CN102578030A - 富硒土鳖虫饲养方法、冻干粉胶囊、蛋白质水解液及药用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种富硒土鳖虫饲养方法、冻干粉胶囊、蛋白质水解液及药用。它解决了技术药用效果不佳等技术问题。饲养方法包括下述内容：A、饲养场地建设；B、饲养土配制；C、饲料配制；D、放养密度；E、病虫害预防。上述富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫冻干粉胶囊、富硒土鳖虫蛋白质水解液。本富硒土鳖虫饲养方法、冻干粉、蛋白质水解液及药用的优点在于：易于实施，培养所得的土鳖虫富含人体所需的有益成分，特别是富含硒和锌，药用价值高。

Description

富硒土鳖虫饲养方法、冻干粉胶囊、蛋白质水解液及药用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种富硒土鳖虫饲养方法、冻干粉胶囊、蛋白质水解液及药用。

背景技术

作为传统中药的土鳖虫又名地鳖虫、土元、地乌龟、蟅虫，为鳖蠊科昆虫地鳖或冀地鳖的雌虫干燥体。其性寒，味苦，有小毒，归肝经，又破淤血，续筋骨之功效，主要用于筋骨折伤，淤血经闭，症瘕痞块。研究表明土鳖虫具有许多药理活性，如抗凝血、抗血栓作用，促纤溶作用，抗肝纤维化作用，抗肿瘤作用，红细胞免疫作用和保护血管内皮作用等。土鳖虫在医药、保健及健康食品等方面具有许多独特的功能，正越来越受到国内外专业人士和消费者的关注。土鳖虫含有氨基酸、蛋白质、生物碱、脂肪酸、酚类、糖类、甾体及多种微量元素等。其中氨基酸为土鳖虫的主要成分，总量约占土鳖虫的40％，在17种游离及水解氨基酸中，有7种是人体必需氨基酸。

有实验研究证明土鳖虫蛋白提取物对S180肉瘤荷瘤小鼠有显著的抑制作用，纯化得到的活性蛋白对鸡胚尿囊膜新生血管的生成有明显的抑制作用，且对鸡胚生长发育的影响较小，这说明土鳖虫蛋白提取物有良好的体内抑制肿瘤作用及血管生成抑制活性。通过噻唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测土鳖虫纤溶活性蛋白对2种肿瘤细胞(人食管癌细胞株Eca109和人宫颈癌细胞株HeLa)的增殖抑制及周期的影响，结果发现土鳖虫纤溶活性蛋白对肿瘤细胞的增殖抑制率与剂量和时间密切相关，随着土鳖虫纤溶活性蛋白浓度的增加，G1期细胞数量明显减少，G2/M期的细胞数量有所增加，说明土鳖虫纤溶活性蛋白具有体外抑制肿瘤细胞的作用。

为了进一步开发土鳖虫作为药物的应用，人们进行了长期的探索，提出了各种各样的方案。例如，中国专利文献公开了一种从中药土鳖虫中分离、提取抗肿瘤的有效部位脂肪酸的方法[申请号：200510040664.1]，该方案采用将土鳖虫经有机溶剂提取得粗脂肪酸，再经柱层析法分离得有效部位脂肪酸，主要包括7-十八碳烯酸、十六烷酸、9-十六碳烯酸、十八酸。上述方案能够提取到土鳖虫中真正具有抗肿瘤作用和疗效的脂肪酸成分，并经实验证实单味中药土鳖虫有机溶剂提物具有广谱杀瘤作用，可用于治疗多种恶性肿瘤。解决了过去无法确定土鳖虫中哪一具体成分具有抗肿瘤功效以及无法提取有效部位的缺陷。还有人发明了一种土鳖虫的仿生酶解产物及其用途[申请号：200810118148.X]，其技术方案是采用仿生酶解的方法，取土鳖虫，加水匀浆后，在适当的条件下，先以胃蛋白酶保温酶解，再以胰酶或胰蛋白酶保温酶解，所得的酶解物按不同的制剂要求制成制剂。该方案的产物在治疗心脑血管疾病及跌打损伤等方面具有良好效果。

上述方案虽然在一定程度上改善了土鳖虫作为药物的应用，提升了土鳖虫的药用价值，但是所采用的土鳖虫均为人工普通养殖或野生土鳖虫，土鳖虫药材的营养价值、微量元素含量、有害重金属含量等方面存在着技术瓶颈。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种易于实施，成本较低，能够获得高品质的富硒土鳖虫的饲养方法。

本发明的另一目的是提供一种富硒土鳖虫冻干粉胶囊。

本发明的还有一目的是提供一种富硒土鳖虫蛋白质水解液。

本发明的再有一目的是提供一种富硒土鳖虫作为抗肿瘤药物的应用或者作为抗氧化药物的应用。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本富硒土鳖虫饲养方法，其特征在于，本饲养方法包括下述内容：

A、饲养场地建设：建立多层饲养槽，每层间隔45cm-55cm，相邻的两饲养槽之间间隔80cm-120cm，在饲养槽内壁进行粉刷，并在饲养槽内壁上缘周边设置防止土鳖虫逃逸的阻挡体，在饲养槽底部铺设10cm-15cm饲养土；

B、饲养土配制：取土后用3mm-5mm的筛子过筛，然后掺入草木灰混合均匀后形成饲养土，饲养土的湿度为含水量55％-65％；

C、饲料配制：饲料包括下述重量份数的成分：干的青饲料28-32wt％、豆饼28-32wt％、富硒酵母0.8-1.2wt％、虾粉4-6wt％，麦麸32-36wt％，然后加入占上述所有成分总重量10-20％的水，并混合均匀；

D、放养及放养密度：以每一次蜕皮按龄计算，选用9-11龄的雌性土鳖虫在饲养场地进行养殖，放养密度为每平方米1.5～2万只，每天傍晚5～6时或2～3天投喂上述饲料，每次饲料投放量为土鳖虫总重量的8-12％；

E、病虫害预防：

①在饲养前，将备好的饲养土先经阳光曝晒消毒；将曝晒消毒好的饲养土在未放入饲养槽之前，用消毒液匀喷洒饲养土，经1周后将饲养土放进饲养槽饲养土鳖虫；饲养期间每隔20～30天更换1次饲养土，长期保持饲养土清洁无霉败；

②严格控制饲料不带螨类入池，饲料先用微火炒熟杀灭螨类；

③注意饲养槽清洁卫生，及时除去坏死卵鞘和死虫，喂料不过量。

在上述的富硒土鳖虫饲养方法中，所述的富硒酵母为啤酒酵母；所述的阻挡体由玻璃制成；所述的饲料还包括磷酸氢钙、大麦、油下脚料、鱼粉、玉米、米糠和南瓜和青饲料中的任意一种或多种。这里的青饲料通常为蔬菜等绿叶植物。

在上述的富硒土鳖虫饲养方法中，本饲养方法包括治螨，所述的治螨包括下述措施中的任意一种或多种的组合：①将饲养槽的剩余饲料连同饲养土表层刮出1.5～3.0cm，清除初发生的螨类；②用炒熟的糠麸、豆粉诱饵在白天诱除螨类；傍晚取出诱饵灭杀处理；③在螨类成灾时，彻底更换全部饲养土；先将土鳖虫从饲养土中筛出，移入装有干燥细沙容器中，让土鳖虫在沙中爬行至少半小时，摩擦掉寄生在土鳖虫体上的螨类，同时烧烤饲养槽，烧死饲养槽内残留螨后，再换入经检查无螨的饲养土饲养；④药剂喷治：先将饲养槽土鳖虫从饲养土中筛出，取30％三氯杀螨砜用1∶400倍稀释液拌入饲养槽内饲养土，每立方米饲养土用药45-55g。

在上述的富硒土鳖虫饲养方法中，所述的消毒液由下述方式制得：取生石灰0.5-2份、硫磺1-3份、水12-15份，混合后煮50-70分钟，过滤后即得消毒液。

在上述的富硒土鳖虫饲养方法中，本饲养方法养殖而成的土鳖虫经干燥成药材后包括下述成分：粗蛋白含量65-68wt％、Se含量6-80.5058μg/g^-1、Zn含量320-360μg/g^-1、不饱和脂肪酸含量占总脂肪油的73-75wt％、油酸含量占总脂肪油的40-42wt％、亚油酸含量占总脂肪油的21-23wt％。

