工艺参数为：真空室温度为30～40℃，真空度为3×E-3～4×E-3Pa，注入电压为20～25kV，脉宽为400～450μs，频率为6～8Hz，处理时间为1.0h；

图6为实施例3经等离子体浸没离子注入处理氧化钛涂层表面的SEM形貌照片，可见离子注入处理后，氧化钛表面形成了尺寸为3-9纳米的颗粒，XPS检测显示，这些颗粒为金属银颗粒。将金黄色葡萄球菌接种于所得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层表面，并在黑暗中培养24h，脱水干燥后对细菌形貌进行SEM观察表明该复合表面具有显著抗菌性能。

实施例4

（a）以医用纯钛为基材，采用大气等离子体喷涂技术在其表面喷涂氧化钛涂层，喷涂工艺参数为: 等离子体气体Ar流量为40slpm，等离子体气体H₂流量为12slpm，送粉气体Ar 流量为3.0 slpm，喷涂电压为60V，喷涂电流为600A，送粉角度为90^o，送粉率为20g/min，喷涂距离为100mm；X射线衍射分析表明喷涂所得氧化钛涂层相结构为金红石、锐钛矿及低氧氧化钛组成。（b）采用脉冲弧源, 以纯银为阴极，先对氧化钛涂层进行低注入电压的等离子体浸没离子注入处理，离子注入工艺参数为:真空室温度为20～30℃，真空度为3×E-3～4×E-3Pa，注入电压为10～15kV，脉宽为300～450μs，频率为5～7Hz，处理时间为1.0h；再在高注入电压下进行等离子体浸没离子注入处理，工艺参数为：真空室温度为35～45℃，真空度为3×E-3～4×E-3Pa，注入电压为30～40kV，脉宽为450～550μs，频率为7～9Hz，处理时间为0.3h；

图7为实施例4经两步等离子体浸没离子注入处理氧化钛涂层表面的SEM形貌照片，可见离子注入处理后，氧化钛表面形成了尺寸为10-25纳米的颗粒，且尺寸分布集中于12nm附近，XPS检测显示，这些颗粒为金属银颗粒。图8为实施例4金黄色葡萄球菌在所制得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层表面培养24h（黑暗中），脱水干燥后的对细菌形貌的SEM照片，可见样品表面有细菌内容物质流出，显示该复合表面可破坏细菌壁完整性（形成孔洞），从而杀死细菌。

实施例5

（a）以医用纯钛为基材，采用大气等离子体喷涂技术在其表面喷涂氧化钛涂层，喷涂工艺参数为：等离子体气体Ar 流量为40slpm，等离子体气体H₂流量为12slpm，送粉气体Ar流量为3.0slpm，喷涂电压为60V，喷涂电流为600A，送粉角度为90^o，送粉率为20g/min，喷涂距离为100mm；X射线衍射分析表明喷涂所得氧化钛涂层相结构为金红石、锐钛矿及低氧氧化钛组成。（b）采用脉冲弧源，以纯银为阴极，对氧化钛涂层进行等离子体浸没离子注入处理，离子注入工艺参数为:真空室温度为35～50℃，真空度为3×E-3～4×E-3Pa，注入电压为30～40kV，脉宽为450～600μs，频率为7～10Hz，处理时间为0.5h；

图9为实施例5经等离子体浸没离子注入处理氧化钛涂层表面的SEM形貌照片，可见离子注入处理后，氧化钛表面形成了尺寸为5-25纳米的颗粒，XPS检测显示，这些颗粒为金属银颗粒。图10为实施例5金黄色葡萄球菌种在所得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层表面培养24h（黑暗中），脱水干燥后的SEM观察照片，表明样品表面有大量细菌内容物质流出，并且细菌壁上伴有“肿瘤状”凸起形成，显示该复合表面可破坏细菌壁完整性（形成孔洞），影响细菌壁的正常生理行为，从而杀死细菌。图11为实施例5大肠杆菌种在所得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层表面培养24h(黑暗中)，脱水干燥后的SEM观察照片，表明样品表面有大量细菌内容物质流出，并且细菌壁伴有“起皱”现象，显示该复合表面可破坏细菌壁完整性(形成孔洞)，影响细菌壁的正常生理行为，从而杀死细菌。样品在纯水中银离子释放测试结果显示，该复合涂层银离子释放极少，可见该涂层的抗菌性能不依赖于其离子释放过程，具有接触抗菌的特点。图12为实施例5 MG63细胞在所得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层表面培养1、3、9天的AlamarBlue 评价结果，显示所得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层具有良好的细胞相容性，MG63细胞能够在涂层表面快速粘附、铺展和增殖，显示出涂层良好的细胞相容性。

