CN102575236B - 利用ctk7a抑制组蛋白乙酰转移酶及其方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及通过姜黄素衍生物，特别是CTK7A用于抑制组蛋白乙酰转移酶的方法。本公开也涉及p300自动乙酰化的诱导的识别及其由CTK7A的抑制。本公开也涉及NPM1与GAPDH过度表达的诱导和组蛋白相应的高度乙酰化及其方法。

Description

利用CTK7A抑制组蛋白乙酰转移酶及其方法
技术领域
本公开涉及通过姜黄素衍生物，特别是CTK7A用于抑制组蛋白乙酰转移酶的方法。本公开也涉及p300自动乙酰化诱导的识别及其由CTK7A的抑制。本公开也涉及NPM1与GAPDH过度表达的诱导和相应的组蛋白高度乙酰化及其方法。
背景技术
口腔癌是人类癌症的最常见类型之一，世界范围内年发病率是274,000例1。烟草使用和酒精摄入是口腔癌发生的主要危险因素。然而，烟草致癌物质和酒精诱导口腔癌中上皮细胞的转化和恶性发展的确切机制未被很好理解2。过去的十年已经看到显示染色质结构-功能在一些疾病表现中的关键作用的快速增加的证据3,4。从遗传变异和/或一组更多样化的基因外改变（后生变化，epigenetic changes）可引起疾病发病机制的事实看，这是显而易见的3,4,5-10。染色质作为动态实体在像转录、修复和复制等所有细胞核相关的现象中起关键性作用11-12。染色质的翻译后修饰在保持染色质结构-功能中发挥重要作用，且因此调控基因表达、细胞生长和分化。已显示细胞转录状态的干扰能够导致发育缺陷13。此外，也已经显示不同染色质组分的功能障碍和组蛋白的共价修饰能够引起疾病发病机制3,4,13,14。
可逆的组蛋白乙酰化是被很好描述的表观遗传修饰之一，且由组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）催化，其影响组蛋白和非-组蛋白蛋白质的乙酰化，从而在下游生物学功能中起显著作用16,17。改变的HAT和HDAC活性现在已知在包括癌症在内的一些疾病中发挥重要作用7-9,15,18,19。该组蛋白乙酰转移酶，p300是整体转录辅助激活因子且是细胞中主要HAT20。高水平的p300已经在一些肿瘤中被观察到21,22。此外，p300乙酰转移酶中的突变在原发肿瘤和细胞系中被发现23。相似地，p300位点异质性的丧失与结肠直肠、乳腺癌及与脑癌（成胶质细胞瘤）有关19,23。虽然这些数据表明CBP、p300和PCAF基因的参与，但是这些乙酰转移酶的HAT活性没有作为恶性肿瘤的起因被确认19。最近，不同癌症中组蛋白修饰的改变已经被报道。H4的赖氨酸16乙酰化丧失和赖氨酸20甲基化被发现与原发肿瘤和肿瘤细胞系有关5。在另一项研究中，癌细胞组蛋白修饰的大量改变被发现可预测临床出现前列腺癌7。然而，一个罕见的例外，组蛋白的高度乙酰化已经在肝细胞癌中被观察24。除了癌症之外，赖氨酸乙酰转移酶的功能障碍已经在其它疾病中被涉及：炎症过程、亨廷顿病、心脏病、糖尿病和AIDS25-28。这些观察显示乙酰转移酶的特定和相关的无毒抑制剂能够被认为是新一代治疗剂，特别地，用于癌症。最近，一些HAT抑制剂已经被发现15,29，其已经显示在癌症、HIV和心脏病中具有潜在的临床作用26,30-32。然而，HAT抑制剂在癌症表现中的效果仍未被测试。
癌症以高增殖细胞为标记，其已经避开了细胞的凋亡机制且因此具有抗凋亡细胞的过度表达。NPM1（也被称为B23）33和GAPDH34,35是那些已知在很多癌症中被频繁上调的基因中的两个。这两种蛋白被认为是细胞增殖的正调节物。
发明内容
因此，本公开涉及一种通过以下化学结构的化合物（CTK7A）抑制组蛋白乙酰转移酶（HAT）的方法，所述方法包括用CTK7A孵育HAT的步骤；一种识别口腔鳞状细胞癌中组蛋白高度乙酰化的方法，所述方法包括步骤：(a)从KB细胞中分离组蛋白并用抗乙酰化H3抗体对该组蛋白进行免疫组织化学分析，以及(b)进行免疫印迹来识别口腔鳞状细胞癌中组蛋白的高度乙酰化；一种治疗癌症的方法，所述方法包括将治疗上可接受量的CTK7A，可选地连同药学上可接受的赋形剂一起给予需要其的对象的步骤；
一种通过核磷蛋白（NPM1）识别p300自动乙酰化的诱导的方法，所述方法包括步骤：(a)在NPM1存在下，在HAT测试缓冲液中孵育全长放射性标记的p300，随后加入[3H]乙酰CoA，以及(b)通过荧光显影和放射自显影识别p300的自动乙酰化；一种通过CTK7A抑制p300的自动乙酰化的方法，所述方法包括步骤：(a)将全长放射性标记的p300与预定浓度的CTK7A，可选地连同HDAC抑制剂的混合物一起反应并孵育，以及(b)进行滤膜结合分析且通过荧光显影和放射自显影识别p300自动乙酰化的抑制；以及一种识别导致组蛋白高度乙酰化的由一氧化氮（NO）诱导的NPM1和GAPDH过度表达的方法，所述方法包括步骤：(a)用S-亚硝基-谷胱甘肽（GSNO）处理KB细胞约24小时，随后裂解细胞以获得细胞裂解物，(b)用抗-乙酰赖氨酸抗体免疫沉淀该细胞裂解物并且使用抗-NPM1和抗-GAPDH抗体通过免疫印迹对该免疫沉淀物进行分析，以及(c)使用抗-乙酰化H3K14抗体同时对来自被处理细胞的组蛋白进行免疫印迹，用于导致组蛋白高度乙酰化的NO诱导的NPM1和GAPDH过度表达的识别。