上述富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫冻干粉胶囊。

本冻干粉胶囊通过下述方式制得：本冻干粉胶囊通过下述方式制得：取富硒土鳖虫药材，粉碎并过75-85目筛，冷冻干燥，低温间歇灭菌后，得土鳖虫冻干粉粉末，然后按冻干粉∶乳糖为75～85∶25～15的比例混匀后，直接装胶囊，即得。

上述富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫蛋白质水解液。

本富硒土鳖虫蛋白质水解液通过下述方式制得：①取净制的富硒土鳖虫碾碎，用石油醚在70℃脱脂4h，其中土鳖虫和石油醚的重量比为1∶3，得到经过预处理的土鳖虫备用；②称取经过预处理的土鳖虫，加入缓冲液，固液比为1∶7，pH为5，冷浸过夜，再加胰蛋白酶，且胰蛋白酶与土鳖虫比250U·g^-1，在60℃水浴中加热酶解一小时后，灭酶、抽滤、精密吸取滤液，将滤液置于容器中，即得富硒土鳖虫蛋白质水解液。

富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫作为抗肿瘤药物的应用或者作为抗氧化药物的应用。

与现有的技术相比，本富硒土鳖虫饲养方法、冻干粉、蛋白质水解液及药用的优点在于：易于实施，培养所得的土鳖虫富含人体所需的有益成分，特别是富含硒和锌，药用价值高，用于保护脏器少受自由基的伤害，可预防由衰老引起的多种慢性疾病等症；通过增强机体免疫力，提高抗肿瘤功效。

具体实施方式

一、本富硒土鳖虫饲养方法包括下述内容：

A、饲养场地建设：建立多层饲养槽，每层间隔45cm-55cm，相邻的两饲养槽之间间隔80cm-120cm，在饲养槽内壁进行粉刷，并在饲养槽内壁上缘周边设置防止土鳖虫逃逸的阻挡体，在饲养槽底部铺设10cm-15cm饲养土；

B、饲养土配制：取土后用3mm-5mm的筛子过筛，然后掺入草木灰混合均匀后形成饲养土，饲养土的湿度为含水量55％-65％；

C、饲料配制：饲料包括下述重量份数的成分：干的青饲料28-32wt％、豆饼28-32wt％、富硒酵母0.8-1.2wt％、虾粉4-6wt％，麦麸32-36wt％，然后加入占上述所有成分总重量10-20％的水，并混合均匀；

D、放养及放养密度：以每一次蜕皮按龄计算，选用9-11龄的雌性土鳖虫在饲养场地进行养殖，放养密度为每平方米1.5～2万只，每天傍晚5～6时或2～3天投喂上述饲料，每次饲料投放量为土鳖虫总重量的8-12％；

E、病虫害预防：

①在饲养前，将备好的饲养土先经阳光曝晒消毒；将曝晒消毒好的饲养土在未放入饲养槽之前，用消毒液匀喷洒饲养土，经1周后将饲养土放进饲养槽饲养土鳖虫；饲养期间每隔20～30天更换1次饲养土，长期保持饲养土清洁无霉败；

②严格控制饲料不带螨类入池，饲料先用微火炒熟杀灭螨类；

③注意饲养槽清洁卫生，及时除去坏死卵鞘和死虫，喂料不过量。

这里的富硒酵母为啤酒酵母；阻挡体由玻璃制成；饲料还包括磷酸氢钙、大麦、油下脚料、鱼粉、玉米、米糠和南瓜和青饲料中的任意一种或多种。

本饲养方法包括治螨，所述的治螨包括下述措施中的任意一种或多种的组合：①将饲养槽的剩余饲料连同饲养土表层刮出1.5～3.0cm，清除初发生的螨类；②用炒熟的糠麸、豆粉诱饵在白天诱除螨类；傍晚取出诱饵灭杀处理；③在螨类成灾时，彻底更换全部饲养土；先将土鳖虫从饲养土中筛出，移入装有干燥细沙容器中，让土鳖虫在沙中爬行至少半小时，摩擦掉寄生在土鳖虫体上的螨类，同时烧烤饲养槽，烧死饲养槽内残留螨后，再换入经检查无螨的饲养土饲养；④药剂喷治：先将饲养槽土鳖虫从饲养土中筛出，取30％三氯杀螨砜用1∶400倍稀释液拌入饲养槽内饲养土，每立方米饲养土用药45-55g。本实施例中的消毒液由下述方式制得：取生石灰0.5-2份、硫磺1-3份、水12-15份，混合后煮50-70分钟，过滤后既得消毒液。

通过本饲养方法养殖而成的土鳖虫经干燥成药材后包括下述成分：粗蛋白含量65-68wt％、Se含量6-80.5058μg/g^-1、Zn含量320-360μg/g^-1、不饱和脂肪酸含量占总脂肪油的73-75wt％、油酸含量占总脂肪油的40-42wt％、亚油酸含量占总脂肪油的21-23wt％。

具体实施例如下：直接取土，用4mm的筛子过筛，掺上适当草木灰即可。土的干湿度都要求含水量在60％左右(“手捏成团，轻按即散”)。饲养土厚度10-15cm，每隔1-2周可用细筛将饲养土过筛一遍，去掉食物残渣消毒后即可再次使用。根据土鳖虫生长过程中能量消耗需求，确定基础饲料配方(每100g干饲料为单位)：干的青饲料(蔬菜叶)30g、豆饼30g、富硒酵母1g、虾粉5g、麦麸34g。加水10-20ml，拌匀，用手抓成团，松手即散为适宜。制成块状食料。每kg饲料含硒量20mg，碳氮比均衡在48～50(产卵期提高到55)，以促进土鳖虫的生长发育。土鳖虫习性昼伏夜出。每天18～24时为活动、吃食高峰期。一次吃食后2～3天潜伏在土中不动，人工饲养需每天傍晚5～6时或2～3天投喂饲料。喂食方法分为三种：①把饲料团成小团，分点喂食(适用于幼虫)。②把饲料撒在饲养土表面(适用于中虫)。③用15×15cm的塑料薄膜做成食台，饲料放在食台上(适用于成虫)。根据实际需要，选择喂食方法。

与普通饲养方法相比，本发明饲养方法获得的土鳖虫药材的水分含量、总灰分、酸不溶性灰分、水浸出物含量没有很大差异，符合《中国药典》中土鳖虫质量检查项规定，但两者在粗蛋白含量有所差异。普通饲养方法获得的土鳖虫药材粗蛋白含量约为61.69％，而本发明饲养方法获得的土鳖虫药材的粗蛋白含量为67.19％，可见本发明饲养方法获得的土鳖虫药材营养价值略高于普通饲养方法获得的土鳖虫药材。元素的测定结果看，两者均含有丰富的微量元素且存在明显的差异。其中Fe、Zn、Mn、Cu、Mg为两者主要的微量元素。这些元素对人体有直接的影响作用，并参与许多新陈代谢的过程。此外，两者尚含有Pb、As、Hg等重金属元素。参照药用植物及制剂外经贸绿色行业标准(WM/T2-2004)，有害重金属Pb、As、Hg的含量符合标准。更为重要的是：本发明饲养方法获得的土鳖虫药材中尚含有较高的Zn、Cu、Se等元素。Zn对生物体内的免疫功能起调节作用，并能通过酶系统发挥对机体代谢的调节和控制，硒具有延缓衰老、抑癌抗癌、抗辐射等作用。肿瘤病人血清铜/锌比值升高，血清铜、硒含量显著下降，肿瘤患者免疫功能下降与缺锌有关，补锌可调节肿瘤患者免疫功能，本发明饲养方法获得的土鳖虫药材Zn、Se等微量元素含量明显升高，可能与其抑制肝癌、胃癌等癌细胞的功能有一定的相关性。经本发明人试验分析：普通饲养土鳖虫药材饱和脂肪酸占25％，不饱和脂肪酸占72.11％；本发明饲养方法获得的土鳖虫药材饱和脂肪酸占23.37％，不饱和脂肪酸占74.19％，本发明饲养方法获得的土鳖虫药材不饱和脂肪酸的含量高于普通饲养土鳖虫药材。不饱和脂肪酸对人体有降血压、降血脂、抗血栓、抗动脉硬化、预防心血管病、增强记忆力、预防老年痴呆、防癌等多种功效。