实施例6

（a）以医用纯钛为基材，采用大气等离子体喷涂技术在其表面喷涂氧化钛涂层，喷涂工艺参数为: 等离子体气体Ar 流量为40slpm，等离子体气体H₂流量为12slpm，送粉气体流量为Ar3.0slpm，喷涂电压为60V，喷涂电流为600A，送粉角度为90^o，送粉率为20g/min，喷涂距离为100mm；X射线衍射分析表明喷涂所得氧化钛涂层相结构为金红石、锐钛矿及低氧氧化钛组成。（b）采用脉冲弧源, 以纯银为阴极，对氧化钛涂层进行等离子体浸没离子注入处理，离子注入工艺参数为:真空室温度为50～80℃，真空度为3×E-3～4×E-3Pa，注入电压为30～40kV，脉宽为450～800μs，频率为7～10Hz，处理时间为1.5h；

图13为实施例6经等离子体浸没离子注入处理氧化钛涂层表面的SEM形貌照片，可见离子注入处理后，氧化钛表面形成了尺寸为4-24纳米的颗粒，且尺寸分布集中于4nm和16nm附近，XPS检测显示，这些颗粒为金属银颗粒。（d）图14为实施例6金黄色葡萄球菌种在所得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层表面培养24h（黑暗中），脱水干燥后SEM观察照片，表明样品表面有大量细菌内容物质流出，并且细菌壁上伴有“肿瘤状”凸起形成，显示该复合表面可破坏细菌壁完整性（形成孔洞），影响细菌壁的正常生理行为，从而杀死细菌；

图15为实施例6大肠杆菌种在所得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层表面培养24h(黑暗中)，脱水干燥后的SEM观察照片，表明样品表面有大量细菌内容物质流出，并且细菌壁伴有“起皱”现象，显示该复合表面可破坏细菌壁完整性（形成孔洞），影响细菌壁的正常生理行为，从而杀死细菌。样品在纯水中银离子释放测试结果显示，该复合涂层银离子释放极少，可见该涂层的抗菌性能不依赖于其离子释放过程，具有接触抗菌的特点。图16为实施例6 MG63细胞在所得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层表面培养1天，脱水干燥后SEM观察照片，显示MG63细胞能够在所得涂层表面快速粘附、铺展和增殖。图17为实施例6 MG63细胞在所得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层表面培养1、3、9天的AlamarBlue 评价结果，显示所得银纳米颗粒/氧化钛复合涂层具有良好的细胞相容性。

产业应用性

本发明抗菌涂层及其制备方法提高植入体表面抗菌性能，解决游离态银纳米颗粒抗菌行为和生物毒性不易控制的问题，可用于改善可植入医疗器械（如人工骨、人工关节和牙种植体）表面的抗菌性能，具有实用价值。

Claims

1.一种抗菌涂层的制备方法，其特征在于，以医用金属或合金作为基材，先在基材上制备氧化钛涂层，然后采用银等离子体浸没离子注入工艺将银离子注入到氧化钛涂层上，形成银纳米颗粒镶嵌在氧化钛表面的结构。

2.根据权利要求1所述的抗菌涂层的制备方法，其特征在于，所述银纳米颗粒尺寸在2-25nm范围可调。

3.根据权利要求1所述的抗菌涂层的制备方法，其特征在于，所述银等离子体浸没离子注入工艺，采用脉冲弧源，以纯银为阴极，在真空室内进行。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗菌涂层的制备方法，其特征在于，在所述注入工艺中，真空室温度为20～80℃，真空度为3×E-3～5×E-3Pa，注入电压为10～40kV, 脉宽为300～800μs, 频率为5～10Hz，真空室内的处理时间为0.5～1.5h。

5.根据权利要求1所述的抗菌涂层的制备方法，其特征在于，所述制备氧化钛涂层的方法采用大气等离子体喷涂方法。

6.根据权利要求1所述的抗菌涂层的制备方法，其特征在于，所述医用金属或合金为医用纯钛或钛合金。

7.根据权利要求1所述的抗菌涂层的制备方法，其特征在于，所述氧化钛涂层相结构由金红石、锐钛矿及低氧氧化钛组成。

8.一种抗菌涂层，其特征在于，所述抗菌涂层由权利要求1至7中任一种制备方法制备。