附图说明
图1：显示KB细胞中组蛋白被高度乙酰化。
图2a：显示组蛋白乙酰化作用的免疫组织化学检测和口腔癌样品中不同蛋白质的表达。
图2b：显示比较不同患者样品的肿瘤中和各自邻近正常组织中组蛋白H3的蛋白质水平和乙酰化状态的免疫印迹分析（左图）以及各自条带的定量化（右图）。
图3a：显示人类口腔癌中iNOS和COX-2表达的免疫组织化学检测。
图3b：显示GSNO诱导NPM1和GAPDH的表达。细胞用指定浓度的GSNO处理24h。
图3c：显示KB细胞在200μM GSNO或GSH存在下24h的生长。细胞裂解物用抗-乙酰赖氨酸抗体被免疫沉淀，且免疫沉淀物用抗-NPM1（左图）和抗-GAPDH（右图）抗体通过免疫印迹被分析。
图3d：显示IFNγ处理提高了NPM1和GAPDH的乙酰化，其被iNOS抑制剂1400W（100μM）彻底破坏。
图3e：显示暴露于IFNγ后GAPDH转运到KB细胞的细胞核。KB细胞用IFNγ（10ng ml–1）处理16h且用抗-GAPDH抗体（绿色）和DAPI（蓝色）染色。
图3f：左图显示p300fl的自动乙酰化用3H-乙酰CoA在NPM1存在或缺少下被检测。GAPDH（600ng）被用作阳性对照。右图显示NPM1以浓度依赖的方式提高p300的自动乙酰化。
图3g：显示NO引起的组蛋白H3K14的高度乙酰化。组蛋白从GSNO处理的KB细胞中被分离且用抗-乙酰化的H3K14抗体被进行免疫印迹。
图4a：显示CTK7A的结构式。
图4b：显示各种重组体HATs、HMTs和HDACs的抑制曲线。
图4c：显示CTK7A是p300的非竞争性抑制剂。CTK7A对p300介导的高纯度HeLa核组蛋白乙酰化的作用的Lineweaver-Burk图。
图4d(A)：显示CTK7A在体外抑制全长p300的自动乙酰化。自动乙酰化分析在有指定浓度的CTK7A的3H-乙酰CoA缺少或存在下使用p300fl被进行。图4g：
图4d(B)：显示通过滤膜结合（Filter binding）组蛋白乙酰转移酶(HAT)分析法，姜黄素对p300活性的抑制效应。
图4d(C)：显示通过滤膜结合组蛋白乙酰转移酶(HAT)分析法，CTK7A对p300活性的抑制效应。
图4e(A)：显示CTK7A在体外抑制PCAF自动乙酰化。
图4e(B)：显示通过滤膜结合组蛋白乙酰转移酶(HAT)分析法，姜黄素对PCAF活性的抑制效应。
图4e(C)：显示通过滤膜结合组蛋白乙酰转移酶(HAT)分析法，CTK7A对PCAF活性的抑制效应。
图4f：显示CTK7A在体外抑制p300自动乙酰化。
图4g：显示CTK7A抑制KB细胞中组蛋白乙酰化。
图5a：显示CTK7A抑制KB细胞的生长。
图5b：显示CTK7A抑制伤口愈合。
图5c：显示CTK7A诱导KB细胞中多倍体。
图5d：显示CTK7A诱导KB细胞中衰老-相关β-半乳糖表达(SA-β-gal)。
图5e：显示CTK7A通过抑制细胞周期素E的表达来影响细胞周期进程。
图5f：显示CTK7A抑制细胞周期素E启动子中H3乙酰化。
图6a：显示携带KB细胞异种移植物的裸鼠用磷酸盐缓冲盐水（对照）或用CTK7A腹膜内注射处理，100mg/Kg体重，一日两次。一元方差分析显示肿瘤大小显著不同（p<0.05）。
图6b：显示CTK7A抑制裸鼠中组蛋白乙酰化。来自对照和CTK7A处理的小鼠的KB细胞瘤被用于使用指定抗体的免疫组织化学检测。GAPDH IHC中箭头标志显示GAPDH的核定位，而在CTK7A处理的肿瘤中它不存在。
图6c：显示来自对照和CTK7A处理的小鼠的KB细胞瘤被用于使用指定抗体的免疫组织化学检测。
图7：显示引起组蛋白和非组蛋白蛋白质高度乙酰化的假定后生信号通路。
具体实施方式
本公开涉及一种通过以下结构的化合物（CTK7A）抑制组蛋白乙酰转移酶（HAT）的方法，所述方法包括用CTK7A孵育HAT的步骤。
在本公开的另一个实施例中，在所述方法中，HAT选自包括p300/CBP（CREB结合蛋白）和PCAF（P300/CBP相关因子）或其组合的组。
在本公开的另一个实施例中，在所述方法中，CTK7A的HAT抑制浓度范围从约25μM至约200μM，优选约40μM至约80μM。