表1-1：本实施例中普通饲养方法与本发明饲养方法获得的土鳖虫药材微量元素测定结果：

表1-2：本发明饲养方法获得的土鳖虫药材脂肪酸含量

共鉴定出6种化合物，占总量的97.56％，其中饱和脂肪酸占23.37％，不饱和脂肪酸占74.19％。

普通饲养方法获得的土鳖虫药材分离出的油酸含量为38.84％，亚油酸含量为22.10％。本发明饲养方法获得的土鳖虫药材分离出的油酸的含量为40.78％，亚油酸含量为21.86％，油酸、亚油酸是人体的必需脂肪酸，是组织细胞的组成成分，它在体内参与磷脂的合成，并以磷脂的形式存在于线粒体和细胞膜中。必需脂肪酸还可以保护皮肤免受射线损伤，可降低血中胆固醇，防止动脉粥样硬化及减小血小板豁附性作用；缺乏必需脂肪酸会出现皮炎，抵抗力减弱，生长停滞。

综合上述分析，本发明饲养方法获得的土鳖虫药材的营养价值较高，相较于普通饲养方法获得的土鳖虫药材具有较大的开发利用潜力。

二、富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫冻干粉胶囊。

本冻干粉胶囊通过下述方式制得：取富硒土鳖虫药材，粉碎并过75-85目筛，冷冻干燥，低温间歇灭菌后，得土鳖虫冻干粉粉末，然后按冻干粉∶乳糖为75～85∶25～15的比例混匀后，直接装胶囊，即得。

更具体地说，将养成的土鳖虫用20目筛过滤，去除泥土和食物残渣，90-100℃沸水烫死后，迅速捞出，流冲洗3次以上，去除附着在虫体表面的沙土，沥干。挑选大小均一，个体饱满，无病害的土鳖虫个体，置-10至-20°冰箱预冷冻12h以上。将冻干箱-40°预冷冻1至2h，再将样品置于冻干箱中冷冻2至4h，使水分充分冻结。冷阱温度达到-50℃左右，设定真空冷冻干燥机的各种参数，进行真空冷冻干燥。冷冻干燥分两个阶段，冻干开始时，隔板不加热，通过外界辐射为升华过程提供热量，冻干10h左右；升华干燥阶段基本完结后，进入解析干燥阶段，启动加热程序，使隔板温度达到40℃，当物料中心温度接近加热温度时，结束冻干操作。将冻干药材置中药粉碎机粉碎，过80目筛，即得土鳖虫冻干粉。间歇低温灭菌是指：将土鳖虫冻干粉置流通蒸汽灭菌器或灭菌蒸锅内，平铺厚度不超过1cm，加热至70-80℃后维持60min，将其中的细菌繁殖体杀死，取出置恒温培养箱37℃培养24h，让其中的芽胞发育成为繁殖体，再次同法灭菌，共加热灭菌3次。将灭菌后的冻干粉置恒温干燥箱中，平铺厚度不超过1cm，60-70℃干燥，至水分含量小于8％，分装。整个操作在无菌环境中完成。

辅料的筛选：辅料对制剂成型有着举足轻重的作用，它直接影响着制剂的质量优劣。恰当的辅料方可制出外观良好、质量稳定、释放性能好、患者容易接受的制剂。中药制剂常用的辅料有淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、羟丙甲纤维素(HPMC)、微晶纤维素(MC)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，但山梨醇、PVP、HPMC等价格较贵，病人难以承受这种高消费的药品，所以拟选用淀粉、糊精、微晶纤维素和乳糖、蔗糖等作为辅料进行筛选，得最佳辅料种类及用量。经本发明人试验，淀粉、糊精对土鳖虫冻干粉的吸湿性无明显改善；而微晶纤维素虽然能明显改善其的吸湿性，但价格昂贵；蔗糖的吸湿速率和平衡吸湿率均较小，但却显著增加了平衡吸湿的时间，并且蔗糖长时间在空气中易出现变硬结块，导致药材的流动性减低，有效成分活性下降，甚至产生霉变现象；而乳糖能够显著减缓土鳖虫冻干粉的吸湿速率，减少平衡吸湿时间和平衡吸湿率，且吸湿后能够保持土鳖虫冻干粉的固体粉末状，休止角也较小，且吸湿性和流动性均明显优于其它辅料，可考虑作为土鳖虫冻干粉胶囊的单一辅料的最佳选择。

添加乳糖辅料后土鳖虫冻干粉的吸湿性随着辅料所占比例的的增加而显著降低。分别以吸湿加速度和平衡吸湿率为考察指标，吸湿拟合曲线的可靠性得到进一步验证。同时土鳖虫冻干粉中加入20％的乳糖辅料的吸湿率较低，且不同比例乳糖和土鳖虫冻干粉混合所制粉末的外观变化也不大，吸湿后仍能保持其粉末状，休止角小于40°，可以满足生产过程中流动性的需求。根据吸湿效果和生产成本综合考虑土鳖虫冻干粉中加入20％的乳糖辅料较为适宜。

因此，取富硒土鳖虫药材，粉碎，过80目筛，冷冻干燥，低温间歇灭菌后，得土鳖虫冻干粉粉末，按冻干粉∶乳糖为80∶20的比例加入乳糖，混匀后，直接装胶囊，即得。功能主治：抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力。用于保护脏器少受自由基的伤害，可预防由衰老引起的多种慢性疾病等症；通过增强机体免疫力，提高抗肿瘤功效。用法用量：口服，一次3粒，一日2次。土鳖虫冻干粉与乳糖(80∶20)所制土鳖虫冻干粉胶囊，其粉末混合均匀、流动性佳、质量稳定，且其吸湿率远低于药典规定的9％的限度，因此根据吸湿效果和生产成本，考虑土鳖虫冻干粉中加入20％的乳糖辅料较为适宜。

土鳖虫冻干粉胶囊的成型工艺：取富硒土鳖虫药材，粉碎，过80目筛，冷冻干燥后，紫外灭菌，得土鳖虫冻干粉粉末，按冻干粉∶乳糖＝80∶20的比例加入乳糖，混匀后，直接装胶囊，即得。经测定，土鳖虫冻干粉胶囊粉末的临界相对湿度约为67％，结果表明：土鳖虫冻干粉胶囊生产和贮存环境的相对湿度应控制在RH＜70％，药材不容易吸湿。

富硒土鳖虫冻干粉胶囊急性毒性试验研究。急性毒性试验是测试新药对人体毒性强弱的一种重要手段，且可为长期毒性试验、生殖毒性试验和致突变试验等试验设计提供剂量选择依据和有关毒性信息，因此急性毒性试验对药物开发和应用是非常必要的。为了对富硒土鳖虫冻干粉胶囊的安全性作出评价，根据卫生部药政管理局《中药新药研究指南》，本研究对小鼠灌胃给予富硒土鳖虫冻干粉胶囊的急性毒性进行评价，以期为富硒土鳖虫冻干粉胶囊临床安全用药提供依据。现将研究结果报告如下。

①实验动物昆明种小鼠，140只，雄雌各半，体重20±2g，由中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司提供，清洁级。动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005。实验前适应环境饲养1晚上，自由摄食、饮水，室内温度18℃-28℃，相对湿度45％-60％。

