CN102559740A - 一种提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法及专用酿酒酵母菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，是通过宿主菌改造、分泌表达载体构建、重组菌株构建、菌株培养、酶活测定，实现提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白尤其是分子量大且二硫键丰富的异源蛋白。本发明还提供了所述方法中专用的提高异源蛋白分泌表达的重组酿酒酵母菌株，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSX010，已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5748。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高酵母分泌表达异源蛋白的方法，尤其是针对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白的方法及专用提高酿酒酵母异源蛋白分泌表达的菌株。
背景技术
近年来，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为宿主菌表达异源蛋白日益引起重视，酿酒酵母作为低等真核生物具有非致病性，快速分裂，容易培养，基因操作简单等优势，并且具备将异源蛋白进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，然而，仍然存在很多瓶颈如低分泌效率和过度糖基化等，制约了异源蛋白在酿酒酵母中的分泌表达。影响异源蛋白分泌效率的主要因素有：目的蛋白本身的性质，密码子偏好性，载体，启动子，信号肽，蛋白质合成、折叠和分泌过程，受体菌和培养条件(Niebauer RT andRobinson AS，In：Baneyx F(ed)Protein expression technologies.Horizon，Norwich；2005：253-296.)。在这些影响因素中蛋白质合成、折叠和分泌过程有可能是限速步骤。在内质网腔中，分子伴侣和助折叠因子促进蛋白质加工折叠成正确的结构，是限速步骤之一，有研究报道过表达内质网分子伴侣或者非折叠应答途径(UPR)的组分可以促进蛋白分泌(Ji L et a1.，Bioresour Technol 2011，102(17)：8105-8109；Ilmén M et al.，BiotechnolBiofuels 2011，4：30)。另外一个限速步骤是蛋白质运输过程，有许多研究结果表明敲除介导高尔基体到囊泡的蛋白质误分拣途径的囊泡蛋白分拣受体Sc-VPS10基因，可以促进异源蛋白分泌(Hong E et al.，J Cell Biol 1996，135：623-633；Holkeri H and Makarow M，FEBSLett 1998，429：162-166；Zhang B et al.，J Cell Biol 2001，153：1187-1198)；另外过表达参与高尔基体产生的分泌小泡与质膜融合的t-SNARE基因Sc-SSO1，可以提高异源蛋白分泌表达(Ruohonen L et al.，Yeast 1997，13(4)：337-351；Larsson S et al.，Appl EnvironMicrobiol 2001，67(3)：1163-1170)。
纤维素乙醇是有潜力的未来燃料，纤维素乙醇的生产需要纤维素水解微生物和糖发酵微生物的协作。CBP(Consolidated bioprocessing)是将纤维素酶和半纤维素酶生产、纤维素水解和乙醇发酵过程组合或部分组合，通过一种微生物完成。CBP过程有利于降低生物转化过程的成本，越来越受到研究者的普遍关注。一个成功的CBP菌株不仅需要强有力的乙醇发酵能力，还需要纤维素水解能力。作为传统的乙醇生产菌株，酿酒酵母被认为是良好的CBP载体(Lynd LR et al.，Microbiol Mol Biol Rev 2002，66(3)：506-577.)。构建酿酒酵母CBP菌株的主要策略是在酿酒酵母中高效分泌表达木质纤维素水解酶(Lynd et al.，Microbiol Mol BiolRev 2002，66(3)：506-577)。