本公开也涉及一种识别口腔鳞状细胞癌中组蛋白高度乙酰化的方法，所述方法包括步骤：
a.从KB细胞中分离组蛋白并用抗乙酰化H3抗体对该组蛋白进行免疫组织化学分析，以及
b.进行免疫印迹来识别口腔鳞状细胞癌中组蛋白的高度乙酰化。
在本公开的另一个实施例中，在所述方法中，该抗乙酰化H3抗体选自包括抗-H3AcK14抗体和抗-H3AcK9抗体的组。
本公开也涉及一种治疗癌症的方法，所述方法包括将治疗上可接受量的CTK7A，可选地连同药学上可接受的赋形剂一起给予需要其的对象的步骤。
在本公开的另一个实施例中，在所述方法中，CTK7A抑制HATs的乙酰转移酶活性，且因此抑制组蛋白高度乙酰化。
在本公开的另一个实施例中，在所述方法中，给予的途径是腹膜内（intraperitonial）。
在本公开的另一个实施例中，在所述方法中，CTK7A减小癌症的肿瘤大小约50%。
在本公开的另一个实施例中，在所述方法中，CTK7A在癌细胞中诱导多倍体从而诱导像生长停滞这样的衰老。
在本公开的另一个实施例中，在所述方法中，癌症是口腔鳞状细胞癌。
在本公开的另一个实施例中，在所述方法中，CTK7A进一步连同后生（epigenetic）药物靶标分子或药学上可接受的化学治疗剂或其组合一起被给予。
本公开也涉及一种通过核磷蛋白（NPM1）识别p300的自动乙酰化诱导的方法，所述方法包括步骤：
a.在NPM1存在下，在HAT测试缓冲液中孵育全长放射性标记的p300，随后加入[3H]乙酰CoA，以及
b.通过荧光显影和放射自显影识别p300自动乙酰化。
在本公开的另一个实施例中，在所述方法中，通过NPM1对p300自动乙酰化的诱导是由IFNγ依赖NO合成激发的。
本公开也涉及一种通过CTK7A抑制p300自动乙酰化的方法，所述方法包括步骤：
a.将全长放射性标记的p300与预定浓度的CTK7A，可选地连同HDAC抑制剂的混合物一起反应并孵育，以及
b.进行滤膜结合分析并且通过荧光显影和放射自显影识别p300自动乙酰化的抑制。
本公开也涉及一种识别导致组蛋白高度乙酰化的通过一氧化氮（NO）诱导的NPM1和GAPDH过度表达的方法，所述方法包括步骤：
a.用S-亚硝基-谷胱甘肽(GSNO)处理KB细胞约24小时，随后裂解细胞以获得细胞裂解物，
b.用抗-乙酰赖氨酸抗体免疫沉淀该细胞裂解物并且使用抗-NPM1和抗-GAPDH抗体通过免疫印迹法分析该免疫沉淀物，以及
c.使用抗-乙酰化的H3K14抗体同时对来自被处理细胞的组蛋白进行免疫印迹，用于识别导致组蛋白高度乙酰化的NO诱导的NPM1和GAPDH过度表达。
在本公开的另一个实施例中，在所述方法中，NO合成由IFNγ控制，且其中NO诱导的NPM1过度表达诱导p300自动乙酰化，并因此激发组蛋白高度乙酰化。
在本公开的另一个实施例中，在所述方法中，GSNO是用于诱导NPM1和GAPDH过度表达的一氧化氮的活性供体。
改变的组蛋白乙酰化模式与包括癌症在内的一些疾病有关。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的功能障碍和随后发生的组蛋白低乙酰化以及非组蛋白蛋白质已经有原因地与癌症表现有关。不像大多数的癌症那样，本公开报导在口腔癌患者样品中组蛋白被发现是高度超乙酰化的。在机理上，由NPM1和GAPDH诱导的过度表达以及p300增强的自动乙酰化引起高度乙酰化，它是一氧化氮（NO）信号相关的（依赖的）。由新合成的、水溶性的、小分子抑制剂对p300乙酰转移酶活性（HAT）的抑制能够基本上延迟/抑制小鼠中异种移植口腔肿瘤的生长。因此，这些结果不仅明确了口腔癌的一个新的后生靶标，而且提出HAT抑制剂作为潜在的治疗分子。
本公开显示组蛋白（H3）在口腔癌患者样品中是高度乙酰化的，且与上调的NPM1和GAPDH蛋白质水平呈正相关。本公开也提出了一种机制来解释H3的高度乙酰化是如何能够被NPM1和GAPDH以涉及p300乙酰转移酶的一氧化氮（NO）依赖方式所调控的。此外，水溶性HAT抑制剂，CTK7A已经显示在裸鼠中抑制口腔肿瘤细胞的生长。
实验步骤
分离自HeLa细胞核的组蛋白：
来自HeLa细胞核的核心组蛋白如别处所描述被纯化31。
来自杆状病毒-感染的Sf21细胞的组蛋白修饰酶的纯化：
表达全长FLAG-标签的CARM1、CBP和PCAF的重组杆状病毒使用M2-琼脂糖微球通过免疫亲和层析而被纯化随后用FLAG肽洗脱。杆状病毒表达的全长六溴氨酸-标签p300和G9a使用Ni-NTA亲和层析如前所述30被纯化。
HAT检测：