②实验药品与试剂：富硒土鳖虫冻干粉胶囊(由浙江中医药大学制剂室提供，批号：080701)，所用试剂均为分析纯。

③实验方法

a、半数致死量(LD50)的测定：

预试验：取昆明种小鼠50只，体重20±2g，实验随机分为5组，分别为8.000g·kg^-1、6.000g·kg^-1、4.500g·kg^-1、3.375g·kg^-1和2.531g·kg^-1剂量组，各剂量组间间距为0.75。小鼠按剂量分别一次性灌胃给予富硒土鳖虫冻干粉胶囊，给药前禁食不禁水12h。在给药后的24h内，根据《中药、天然药物毒性研究技术指导原则》的毒性反应指标多次观察小鼠的毒性反应和死亡情况，以后每天观察一次，连续观察7天，记录小鼠毒性反应及死亡数量，找出引起小鼠0％和100％死亡率剂量所在的范围。

b、正式试验：在预试验所获得的0％和100％的致死量范围内，确定组间的比值。取昆明小鼠50只，体重20±2g，随机分为5组。各组小鼠按剂量分别一次性灌胃给药，给药前禁食不禁水12h。连续观察7天，记录动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等。对濒死及死亡动物应及时进行尸体解剖，其他动物在观察期结束后进行尸体解剖，当发现器官出现体积、颜色、质地等改变时，则对改变的器官进行组织病理学检查，根据检查结果初步判断可能的毒性靶器官。

实验完毕后，清点各组死亡鼠数，算出死亡率，按改良寇氏法公式进行计算 LD₅₀＝log^-1[X_m-i(∑P-0.5)]

X_m：最大剂量组剂量的对数值i：相邻两组比值的对数(相邻两组对数剂量的差值)

n：每组动物数；S_X50：logLD₅₀的标准误X50＝logLD₅₀

LD₅₀的95％可信限＝[log(X50±1.96S_X50)]^-1

LD₅₀的平均可信限＝LD₅₀±(LD₅₀的95％可信限的高限-低限)/2

c、最大耐受量(MTD)的测定：

因富硒土鳖虫冻干粉胶囊毒性低，半数致死量(LD₅₀)的测定测不出LD₅₀。故进行最大耐受量试验。

实验随机分为2组，分别为给药组和空白对照组，每组20只，雌雄各半，给药前禁食12h。给药组：以富硒土鳖虫冻干粉胶囊最大浓度(0.20g·mL^-1)，小鼠最大灌胃容积(0.40mL·10g^-1BW)灌胃给药，3次/1天，每次间隔5h。空白对照组：灌胃等容积2％CMC-Na溶液，给药后按常规饲养。

给药后，连续观察14天。于给药当天，给药后第2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天分别称取存活动物体重；观察动物饮食、外观、行为、分泌物、排泄物及中毒情况，观察时间为实验当天药后，第2-14天每天早上9:00；对濒死及死亡动物及时解剖，肉眼观察其主要脏器(心、脑、肝、脾、肾、肺)的变化，发现病变器官则进行病理组织形态学检查，并记录动物中毒症状和死亡数。其他动物在观察期结束后进行大体解剖，当发现器官出现体积、颜色、质地等改变时，则对改变的器官进行组织病理学检查。计算方法：

实验数据采用SPSS11.0统计分析软件进行统计学处理，所得结果以均数±标准差

表示。各组实验数据先进行χ²正态性检验和方差分析，若符合正态分布和方差齐性，则采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。取P＜0.05作为显著性差异水平。

d、半数致死量(LD₅₀)的测定

经预实验，小鼠一次灌胃给予不同剂量富硒土鳖虫冻干粉胶囊后，连续观察7天，精神状态良好，饮食、粪便正常，体重增加，无一动物死亡；第8天处死动物，观察内脏器官无明显改变。表明富硒土鳖虫冻干粉胶囊毒性小，无法计算出LD₅₀，结果见表2-1。

表2-1：富硒土鳖虫冻干粉胶囊对小鼠的急性毒性作用(n＝10)

e、最大耐受量(MTD)的测定

试验连续观察14天，各组小鼠一般情况良好，活动自如，毛发光滑，摄食、二便未见明显异常，富硒土鳖虫冻干粉胶囊各给药组小鼠体重逐日增长，与对照组比较差异(P＜0.05)，无一动物死亡。试验结束处死小鼠，大体解剖检查小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，未见脏器肿大、萎缩、坏死等异常现象。急性毒性试验结果见表2-2。

表2-2：对小鼠一般情况的影响(n＝20)

注：“-”表示情况正常

体重变化情况：给药前和给药后的第2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天，称取小鼠体重，体重均有不同程度的增长，经组间两两比较，小鼠体重差异无统计学意义(P＞0.05)，结果见表2-3。

表2-3 对小鼠体重的影响(

n＝20)

结论：富硒土鳖虫冻干粉胶囊对小鼠进行急性毒性试验，经半数致死量(LD₅₀)测定的预试验结果表明，富硒土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组、中剂量组和高剂量组，经灌胃给药后，均未引起小鼠死亡，未能测出半数致死量(LD₅₀)；最大耐受量试验以富硒土鳖虫冻干粉胶囊最高浓度(0.20g·mL^-1)、最大灌胃容积(0.40mL·10g^-1BW)，1日灌胃给药3次，连续观察14天，小鼠一般情况良好，活动自如、毛发光滑、摄食饮水及二便未见异常，体重增长，无一动物死亡。

最大耐受量试验测得小鼠最大耐受量为24g·kg^-1BW·d^-1，相于临床用量的960倍(成人日服生药剂量1.5g·60kg^-1BW·d^-1)。按体重计算，小鼠1天最大给药量相当于成人临床日用剂量的100倍以上就认为药物使用较为安全。富硒土鳖虫冻干粉胶囊毒性小，安全范围大，可供临床用药。

三、富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫蛋白质水解液。

本富硒土鳖虫蛋白质水解液通过下述方式制得：①取净制的富硒土鳖虫碾碎，用石油醚在70℃脱脂4h，其中土鳖虫和石油醚的重量比为1∶3，得到经过预处理的土鳖虫备用；②称取经过预处理的土鳖虫，加入缓冲液，固液比为1∶7，pH为5，冷浸过夜，再加胰蛋白酶，且胰蛋白酶与土鳖虫比250U·g^-1，在60℃水浴中加热酶解一小时后，灭酶、抽滤、精密吸取滤液，将滤液置于容器中，即得富硒土鳖虫蛋白质水解液。

四、富硒土鳖虫作为抗肿瘤药物的应用

富硒土鳖虫作为抗肿瘤药物的动物实验如下：

1 实验材料

主要仪器：BS110S电子天平(北京赛多利斯有限公司)；MK-3型酶标仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司)；80-2B型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；AB135-S型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；DT系列电子台秤(江苏常熟长春仪器仪表厂)；移液枪、解剖用器材

瘤株和动物：瘤株取自H₂₂肿瘤小鼠。试验动物：ICR小鼠54只，雄性，体重为20-22g；由浙江省医学科学院浙江中医药大学动物实验中心提供，清洁级。试验动物使用许可证号：SYXK(浙)2008-0116。实验前适应环境饲养1w，自由摄食、饮水，室内温度18℃-28℃，相对湿度45％-60％。

药材和试剂：土鳖虫冻干粉胶囊；生理盐水注射液(杭州民生药业集团有限公司，批号：41009101)；甲醛溶液(杭州高晶精细化工有限公司，批号：080121)5-氟脲嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司，批号：1003042)；扰素(IFN-γ)ELISA检测试剂盒(博士德生物科技有限公司，批号：97679)；肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA检测试剂盒(博士德生物科技有限公司，批号：2416104)；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。

2 实验方法

动物分组和造模：将小鼠随机分成6组，每组8-10只：土鳖虫冻干粉胶囊粉末混悬液高剂量组、土鳖虫冻干粉胶囊粉末混悬液中剂量组、土鳖虫冻干粉胶囊粉末混悬液低剂量组、阳性对照组、空白组和模型组。无菌条件下，抽取接种7天的荷瘤小鼠的腹水，按1∶4比例用生理盐水稀释成1×107个细胞/mL，皮下接种在各组小鼠的右上肢腋下，0.2mL/只。

土鳖虫冻干粉胶囊粉末混悬液高剂量组：每日灌胃给予0.96g/kg冻干粉混悬液。

土鳖虫冻干粉胶囊粉末混悬液中剂量组：每日灌胃给予0.48g/kg冻干粉混悬液。

土鳖虫冻干粉胶囊粉末混悬液低剂量组：每日灌胃给予0.24g/kg冻干粉混悬液。

阳性对照组：每日灌胃给予20mg/kg 5-氟脲嘧啶(5-Fu)溶液。

空白对照组和模型组：每日灌胃给予同体积的生理盐水。

以上各组小鼠按0.20mL/10g体重每日灌胃一次，造模前提前灌胃给药，连续给药14天。

指标测定血清的制备：末次给药24h后，称重，小鼠眼球取血，37℃水浴30min，离心3500r/min，10min，分离血清，至4℃冰箱中保存备用。

小鼠脱臼处死，取出肿瘤块、脾脏及胸腺，用冰冷生理盐水漂洗，除去血液，滤纸吸干，称重，计算抑瘤率、脾脏和胸腺指数。

抑瘤率＝(1-试验组平均瘤重/模型对照组平均瘤重)×100％

胸腺指数＝胸腺平均重量(mg)/平均体重(g)

脾脏指数＝脾脏平均重量(mg)/平均体重(g)

生化指标的测定

按照INF-γ和TNF-a试剂盒的说明，测定血清中，INF-γ、TNF-a的浓度。

组织病理学切片检查：肿瘤组织石蜡切片程序：组织固定→流水冲洗30min→80％乙醇脱水1h×1次→95％乙醇脱水1h×2次→100％乙醇脱水1h×2次→二甲苯透明20分钟×2次→熔点58-60℃的病理切片用石蜡内浸蜡3h→采用60-62℃熔点石蜡包埋组织→切片，厚4um，连续切片，捞在载玻片上，60-62℃烘箱烤片至完全干燥。

HE染色：石蜡切片→二甲苯脱蜡10min×2次→无水乙醇3min×2次→95％乙醇2min→80％乙醇2min→70％乙醇2min→自然水水化→Gill苏木素染色液浸染10min→自然水洗→显微镜下观察，必要时如下分化：在0.5％盐酸乙醇分化液分化数秒，显微镜下控制，流水冲洗、温水蓝化→95％醇1min→0.5％伊红乙醇染色液1min→80％乙醇适当分化→95％乙醇脱水3min×2次→100％乙醇脱水3min×2次→二甲苯透明5min×2次、中性树胶封片→镜下观察结果。

数据统计分析：利用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以

表示。两组比较采用t检验。P＜0.05有差异且具有统计学意义，P＜0.01，有显著的差异且具有统计学意义。

3.实验结果和分析

3.1 土鳖虫冻干粉胶囊对H₂₂肿瘤小鼠瘤重的影响

由表3-1结果可知：与模型组比较，土鳖虫冻干粉胶囊高、中、低剂量组瘤重均有所降低，并呈现量效关系，高、中剂量组具有差异性(P＜0.05)，其抑瘤率分别为28.0％和29.8％，抑瘤作用明显。5-Fu做为阳性组，抑瘤率为24.2％，与各给药组比较无显著性差异(P＞0.05)。可见：土鳖虫冻干粉胶囊高、中剂量给药组对H₂₂小鼠腋下移植瘤有较显著的抑制作用。

表3-1：土鳖虫冻干粉胶囊对H22小鼠瘤重的影响

注：与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；给药剂量相当于等效原生药剂量

3.2 土鳖虫冻干粉胶囊对H₂₂肿瘤小鼠免疫器官的影响

由3-2结果可知：与空白组比较，土鳖虫冻干粉胶囊各给药组的脾脏指数均较高，具有显著性差异(P＜0.01)；与模型组比较，土鳖虫冻干粉胶囊低、中、高剂量组脾脏指数均有所降低，其中高剂量组具有差异性(P＜0.05)；阳性组的脾脏指数也有所降低(P＜0.05)。与空白组比较，土鳖虫冻干粉胶囊各给药组的胸腺指数均较低，具有显著性差异(P＜0.01)；除土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组外，中、高剂量组的胸腺指数均高于模型组，并呈量效关系，但均无显著性差异(P＞0.05)；阳性组的脾脏指数低于模型组，具有显著性差异(P＜0.01)。

表3-2：H₂₂小鼠脾脏、胸腺指数的检测结果

注：与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与阳性组比较^▼P＜0.05，^▼▼P＜0.01

3.3 土鳖虫冻干粉胶囊对H₂₂肿瘤小鼠血清中相关生化指标的影响

由表3-3结果可知：与空白组比较，土鳖虫冻干粉胶囊各剂量组的INF-γ的含量升高，并具有显著性差异(P＜0.01)。与模型组比较，土鳖虫冻干粉胶囊各剂量组的IFN-γ均有所增加。其中高、中剂量组均具有显著性差异(P＜0.01)；阳性组略有降低，但无显著性差异。与阳性组比较，中、高剂量组IFN-γ含量显著增加，并具有显著性差异(P＜0.01)。

与空白组比较，土鳖虫冻干粉胶囊各剂量组的TNF-a的含量升高，并具有显著性差异(P＜0.01)。与模型组比较，土鳖虫冻干粉胶囊高、中、低剂量组和阳性组的TNF-a均明显增加，阳性对照组和各给药组均具有显著性差异(P＜0.01)。与阳性组比较，各给药剂量组TNF-a含量均明显增加，并具有显著性差异(P＜0.01)。

表3-3：H₂₂小鼠血清中IFN-γ和TNF-a的检测结果

注：与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与阳性组比较^▼P＜0.05，^▼▼P＜0.01

3.4 H₂₂小鼠肿瘤组织病理学切片观察

苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法，是石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。模型组肿瘤细胞核核型饱满，被染成均匀蓝色，土鳖虫冻干粉胶囊给药组随着剂量的增高，肿瘤组织坏死程度呈明显增加趋势。土鳖虫冻干粉胶囊高剂量组肿瘤组织细胞核碎裂、溶解，细胞外基质固缩；大部分坏死组织呈均质红染无结构区域，其坏死程度明显多于低、中剂量组。表明土鳖虫冻干粉胶囊可促使肿瘤组织坏死，并呈明显的量效关系。

模型选择及土鳖虫冻干粉胶囊对H₂₂荷瘤小鼠的抑瘤作用。目前移植性肿瘤整体动物实验模型主要有人体肿瘤动物体内移植模型、来源于动物肿瘤的实体瘤动物模型和非实体瘤动物模型。本实验采用的是H₂₂实体瘤动物模型，这种移植性肿瘤模型接种成活率近100％，对宿主的影响类似，个体差异较小，可在同一时间内获得大量生长相对均匀的肿瘤，给药时间相对固定，动物一般状态变化情况及肿瘤生长情况可直接观察，可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留供试验用。试验用期较短，试验条件易于控制。这些都是任何体外试验所不能替代的，其结果可为肿瘤药物的临床疗效提供更有意义的根据。因此，选择合适的移植性肿瘤动物模型进行研究，是考察一种药物是否有效的最为简便直接的途径。

土鳖虫冻干粉胶囊对H₂₂荷瘤小鼠移植瘤抑制作用试验结果表明：与模型组比较，中、高剂量组抑制H₂₂肿瘤有差异性(P＜0.05)，高剂量组抑瘤率达30％。阳性组抑瘤率为24.2％，低于中、高剂量组。一般认为中药的抑瘤率达到30％，可评定药物有一定疗效。试验结果表明：土鳖虫冻干粉胶囊对H₂₂小鼠腋下移植瘤有一定的抑制作用。

3.5 鳖虫冻干粉胶囊对H₂₂荷瘤小鼠的抗肿瘤的免疫作用

免疫系统是机体一个重要系统，担负着免疫防御、免疫监视与免疫自稳的功能，许多疾病的发生发展都与免疫系统的生理功能有着密不可分的关系。研究表明，机体免疫功能异常是肿瘤发生发展的重要原因之一。因而，如何提高机体对肿瘤的免疫功能是抗肿瘤研究的一个重要方向。

免疫器官是动物机体产生免疫反应的主要场所，动物免疫器官的重量与动物的免疫功能密切相关。胸腺是机体内的中枢免疫器官，主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素，主要参与细胞免疫；脾脏是机体最大的外周免疫器官，占全身淋巴组织总量的25％，含有大量的淋巴细胞和巨嗜细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心，免疫器官的脏器指数是衡量机体免疫功能的初步观察指标。