进行HAT凝胶荧光显影/放射自显影检测，如前所报导30。p300HAT抑制的动力学分析在（0、30和50μM）CTK7A存在下如先前所报导31被执行。获得的值使用Graphpad Prism软件按双倒数作图法作图。对于p300自动乙酰化检测，p300全长（80ng）与蛋白质（NPM1）或者不与蛋白质（NPM1）的反应在HAT检测缓冲液中在30℃进行10分钟，随后加入1μl的4.7Ci/mmol[3H]乙酰CoA（NEN-PerkinElmer）并且进一步在一个30μl反应中再孵育10分钟。GAPDH被用作阳性对照。放射性标记的乙酰化的p300被荧光显影随后被放射自显影处理。
组蛋白去乙酰化酶检测（HDAC检测）及组蛋白甲基转移酶（HMTase）检测
去乙酰化酶检测按照每个标准实验方案执行。对于SirT2去乙酰化酶检测，50ng细菌表达的重组酶在辅因子NAD+存在或缺少下被添加。HMTase如前所述被执行31。
细胞培养和全细胞提取物制备：
KB细胞在37℃5%CO2气氛条件的加湿培养箱中被保持在含10%胎牛血清(FBS)的杜尔贝科改良Eagle培养基(DMEM)中。对于IFNγ和GSNO处理，KB细胞在IFNγ10ng ml–1存在下分别再培养16h和24h。用于共聚焦显微镜的细胞的免疫荧光染色如前所述被执行。CTK7A处理进行24h，随后是按照每个标准实验方案31的组蛋白的酸提取和免疫印迹。对于全细胞提取物制备，RIPA缓冲液（Tris-盐酸50mM，pH7.4NP-401%，钠-脱氧胆酸盐0.25%，NaCl150mM，EDTA1mM，苯甲基磺酰氟（PMSF），1mM Na3VO4，1mM NaF和蛋白酶抑制剂混合物（cocktail））被使用。
免疫沉淀检测：
全细胞提取物如上所述使用RIPA缓冲液被制备。前阻断蛋白-G琼脂糖凝胶结合抗体（4μg）与500μg全细胞裂解物在4℃过夜培养。在广泛清洗后，珠结合蛋白通过与指定抗体的免疫印迹被分析。对于HDAC抑制剂处理，5mM丁酸钠、5mM烟酰胺和100ng ml–1TSA在细胞被收获前10h被加入。
染色质免疫沉淀检测（ChIP）：
使用抗乙酰化H3（H3AcK9AcK14）（Santa Cruz）抗体进行ChIP检测的下调（pull-down）。KB细胞被保持在添加了10%FBS的DMEM中，用CTK7A处理，且细胞生长24小时。对于ChIP检测，细胞如别处47所描述被处理。下调使用抗上述抗体的抗体进行，免疫沉淀样品被脱去蛋白质且乙醇沉淀以回收DNA。使用细胞周期素E（或称细胞周期蛋白E）启动子区域的引物进行实时PCR分析。细胞周期素E启动子区域的引物是5’-GGCGGGACGGGCTCTGGG-3’和5’-CCTCGGCATGATGGGGCTG-3’
免疫组织化学：
在脱蜡（deparafinzing）之后，载玻片在乙醇中清洗。抗原修复使用柠檬酸钠（10mM pH6.0）在98℃进行5分钟。染色使用Envision试剂盒（Dako，丹麦）进行。复染使用Mayer苏木精进行，并在DPX中装配且风干。每个样品标本在进行免疫组织化学之前被病理证实。对于统计分析，来自正常和肿瘤组织切片的细胞（来自总计5-6个独立区域的100个细胞）被计数，并且记录用于指定抗体的阳性细胞（棕色）的百分比。为了比较，一元方差分析使用“Sigmaplot软件”被执行。P-值<0.01被认为是统计学显著，n=31。
异种移植生长检测：
动物实验得到授权的伦理委员的批准而执行。十六只裸鼠（BALB/c）被包括在实验中（10只雄性小鼠和6只雌性小鼠）。小鼠在无病原体环境中被保存在隔离器中。所有裸鼠在实验开始时是3-4周大。KB细胞，2x106个细胞被分别接种在每只小鼠的右侧和左侧。然后小鼠被分成两组，每组（5雄和3雌）。在肿瘤长到大小明显后，CTK7A处理以100mg/kg体重/一日两次被腹膜内给予（i.p）。肿瘤使用卡尺三天测量一次，且它们的体积利用公式：0.52x D1x(D2)2被计算，其中，‘D1’和‘D2’分别是最长和最短的尺寸。化合物（CTK7A）最后剂量在宰杀它之前四小时被给予。肿瘤被切除，且放入液氮中或被固定在10%福尔马林中1–2h以制备用于IHC的块。为了比较处理和对照的肿瘤大小，使用“Sigmaplot软件”进行一元方差分析。P-值<0.05被认为是统计学显著的。
荧光活化的细胞分选（FACS）：
KB细胞以指定浓度在CTK7A存在或缺少下生长24h。细胞在存在CTK7A、缺少血清下生长2h，随后加入10%血清。简言之，细胞通过轻度胰酶消化（0.25%）被收获，随后在4℃以2000rpm离心10分钟。细胞用冷PBS通过在4℃以2000rpm离心10分钟被清洗。细胞被固定在随着温和涡旋滴加的冷70%乙醇中。样品被静止12小时，其后乙醇被去除，随后在冷PBS中清洗两次。核糖核酸酶（100μg/ml）处理随后在37℃被给予30分钟以确保只有DNA染色。加入50μg/ml碘化吡啶用于染色。细胞使用BD FACScalibur设备的内置软件通过用于细胞周期分布的流式细胞仪被分类和分析。分析在FL2通道中完成。
体外伤口愈合检测：
含10%FBS的培养基中的细胞被接种于30mm培养皿中。细胞长成片之后，等径的伤口使用无菌塑料枪头（200-μl）通过刮伤单分子层而形成。细胞用无血清培养基清洗两次且用含有或没有10%FBS的培养基再生。细胞用或不用HAT抑制剂连同10%血清一起处理24h。伤口照片在相差显微镜下被拍摄。血清阳性和阴性细胞分别用作实验的阳性和阴性对照。
衰老相关β-gal(SA-β-gal)活性分析：
如前所述在KB细胞中分析SA-β-gal活性。
[3H]胸腺嘧啶掺入量检测：
细胞在24-孔平板中生长，且用化合物处理16h，随后加入1微居里[3H]胸腺嘧啶（NEN,Perkin Elmer）。细胞进一步生长额外的8h。此后，培养基被充气，且细胞用1ml冰冷PBS清洗。细胞通过反复冻融（2次）被裂解。使用细胞收集器分离DNA，且使用液体闪烁计数器完成闪烁计数。
CTK7A合成的一般程序：
该程序涉及下面两步：
A.苯甲酰肼姜黄素（CTK7）的制备：（不溶于水）
将乙酸的4-肼基苯甲酸（2ml）加入到姜黄素在甲醇中的溶液（10mg,0.027Mmol）中。保温24h后，该溶剂在真空中被蒸发。剩余的酸（20mg,0.135mmol）、和催化量的三乙胺（18.8μL,0.135mmol）使用TLC（CHCl3/MeOH=4:1;Rf=0.5）利用反复重结晶和过滤的方法被纯化。这样产生如暗橙色粉末样的CTK7（7.18mg,55%），其通过H1NMR、熔点测试、溶解度试验和ESI-MS进行分析。
B.CTK7A的制备：（溶于水）
将（10ml）的乙醇钠加入到CTK7在甲醇中的溶液中（50mg,0.1031mmol），且该反应混合物在室温被搅拌90分钟。该溶剂在真空中被蒸发，且残余物用己烷、乙醚和乙酸乙酯清洗。产物通过H1NMR、溶解度试验、熔点测试被证实。
本公开通过下面的实施例和附图被进一步阐述。然而，这些实施例并不被解释为限制本公开的范围。
实施例1
组蛋白在H3K14的高度乙酰化与口腔癌中NPM1和GAPDH的过度表达有关
为了研究不同癌症中组蛋白乙酰化的情况，首先，组蛋白分离自不同的细胞系且使用抗-乙酰化组蛋白H3（抗-H3AcK9AcK14）抗体进行免疫印迹分析。观察到组蛋白在口腔（KB）和肝脏（HepG2）癌细胞系中是显著高度乙酰化的（图1）。如指出的组蛋白分离自不同细胞系的细胞，且使用抗-乙酰化H3（抗-H3AcK9AcK14）抗体通过免疫印迹分析组蛋白乙酰化。抗-H3被用作上样对照。虽然肝癌中组蛋白的高度乙酰化已经在最近被报导24，但是对于口腔癌细胞系：组蛋白H3的几乎等效增强的乙酰化是相当引人关注的。这些结果使我们发现了来自口腔癌患者样品的组织中组蛋白H3的乙酰化水平。通过应用免疫组织化学（IHC）（图2a）和利用特定抗体（抗-H3AcK14和抗-H3AcK9）的免疫印迹（图2b）分析，发现组蛋白（主要是H3K14）与正常组织相比在癌组织中是高度乙酰化的（图2a）。
由于H3K14是体内p300介导的乙酰化的主要靶标，因此研究p300的表达水平。发现p300与邻近的正常组织相比在恶性肿瘤部分显著表达（图2a）。既然p300自动乙酰化促进它的乙酰转移酶活性36，p300的自动乙酰化情况利用特别识别乙酰化-p300(ac-p300)分子36的多克隆抗体也被检验。引人关注的是，p300被发现在口腔癌样品中时高度乙酰化的（图2a）。这些结果显示高活性乙酰化-p300能够参与到恶性口腔肿瘤中组蛋白在H3K14的高度乙酰化。
p300的自动乙酰化能够被一些因子增强36-40且其中的一些在不同癌症中过度表达。在本文中，发现在口腔肿瘤组织中，与每一例（患者样品）中相应的正常组织相比GAPDH和NPM1蛋白质水平显著增加（图2a）。随后，六对不同的组织样品被取样（肿瘤和相应邻近的正常组织），且蛋白质过度表达水平通过免疫印迹分析被测定。观察到在所有六对组织样品中，组蛋白H3高度乙酰化，如被抗-H3AcK9AcK14乙酰化特定抗体探测到的那样（图2b）。请注意H3高度乙酰化遵循与所有被分析的癌组织中NPM1和GAPDH过度表达相同的模式。总之，这些数据显示GAPDH和NPM1的过度表达与口腔癌中组蛋白高度乙酰化正相关。在此被提出的一个有意义的问题是这与p300自动乙酰化有关的可能性。
实施例2
NO诱导的H3K14乙酰化与经由p300自动乙酰化的NPM1和GAPDH过度表达有关