与空白组小鼠相比，H₂₂荷瘤小鼠的脾指数明显增大[9]，可能是接种瘤株后刺激了免疫系统，使脾脏制造大量的淋巴细胞和免疫球蛋白参与机体的免疫反应，也可能是吞噬作用或病理性增大。与模型组比较，土鳖虫冻干粉胶囊高、中、低剂量组脾脏指数均有所降低(P＞0.05)，并呈现量效关系。除土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组高，中、低剂量组的胸腺指数均高于模型组，并呈正量效关系；与模型组相比，阳性组的脾脏指数(P＜0.05)和胸腺指数(P＜0.01)均明显降低。

结果提示：5-Fu对免疫系统具有一定毒副作用，这与文献报道5-Fu对肿瘤小鼠免疫器官有显著的非特异性抑制作用相符。结果亦表明：土鳖虫冻干粉胶囊在一定程度上能提高胸腺指数和降低脾脏指数，增强细胞免疫和体液免疫功能，改善肿瘤小鼠免疫器官状况，对因荷瘤而损伤的免疫系统功能有一定的保护和促进恢复作用。

3.6 土鳖虫冻干粉胶囊对H₂₂荷瘤小鼠相关生化指标的影响

INF-γ是活化的T淋巴细胞产生的一种具有多潜能的细胞因子，IFN-γ通过对细胞因子及免疫细胞活性发生作用影响机体的免疫功能，对免疫系统具有重要的调节作用。其抗肿瘤机制主要有以下几个方面[10-11]：①直接抑制癌细胞增生、促进细胞凋亡。②激活T、B淋巴细胞，增强巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的杀伤活性，导致肿瘤细胞迅速破坏和减少，大大增强机体的细胞免疫功能。③抑制血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、基质金属蛋白酶(MMP)的表达，抑制肿瘤血管生成。④抑制癌基因表达，发挥其抗肿瘤作用。

TNF-a是由单核巨噬细胞系统分泌的一种细胞因子，具有多种生物学活性，能够激活T淋巴细胞、刺激机体产生抗体、细胞因子及杀灭肿瘤细胞等，参与并调节机体的免疫和炎症等反应。实验证明：TNF-a能直接杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖，在目前的肿瘤治疗中具有十分重要的意义。其抗肿瘤机制主要有以下凡个方面：①与相关受体结合对肿瘤细胞起直接杀伤和抑制作用。②血管阻塞致肿瘤缺血性坏死。③对毛细血管内皮细胞的直接细胞毒性作用，导致血管损伤出现出血性肿瘤坏死，但对正常组织没有毒性作用。④通过对机体免疫功能的调节作用，促进T细胞及其它杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤力。

因此INF-γ和TNF-a是反映机体免疫功能的重要指标，在肿瘤治疗中发挥重要作用。

结果显示：模型组荷瘤小鼠血清中TNF-a、INF-γ的含量均显著高于空白组(P＜0.01)，这可能是荷瘤引起的自身免疫反应激活了免疫系统中T淋巴和巨噬细胞，导致其分泌TNF-α、INF-γ的增加，以发挥机体的自身免疫抗肿瘤作用。

结果显示：与模型组相比，随着抑瘤率的增加，荷瘤小鼠血清中INF-γ的含量均呈现明显上调趋势，提示土鳖虫冻干粉胶囊能够适度刺激T淋巴细胞对INF-γ的表达并发挥抗肿瘤的作用。试验结果亦表明：适度增加荷瘤小鼠体内TNF-a的浓度能显著提高直接杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖的作用。与模型组相比，随着抑瘤率的增加，荷瘤小鼠血清中TNF-a的含量亦呈现明显上调趋势，提示土鳖虫冻干粉胶囊能够适度刺激单核巨噬细胞系统对TNF-a的表达并发挥抗肿瘤的作用。

因此根据相关数据分析，显示土鳖虫冻干粉胶囊能通过适度诱导荷瘤小鼠TNF-a和INF-γ的分泌，以发挥联合协同效应，抑制肿瘤生长。

土鳖虫冻干粉胶囊高剂量组对H₂₂的抑瘤率达30％，与阳性给药组相比，无显著性差异。结果表明：土鳖虫冻干粉胶囊对H₂₂荷瘤有较明显的抑制作用。土鳖虫冻干粉胶囊在一定程度上能够提高肿瘤小鼠胸腺指数和降低脾脏指数，增强细胞免疫和体液免疫功能，改善肿瘤小鼠免疫器官状况，对因荷瘤而损伤的免疫系统功能有一定的保护和促进恢复作用。根据相关数据分析，显示土鳖虫冻干粉胶囊能通过适度诱导荷瘤小鼠TNF-a和INF-γ的分泌，并激发联合协同效应，共同发挥抗肿瘤作用。

五、富硒土鳖虫作为抗氧化药物的应用

富硒土鳖虫作为抗肿瘤药物的动物实验如下：

1 实验材料

1.1 动物：昆明种小鼠，60只，雄雌各半，体重20±2g，由中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司提供，清洁级。动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005。实验前适应环境饲养1w，自由摄食、饮水，室内温度18℃-28℃，相对湿度45％-60％。

1.2 仪器设备：DT系列电子台秤(江苏常熟长春仪器仪表厂)；离心沉淀机(上海手术器械厂)；

YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪(山东省医学科学院设备供应维修站)；BS 110S电子天平(北京赛多利斯有限公司)。

1.3 药品与试剂：富硒土鳖虫冻干粉胶囊(由浙江中医药大学制剂室提供，批号：080701)：维生素E(南京海鲸药业有限公司，批号：0712031)；D-gal(上海恒信化学试剂有限公司，批号：20071115)；

MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20081126)；GSH-Px检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20081126)；SOD检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20081126)；CAT检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20081126)；

所用的试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 衰老动物模型建立

小鼠每日颈背部皮下注射(sc)5％D-gal生理盐水溶液，剂量为0.2mL·10g^-1，每日一次，连续45天。给药器械需经高压蒸汽灭菌，每只小鼠注射前需75％酒精搽拭注射针头及注射部位。空白对照组注射同体积的生理盐水，连续注射45天。各组均普通饲料饲养，建立亚急性衰老模型。

2.2 分组及给药

将小鼠随机分成6组，每组10只，雌雄各半，分别为空白对照组、模型组、富硒土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组(维生素E)。除空白对照组外，其他各组按2.1方法造模。每周记录一次体重，并随时观察小鼠的生长情况。注射15天后，富硒土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组、中剂量组、高剂量组分别按0.220g·kg^-1、0.440g·kg^-1、0.660g·kg^-1给药，其中富硒土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组为人体临床等效剂量[2]。阳性对照组灌胃0.033g·kg^-1维生素E[3]，空白对照组和模型组给同体积的2％的CMC-Na溶液。富硒土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组均连续灌胃30天。

2.3 指标的测定

2.3.1 形态学的观察

在模型建立的同时观察各组别小鼠的毛色的明暗、毛的稀疏、是否躬背弯腰皮下脂肪的薄厚等外在形态。

2.3.2 自主活动的测定

分别于皮下注射前、注射4w及7w时进行自主活动实验。本实验于12:00开始，要求实验环境安静、室温25℃左右。给药2h后，将小鼠放入自主活动箱中，盖好箱盖使其适应15min后开始测定，记录15min内各组小鼠自主活动次数。

2.3.3 免疫器官及全脑指数的测定

末次给药第2天，摘眼球取血处死小鼠，取小鼠全脑、胸腺和脾脏，称其湿重，计算脏器指数。

脏器指数＝脏器重量/体重。

2.3.4 血清中MDA、全血中GSH-Px、肝脏和脑组织中MDA、GSH-Px、SOD及CAT活性的测定

2.3.4.1 血清的制备

各组小鼠于末次给药测试完毕后，摘取小鼠眼球取血约1mL，放入离心机中，以4000转/分钟离心10min，分离出血清，至4℃冰箱中保存备用。

2.3.4.2 肝、脑组织匀浆的制备

断颈处死小鼠，分离脑组织及肝组织，用冰冷生理盐水漂洗，除去血液，滤纸吸干，称重，放入小烧杯，冰浴。按生理盐水∶组织＝9∶1的比例，将组织细细剪碎后与生理盐水一并倒入匀浆器，手工匀浆8min，即得10％的组织匀浆液，放至4℃冰箱中保存备用。

2.3.4.3 MDA、GSH-Px、SOD及CAT的测定

按照MDA、GSH-Px、SOD及CAT测试盒的说明，测定血清、肝脏和脑组织中MDA的含量和GSH-Px、SOD、CAT的活力。

2.4 统计分析

实验数据采用SPSS11.0统计分析软件进行统计学处理，所得结果以均数±标准差

表示。各组实验数据先进行χ2正态性检验和方差分析，若符合正态分布和方差齐性，则采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。取P＜0.05作为显著性差异水平。

3 实验结果与讨论

3.1 衰老动物模型的检测

D-gal衰老模型时目前应用比较多的衰老模型，该模型具有寿命短、学习记忆障碍、神经系统退行性变、免疫力和繁殖力低下等多种衰老表现，在国内外被广泛应用于衰老机理研究以及抗氧化剂、延缓衰老药物的药效学评价。在一定时间内连续给动物注射大剂量D-gal，机体内D-gal浓度增高时，D-gal在醛糖还原酶的作用下还原成半乳糖醇，半乳糖醇被GOA酶氧化成半乳糖醛和H₂O₂，H₂O₂跟体内O_2-·进一步在Fe²⁺作用下通过Feton反应生成活性更强的·OH，过量的H₂O₂、·OH、O_2-等自由基会使体内的SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化物水平降低，进一步加重自由基累积，进而导致线粒体功能紊乱，破坏ATP合成，启动自由基级联效应。同时，自由基会破坏细胞膜中的脂质、核酸和受体等生物大分子，导致细胞结构和功能异常，生物膜脂质过氧化，基因稳态失衡或基因突变，蛋白质羰基化和酶失活，引发机体退行性变。此外，自由基大量堆积会引起氧应激(Oxidative stress)，导致能量不足和钙离子平衡丧失，引起不可逆性的细胞凋亡，引起机体老化，功能退变，最终导致衰老。D-gal衰老模型是一种亚急性衰老模型，引起动物机体的衰老，脑衰老出现的最早，与神经系统细胞容易被自由基破坏有关。本实验研究D-gal衰老小鼠形态学的变化，学习记忆能力的变化，将SOD、CAT、GSH-Px、MDA作为研究指标。模型建立45天后观察各组小鼠，一般状态存在明显差异：模型组小鼠，毛色灰暗而且稀疏，参差不齐，躬背弯腰明显，行动迟缓，皮下脂肪变薄；空白对照组小鼠毛色洁白明亮，浓密，行动敏捷自如，躬背弯腰不明显，皮下脂肪丰厚。模型组小鼠外形的变化，说明本实验模型建立成功。本实验结果表明，各组小鼠自主活动次数要多于模型组(P＜0.05)，表明模型组行动的迟缓，也是其老态的表现，符合衰老特征，表明动物模型复制成功。

3.2 富硒土鳖虫冻干粉胶囊对衰老小鼠动物模型的影响

3.2.1 形态学

模型建立45天后观察富硒土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组、中剂量组、高剂量组，阳性对照组和模型组小鼠，一般状态存在明显差异：模型组小鼠，毛色灰暗而且稀疏，参差不齐，躬背弯腰明显，行动迟缓，皮下脂肪变薄；富硒土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组、中剂量组、高剂量组，阳性对照组小鼠，毛色比模型组要有光泽，更浓密，皮下脂肪减少程度小。说明富硒土鳖虫冻干粉胶囊可明显改善衰老小鼠的形态学的一般状态。

3.2.2 对自主活动的影响

分别于皮下注射5％D-gal生理盐水溶液前、注射4w及7w时进行自主活动实验。本实验于12:00开始，要求实验环境安静、室温25℃左右。给药后30min，将小鼠放入自主活动箱中，盖好箱盖使其适应15min后开始测定，记录15min内的自主活动次数。第4w，富硒土鳖虫冻干粉胶囊高剂量组和阳性对照组小鼠较D-GAL所致衰老模型小鼠自主活动有差异(P＜0.05)，结果具有统计学意义；空白对照组、富硒土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组和中剂量组小鼠较D-gal所致衰老模型小鼠自主活动无显著性差异(P＞0.05)。第7w，空白对照组，富硒土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组小鼠较D-gal所致衰老模型小鼠自主活动均有差异(P＜0.05)，其中富硒土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组小鼠较D-gal所致衰老模型小鼠自主活动有显著性差异(P＜0.01)，结果具有统计学意义。结果见下表：

表5-1：富硒土鳖虫冻干粉胶囊对D一半乳粉所致衰老模型小鼠自主活动的影响(

n＝10)

注：^*表示与模型组比较P＜0.05，^**表示与模型组比较P＜0.01

3.2.3 对免疫器官及全脑指数的影响

末次给药后24h将小鼠称体重后脱颈处死，取所需脏器，称其湿重，计算脏器指数：脏器指数＝脏器重量/体重。空白对照组、富硒土鳖虫冻干粉胶囊高剂量组和阳性对照组小鼠较D-gal所致衰老模型小鼠胸腺指数和脾脏指数均有差异(P＜0.05)，结果具有统计学意义；低剂量组和中剂量组小鼠较D-gal所致衰老模型小鼠胸腺指数和脾脏指数无显著性差异(P＞0.05)。空白对照组、富硒土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性组小鼠较D-gal所致衰老模型小鼠全脑指数均有差异(P＜0.05)，其中富硒土鳖虫冻干粉胶囊中剂量组、高剂量组和阳性组小鼠较D-gal所致衰老模型小鼠全脑指数有显著性差异(P＜0.01)，结果具有统计学意义。结果见表：5-2。

表5-2：硒土鳖虫冻干粉胶囊对D一半乳粉所致衰老模型小鼠脏器指数的影响(

n＝10)

注：^*表示与模型组比较P＜0.05，^**表示与模型组比较P＜0.01.

3.2.4 对血清MDA、全血GSH-Px、肝组织和脑组织中MDA、GSH-Px、SOD及CAT活性的影响

按照MDA、GSH-Px、SOD及CAT测试盒的说明测定血清MDA，全血GSH-Px，肝脏和脑组织中MDA、GSH-Px、SOD、CAT的活性。采用SPSS11.0软件，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

与D-gal所致衰老模型组小鼠相比，血清中MDA含量，空白对照组、中剂量组、高剂量组和阳性组小鼠MDA含量有差异(P＜0.05)，结果具有统计学意义；肝组织中MDA含量，空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性组小鼠MDA含量有差异(P＜0.05)，其中高剂量组和阳性组小鼠MDA含量有显著性差异(P＜0.01)，结果具有统计学意义；脑组织中MDA含量，空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性组小鼠MDA含量有差异(P＜0.05)，其中中剂量组、高剂量组和阳性组小鼠MDA含量有显著性差异(P＜0.01)，结果具有统计学意义。

与D-gal所致衰老模型组小鼠相比，全血、肝组织和脑组织中GSH-Px活力，空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性组小鼠GSH-Px活力有差异(P＜0.05)，其中高剂量组和阳性组小鼠GSH-Px活力有显著性差异(P＜0.01)，结果具有统计学意义。

与D-gal所致衰老模型组小鼠相比，肝组织中CAT的活力，空白对照组、中剂量组、高剂量组和阳性组小鼠CAT活力有差异(P＜0.05)，其中高剂量组和阳性组小鼠CAT的活力有显著性差异(P＜0.01)，结果具有统计学意义；脑组织中CAT的活力，空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性组小鼠CAT的活力有差异(P＜0.05)，其中阳性组小鼠CAT的活力有显著性差异(P＜0.01)，结果具有统计学意义。

与D-gal所致衰老模型组小鼠相比，肝组织和脑组织中SOD的活力，空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性组小鼠SOD活力有差异(P＜0.05)，其中高剂量组和阳性组小鼠SOD的活力有显著性差异(P＜0.01)，结果具有统计学意义；

结果见表5-3至5-4。

表5-3：各组小鼠血清、肝、脑中MDA的比较(

n＝10)

注：^*表示与模型组比较P＜0.05，^**表示与模型组比较P＜0.01.