自由基气体，NO，由一氧化氮合成酶（NOS）家族产生。NO是被确定为许多生理和病理条件的中介物的多效性信号分子41。由于发现在口腔癌中NO产量的增加伴随炎症（主要是NFk-B响应）基因的同时上调42,43，因此假设NO信号可能与p300的自动乙酰化、GAPDH和NPM1的过度表达以及组蛋白的高度乙酰化有关。观察到iNOS水平在肿瘤组织样品中确实显著提高（图3a）。也发现COX2水平在这些肿瘤组织样品中是较高的（图2a）。最近的报导提出NO依赖且细胞核定位的GAPDH提高p300自动乙酰化且因而提高它的催化活性37。已发现GAPDH主要定位于口腔癌患者样品的细胞核（图2a，如箭头所指）。此外，观察到当KB细胞用NO供体，S-亚硝基-谷胱甘肽(GSNO)处理时，NPM1和GAPDH二者的表达以浓度依赖的方式提高（图3b）。与先前的报导一致37，同样发现GAPDH以NO依赖的方式被乙酰化（图3c）。这些结果使我们确定了NO对NPM1乙酰化的作用。引人关注的是，GSNO处理后，检测到NPM1的乙酰化在KB细胞中急剧地提高（图3c）。
为了了解信号通路，KB细胞中IFNγ对GAPDH和NPM1乙酰化的影响被研究，如已知激活iNOS基因表达以产生NO44。发现IFNγ在KB细胞中以NO-依赖的方式有效地提高GAPDH和NPM1乙酰化（图3d），其通过特定iNOS抑制剂，N-(3-(氨甲基)苄基)乙脒（1400W）处理而被破坏或降低。此外，发现IFNγ处理能够诱导胞液蛋白GAPDH易位到细胞核（图3e）。总之，这些结果显示NO-信号参与KB细胞中NPM1和GAPDH的过度表达以及它们的乙酰化，这与观察到的口腔癌组织样品中NPM1、GAPDH和iNOS过度表达（如前所述）显著相关。
在肿瘤组织中，也发现组蛋白H3K14是高度乙酰化的（图2a）。这些观察促使我们研究NPM1对p300激活（自动乙酰化）的作用。p300自动乙酰化反应在NPM1和3H-乙酰-CoA存在下进行。NPM1被发现以剂量依赖的方式激活p300的自动乙酰化（图3f）。GAPDH被用作阳性对照，如前面所提出的那样37。既然NO信号诱导p300-自动乙酰化，那么KB细胞中NO对H3K14乙酰化的作用接下来被研究。KB细胞的GSNO处理以浓度依赖的方式提高H3K14乙酰化的水平（图3g），这与如上所示NPM1和GAPDH水平相伴增加（图3b）是相似的。总之，这些数据显示口腔癌中组蛋白高度乙酰化能够通过过度表达的和自动乙酰化的p300以NO依赖的方式而获得。
实施例3
CTK7A是HAT抑制剂：
上面提到的结果清楚地证明了赖氨酸乙酰转移酶p300的高-活性可能是负责口腔癌表现（manifestation）的因子之一。因此，p300HAT活性的抑制剂对证实乙酰转移酶可能参与将是有用的。利用姜黄素作为合成子，一种水溶性衍生物，CTK7A为此目的而被合成（图4a）。发现CTK7A抑制HAT p300/CBP和PCAF，但是如G9a、CARM1、Tip60、HDAC1和SIRT2这样的其它组蛋白修饰酶的活性甚至在100μM浓度仍不受影响（图4b）。进一步动力学分析显示当测试p300时，CTK7A对于两种底物，乙酰-coA和核心组蛋白，遵循非-竞争类型的抑制模式（图4c）。然而，正如预期的，CTK7A能够以浓度依赖的方式有效地抑制体外p300（图4c）和PCAF（图4e）的自动乙酰化。此外，CTK7A同样能够抑制提高的p300自动乙酰化，由HDAC抑制剂的混合物所调节（图4f）。为了阐述细胞体系中CTK7A对组蛋白乙酰化抑制的影响，KB细胞用CTK7A处理，且正如预期的，它能够有效抑制KB细胞中组蛋白乙酰化，与姜黄素母体化合物一样有效31（图4g）。总之，这些结果显示水溶性HAT抑制剂，CTK7A通过抑制p300自动乙酰化而在细胞体系中抑制组蛋白乙酰化。
实施例4
CTK7A抑制细胞增殖并诱导如生长停滞这样的衰老
由于p300/CBP是主要调控因子，并且参与细胞周期进程增殖、分化的调控以及保持组织稳态45，CTK7A在细胞中的生长抑制性能接下来被观察。KB细胞用CTK7A处理并且被检测生长抑制性能。CTK7A引起KB细胞增殖的剂量依赖抑制，如通过胸腺嘧啶掺入试验进行分析（图5a）。阿霉素被用作阳性对照（图5a）。CTK7A的抗增殖活性进一步通过伤口愈合检测被确定。观察到CTK7A处理的细胞在血清存在下显示伤口愈合活性下降（图5b）。有和没有血清的细胞分别被用作阳性和阴性对照（图5b）。这些结果显示CTK7A在KB细胞中的抗增殖作用。基于上述结果，也确定了CTK7A对KB细胞的细胞周期的作用。KB细胞用增加浓度的CTK7A处理（图5c），这以浓度依赖的方式引起多倍体细胞(>4N)百分比的急剧增加（图5c）。多倍体的诱导通常与已知与抗肿瘤过程有关的衰老有关46。发现CTK7A处理的细胞诱导与作为衰老标记的β-半乳糖(SA-β-gal)有关的衰老的表达（图5d）。这与较早的报导一致，报导中利用p300特定HATi，赖氨酰-CoA（乙酰-CoA的底物类似物）显示了p300在调控人类黑色素细胞的增殖和衰老中的作用。赖氨酰-CoA抑制增殖且诱导伴随SA-β-gal表达的衰老-样生长阻滞47。
细胞周期素E是衰老的关键调控因子，因为在过度表达条件下，它足以逃脱BRG1和RAS-诱导的衰老48-49。考虑到p300/CBP调控很多细胞周期基因的表达，接下来测定CTK7A对细胞周期素E的表达的影响。观察到CTK7A在KB细胞中以浓度依赖的方式下调细胞周期素E的表达，而细胞周期素D1受到轻微影响（图5e）。早前的工作显示人类肿瘤细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中细胞周期素E启动子由可逆的乙酰化和去乙酰化循环调控50-52。因此，为了解决细胞周期素E启动子中CTK7A对乙酰化状态的影响，进行染色质免疫沉淀检测（ChIP）。ChIP检测清楚地证实CTK7A抑制在细胞周期素E启动子中的H3的乙酰化（图5f）。总之，这些结果显示细胞周期素E下调可能是CTK7A的p300HAT抑制活性（其造成衰老-样生长阻滞）的直接原因。
实施例5
CTK7A抑制肿瘤生长
基于体外和细胞系的研究促使我们研究CTK7A在异种移植小鼠中的作用。发现CTK7A在腹膜内（i.p）给予后对小鼠是无毒的。1个月期间，在剂量达到100mg/kg体重/一日两次，没有观察到重量减轻。为了测试CTK7A对肿瘤生长的影响，KB细胞(2x106细胞)被分别接种在每只小鼠的右侧和左侧，100mg/kg体重/一日两次腹膜内处理它们（细节见材料与方法）。CTK7A显示强抗肿瘤活性（图6a）。CTK7A处理的小鼠中KB细胞肿瘤比对照未处理小鼠小50%。异种移植小鼠之间肿瘤大小的区别（对照相对处理）是统计学显著的(p<0.05)。H3乙酰化的水平和其它蛋白质（例如，NPM1、GAPDH、p300）的水平使用IHC测定。CTK7A处理的小鼠肿瘤对p300表达显示边际影响（图6b）。观察到CTK7A降低了H3K9、K14乙酰化（如H3AcK9AcK14探测到的）和ac-p300的水平（图6b和图6c）。进一步观察CTK7A介导的HAT抑制对组蛋白乙酰化的位点特异性影响，IHC使用位点特异性抗体而完成。发现CTK7A抑制H3K14乙酰化比抑制H3K9乙酰化更有力（图6b），表明CTK7A主要通过能引起肿瘤生长抑制的小鼠癌组织中p300自动乙酰化的抑制来介导组蛋白乙酰化的抑制。这些数据也与CTK7A对KB细胞的抗增殖效果一致（图5a）。此外，GAPDH、NPM1和iNOS的水平也被发现在CTK7A处理的小鼠中下调，这可能是因为CTK7A对小鼠肿瘤的抗增殖效果（图6b）。此外，在很多细胞类型中由分裂素、生长因子、细胞激素和肿瘤促进因子诱导并且已经牵涉包括口腔癌在内的很多癌症的COX2的水平也被发现在CTK7A处理的肿瘤中受到抑制（图6b）。增殖标记物的下调也被观察：CTK7A处理的肿瘤中的Ki-67，其支持HATi、CTK7A的抗增殖性质（图6c）。此处应注意在对照小鼠中，细胞核GAPDH被观察到，而在CTK7A处理小鼠中，细胞核GAPDH不存在或非常微弱存在（图6b）。这些结果显示CTK7A抑制裸鼠中肿瘤生长，虽然它有能力抑制p-300介导的乙酰化。
虽然组蛋白和非组蛋白蛋白质的可逆的乙酰化是最好研究的后生标记之一，但是涉及这些现象的酶机制的调控仅最近才引起注意。HDACs的功能障碍和组蛋白以及非组蛋白蛋白质的随之而来的低乙酰化在一些案例中已经与癌症表现因果相关53。关于HATs的功能障碍和癌症的报导相当少。此处，在口腔鳞状细胞癌（OSCC），组蛋白H3（主要在K14）在II级口腔肿瘤中是高度乙酰化的。组蛋白乙酰转移酶p300的相关过度表达和高度乙酰化显示p300的自动乙酰化能够是负责组蛋白高度乙酰化的关键因子之一。发现也在口腔肿瘤中过度表达的组蛋白分子伴侣NPM1大概通过它的蛋白质分子伴侣活性诱导p300的自动乙酰化54。这些结果归属于多功能核仁蛋白NPM1的一个新功能。此外，这些研究也确立了一个表观遗传信号，IFNγ依赖的NO合成，它能够作为对NPM1和GAPDH介导的p300增强的自动乙酰化以及因此的下游效应的基本刺激（basicstimuli）。
组蛋白修饰（特别是乙酰化）和癌症表现的相互关系还没有很好地理解。由于癌症是一种多起源的多样的疾病，它不遵循统一的细胞规则。然而，在前列腺癌病例中，已经显示H3K9、K18、H4K12的甲基化和H4R3的二甲基化作用与肿瘤复发有关7。然而，参与这些改变的修饰中的组蛋白修饰酶还不为人们所知。换句话说，在改变的乙酰化和甲基化之后的分子机制还没有被阐明。发现组蛋白在肝癌中在H3K9和H4K8是高度乙酰化的24。值得注意地，在这个案例中，参与高度乙酰化的酶机制也没有被详细研究。最近，CBP/p300的一个靶标H3K56增加的乙酰化在多发性癌症中观察到8。也证实组蛋白、组蛋白分子伴侣(NPM1)及代谢蛋白、GAPDH的高度乙酰化由极度活跃的、自动乙酰化的p300引起。参与高度乙酰化这个过程的唯一的正循环能够是癌症表现中的共有机制。