表5-4：各组小鼠血清、肝、脑中GSH-Px的比较(

n＝10)

注：^*表示与模型组比较P＜0.05，^**表示与模型组比较P＜0.01.

表5-5：各组小鼠肝、脑中CAT和SOD的比较(

n＝10)

注：^*表示与模型组比较P＜0.05，^**表示与模型组比较P＜0.01.

4 小结

4.1 富硒土鳖虫冻干粉胶囊的抗氧化作用研究结果表明：模型组小鼠的自主活动次数显著低于空白对照组(P＜0.05)。血清、肝组织、脑组织中MAD含量显著高于空白对照组(P＜0.05)，全血中GSH-PX活性、肝组织和脑组织中GSH-PX、SOD、CAT活性显著性低于对照组(P＜0.05)，说明D-gal致小鼠亚急性衰老模型成功建立。

4.2 胸腺和脾脏是体内重要的免疫器官，它们在淋巴细胞的成熟过程中起着重要的作用，胸腺和脾脏的重量变化是评价机体免疫机能状态的良好指标。本实验中富硒土鳖虫冻干粉胶囊能显著提高衰老小鼠胸腺指数和脾脏指数，表明其能提高衰老小鼠的免疫能力。

4.3 小鼠血清、肝组织、脑组织SOD、CAT、GSH-Px、MDA含量测定结果显示：

在成功建立的D-gal所致小鼠亚急性衰老模型中，富硒土鳖虫冻干粉胶囊中剂量组、高剂量均能显著提高D-gal所致衰老小鼠全血中GSH-Px抗氧化酶，肝组织和脑组织中SOD、CAT、GSH-Px三种抗氧化酶的活力及对MDA水平的抑制率，体现了一定的抗衰老效果。在小鼠全血、肝组织和脑组织中，富硒土鳖虫冻干粉胶囊低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组可明显提高全血中GSH-Px与肝组织、脑组织中SOD、CAT、GSH-Px活性(P＜0.05)，消除D-gal对SOD、CAT、GSH-Px活力造成的影响。SOD、CAT、GSH-Px是机体重要的内源性抗氧化酶，在体内协同作用，减轻和阻断脂质过氧化作用，保护机体免受各类自由基的侵害，延缓衰老进程。在小鼠血清、肝组织和脑组织中，富硒土鳖虫冻干粉胶囊中剂量组、高剂量组和阳性对照组对MDA水平的抑制率均有显著性的差异(P＜0.05)，提示富硒土鳖虫冻干粉胶囊中剂量组、高剂量组可抑制D-半乳糖所致衰老小鼠血清、肝组织和脑组织中MDA的升高。所以，实验得出了富硒土鳖虫冻干粉胶囊具有抗氧化的作用。同时，根据富硒土鳖虫冻干粉胶囊给药组与阳性对照组(维生素E)的对比，我们得出富硒土鳖虫冻干粉胶囊与维生素E抗氧化效果相当。说明富硒土鳖虫冻干粉胶囊有显著的抗氧化作用，能提高机体免疫力，从而达到改善记忆的目的。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管本文较多地使用了术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

Claims (10)

1.一种富硒土鳖虫饲养方法，其特征在于，本饲养方法包括下述内容：

A、饲养场地建设：建立多层饲养槽，每层间隔45cm-55cm，相邻的两饲养槽之间间隔80cm-120cm，在饲养槽内壁进行粉刷，并在饲养槽内壁上缘周边设置防止土鳖虫逃逸的阻挡体，在饲养槽底部铺设10cm-15cm饲养土；

B、饲养土配制：取土后用3mm-5mm的筛子过筛，然后掺入草木灰混合均匀后形成饲养土，饲养土的湿度为含水量55％-65％；

C、饲料配制：饲料包括下述重量份数的成分：干的青饲料28-32wt％、豆饼28-32wt％、富硒酵母0.8-1.2wt％、虾粉4-6wt％，麦麸32-36wt％，然后加入占上述所有成分总重量10-20％的水，并混合均匀；

D、放养及放养密度：以每一次蜕皮按龄计算，选用9-11龄的雌性土鳖虫在饲养场地进行养殖，放养密度为每平方米1.5～2万只，每天傍晚5～6时或2～3天投喂上述饲料，每次饲料投放量为土鳖虫总重量的8-12％；

E、病虫害预防：

①在饲养前，将备好的饲养土先经阳光曝晒消毒；将曝晒消毒好的饲养土在未放入饲养槽之前，用消毒液匀喷洒饲养土，经1周后将饲养土放进饲养槽饲养土鳖虫；饲养期间每隔20～30天更换1次饲养土，长期保持饲养土清洁无霉败；

②严格控制饲料不带螨类入池，饲料先用微火炒熟杀灭螨类；

③注意饲养槽清洁卫生，及时除去坏死卵鞘和死虫，喂料不过量。

2.根据权利要求1所述的富硒土鳖虫饲养方法，其特征在于，所述的富硒酵母为啤酒酵母；所述的阻挡体由玻璃制成；所述的饲料还包括磷酸氢钙、大麦、油下脚料、鱼粉、玉米、米糠和南瓜和青饲料中的任意一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的富硒土鳖虫饲养方法，其特征在于，本饲养方法包括治螨，所述的治螨包括下述措施中的任意一种或多种的组合：①将饲养槽的剩余饲料连同饲养土表层刮出1.5～3.0cm，清除初发生的螨类；②用炒熟的糠麸、豆粉诱饵在白天诱除螨类；傍晚取出诱饵灭杀处理；③在螨类成灾时，彻底更换全部饲养土；先将土鳖虫从饲养土中筛出，移入装有干燥细沙容器中，让土鳖虫在沙中爬行至少半小时，摩擦掉寄生在土鳖虫体上的螨类，同时烧烤饲养槽，烧死饲养槽内残留螨后，再换入经检查无螨的饲养土饲养；④药剂喷治：先将饲养槽土鳖虫从饲养土中筛出，取30％三氯杀螨砜用1∶400倍稀释液拌入饲养槽内饲养土，每立方米饲养土用药45-55g。

4.根据权利要求1或2所述的富硒土鳖虫饲养方法，其特征在于，所述的消毒液由下述方式制得：取生石灰0.5-2份、硫磺1-3份、水12-15份，混合后煮50-70分钟，过滤后即得消毒液。

5.根据权利要求1或2所述的富硒土鳖虫饲养方法，其特征在于，本饲养方法养殖而成的土鳖虫经干燥成药材后包括下述成分：粗蛋白含量65-68wt％、Se含量6-80.5058μg/g^-1、Zn含量320-360μg/g^-1、不饱和脂肪酸含量占总脂肪油的73-75wt％、油酸含量占总脂肪油的40-42wt％、亚油酸含量占总脂肪油的21-23wt％。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫冻干粉胶囊。

7.根据权利要求6所述的富硒土鳖虫冻干粉胶囊，其特征在于，本冻干粉胶囊通过下述方式制得：取富硒土鳖虫药材，粉碎并过75-85目筛，冷冻干燥，低温间歇灭菌后，得土鳖虫冻干粉粉末，然后按冻干粉∶乳糖为75～85∶25～15的比例混匀后，直接装胶囊，即得。

8.根据权利要求1～5中任意一项所述的富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫制得的富硒土鳖虫蛋白质水解液。

9.根据权利要求8所述的富硒土鳖虫蛋白质水解液，其特征在于，本富硒土鳖虫蛋白质水解液通过下述方式制得：①取净制的富硒土鳖虫碾碎，用石油醚在70℃脱脂4h，其中土鳖虫和石油醚的重量比为1∶3，得到经过预处理的土鳖虫备用；②称取经过预处理的土鳖虫，加入缓冲液，固液比为1∶7，pH为5，冷浸过夜，再加胰蛋白酶，且胰蛋白酶与土鳖虫比250U·g^-1，在60℃水浴中加热酶解一小时后，灭酶、抽滤、精密吸取滤液，将滤液置于容器中，即得富硒土鳖虫蛋白质水解液。

10.根据权利要求1～5中任意一项所述的富硒土鳖虫饲养方法饲养所得的富硒土鳖虫作为抗肿瘤药物的应用或者作为抗氧化药物的应用。