口腔癌是一种炎症相关的疾病，其能够引起NO产生，而NO产生能够对癌症的发生和发展阶段造成影响44。本公开提供了NO产生与如NPM1和GAPDH的细胞增殖标记基因的过度表达之间的联系。这些观察与增强的iNOS活性已经在人类肿瘤细胞系55，56和各种组织发生来源的患者肿瘤样品44中检测到的报导相一致。NOS活性已经发现与肿瘤发生、增殖和与癌症发生相联系的重要信号组分的表达有关44。已知干扰素γ（IFNγ），一种促炎性细胞因子，激活iNOS以产生NO57。发现确实IFNγ对口腔癌细胞系（KB细胞）的处理诱导NO产生，它的抑制（IFNγ）抑制了对NPM1和GAPDH乙酰化。本公开的结果显示IFNγ处理能够增加GAPDH的细胞核易位。虽然GAPDH的相似的细胞核定位也在其它案例中被报导37,58，但是GAPDH在KB细胞中诱导的细胞核易位的分子机制仍然不明。过度表达的NPM1和GAPDH（细胞核）增强p300的自动乙酰化，它反过来诱导组蛋白高度乙酰化。高度乙酰化的组蛋白和NPM1有助于负责口腔癌发展的基因的表达（图7）。NPM1和GAPDH诱导的p300的自动乙酰化也能够被用于形成更多的动态转录起始前复杂形成体59，这引起更有效的转录。NPM1的组蛋白分子伴侣活性也可以用于转录激活，如早前所报导60。癌细胞具有较高的能量需求和增加的核糖体生物合成。NPM1增加的水平也能够有助于口腔癌中核糖体的生物发生。
总之，本公开的数据显示p300的乙酰转移酶活性可以是造成口腔癌的因子之一。因此，HAT活性能够作为新一代疗法的靶标15,29。此处，显示确实来自姜黄素的p300/CBP HAT抑制剂，CTK7A，一种水溶性、小分子化合物，能够有效抑制裸鼠中口腔肿瘤的生长。本公开的结果显示由细胞中HAT抑制剂（CTK7A）引起的多倍体抑制具有诱导像生长停滞的衰老的抗肿瘤活性。衰老的诱导已知有助于化学疗法、电离辐射的治疗，且也显示有助于HDAC抑制剂的抗肿瘤效果61。
目前的观察确立了高度乙酰化和口腔癌表现之间的因果关系。最重要地，它阐明了高度乙酰化的机制，并且确定一种新的候选蛋白NPM1作为主乙酰转移酶p300的调节剂。随着最近一些新的HAT抑制剂的发现，逐渐意识到这些分子作为治疗靶标是非常有用的15,29。在口腔癌中，p300乙酰转移酶活性能够是此类分子的重要靶标之一，正如通过应用CTK7A而证实的。然而，源自OSCC的完整的后生语言（epigenetic language，后生学）仍然不清楚。HATs和HMTases（组蛋白甲基转移酶，特别是精氨酸MTase）的小分子调节剂对于进一步阐明这个后生改变及在设计疗法中是有用的。
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Claims (10)

1.以下化学结构的化合物在制备用于在口腔鳞状细胞癌中抑制组蛋白乙酰转移酶的药物中的应用，
其中所述组蛋白乙酰转移酶选自由p300/CBP、PCAF和其组合构成的组。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述化合物的组蛋白乙酰转移酶抑制浓度范围为从25μM至200μM。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述化合物的组蛋白乙酰转移酶抑制浓度范围为从40μM至80μM。
4.以下化学结构的化合物可选地连同药学上可接受的赋形剂在制备用于治疗口腔鳞状细胞癌的药物中的应用，
所述治疗包括将治疗上可接受量的所述化合物，可选地连同药学上可接受的赋形剂一起给予需要其的对象的步骤。
5.根据权利要求4所述的应用，其中所述化合物抑制组蛋白乙酰转移酶的乙酰转移酶活性，且因此抑制组蛋白高度乙酰化。
6.根据权利要求4所述的应用，其中所述给予的途径是腹膜内。
7.根据权利要求4所述的应用，其中所述化合物使癌症的肿瘤大小减小50%。
8.根据权利要求4所述的应用，其中所述化合物在癌细胞中诱导多倍体从而诱导像生长停滞这样的衰老。
9.根据权利要求4所述的应用，其中将所述化合物进一步连同后生药物靶标分子或药学上可接受的化学治疗剂或其组合一起给予。
10.以下化学结构的化合物在制备用于在口腔鳞状细胞癌中抑制p300自动乙酰化的药物中的应用，
所述抑制包括以下步骤：
a.将全长放射性-标记的p300与预定浓度的所述化合物，可选地连同HDAC抑制剂的混合物一起反应并孵育，以及
b.进行滤膜结合分析且通过荧光显影和放射自显影识别p300自动乙酰化的抑制。
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