纤维素降解至少需要三种，内切葡聚糖酶(或称1，4-β-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.4，通常用EG来代表)和外切葡聚糖酶(包括1，4-β-D-葡聚糖-纤维二糖水解酶，EC3.2.1.91，用CBH来代表，和1，4-β-D-葡聚糖-葡萄糖水解酶，EC 3.2.1.74)和β-葡萄糖苷酶(或称为纤维二糖酶，β-葡萄糖苷-葡萄糖水解酶，EC 3.2.1.21，常用BGL来代表)(Karl-Erik Eriksson et al.，In：Springer series in wood science.Berlin/Heidelberg，New York：Springer-Verlag；1990.)。内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶协同作用产生纤维二糖和一些纤维寡糖，进而β-葡萄糖苷酶水解产生葡萄糖，其中，外切葡聚糖酶对降解微晶纤维素是必需的。丝状真菌瑞氏木霉Hypocrea jecorina(即Trichoderma reesei的有性型)是最强大的纤维素酶生产菌株之一，瑞氏木霉纤维素酶系统至少由两种外切葡聚糖酶、至少六种内切葡聚糖酶和两种β-葡萄糖苷酶组成，其中Tr-Cel7A(CBH I)是瑞氏木霉产生的主要纤维素酶，可以水解固体纤维素，并占瑞氏木霉所分泌纤维素酶的60％(Nidetzky B andClaeyssens M，Biotechnol Bioeng 1994，44：961-966；
J，1991，PhD Thesis，UppsalaUniversity，Sweden)，据文献报道Tr-Cel7A从纤维素的还原端连续水解纤维素链(Barr BHsieh et al.，Biochemistry 1996，35(2)：586-592；Divne C et al.，J Mol Biol 1998，275(2)：309-325；Nutt A et al.，Eur J Biochem 1998，258(1)：200-206.)。Tr-Cel7A含有513个AA(Shoemaker S et al.，Biotechnology(N.Y.)1983，1：691-696)，在催化结构域有10个二硫键，在底物结合结构域含有2个二硫键(Guochao Wu et al.，World J Microbiol Biotechnol2010，26：323-328.)，另外在催化结构域还含有4个潜在的N-糖基化位点，蛋白质相对分子量偏大，结构相对比较复杂，这就为其在酿酒酵母中异源表达增加了难度，很多研究表明在酿酒酵母中分泌表达的重组Tr-Cel7A同样存在分泌效率低(Ilmén M et al.，Biotechnol Biofuels 2011，4：30)，过度糖基化(ME et al.，Gene 1988，63(1)：103-112；Den Haan R et al.，Enzyme Microb Tech 2007，40：1291-1299.)等问题，有必要对酿酒酵母菌株进行改造，提高其对外源蛋白的分泌表达能力。
目前，针对提高酿酒酵母分泌表达体系的方法的研究多集中在单纯改造参与蛋白质合成分泌途径一个或两个蛋白，产生的效果有一定局限，而且对异源蛋白还表现出蛋白质特异性。因此，需要对异源蛋白本身结构进行分析，有针对性的对酿酒酵母蛋白质分泌途径进行多重遗传修饰改造，以获得更高效的酿酒酵母异源蛋白分泌表达菌株。
发明内容
针对上述现有技术不足，本发明要解决的问题是提供一种提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白尤其是针对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白的方法及专用提高酿酒酵母异源蛋白分泌表达的菌株。
本发明所述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，步骤是：
(1)宿主菌改造：以单倍体双缺菌株CEN.PK102-3A(Entian KD and Kotter P，Method Microbiol 1998，26：431-449.)为出发酿酒酵母菌株，利用Cre-loxP系统敲除P-型Ca2+/Mn2+ATPase基因Sc-PMR1和蛋白质误分拣途径受体基因Sc-VPS10，通过构建整合型表达载体pYMIKP-SSO1-PDI1实现二硫键异构酶基因Sc-PDI1和质膜t-SNARE基因Sc-SSO1在基因组上的过表达，获得对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白分泌能力提高的重组酿酒酵母菌株BSX010；
(2)分泌表达载体构建：以pJFE2为空质粒构建重组质粒pJCF，获得包含有异源蛋白的分泌表达载体；
(3)重组菌株构建：将步骤(2)构建的分泌表达载体分别转化到出发酿酒酵母菌株CEN.PK102-3A和步骤(1)所得重组酿酒酵母菌株BSX010中，并通过筛选得到转化成功的转化子，即建立表达异源蛋白的常规菌株(为Sc-PMR1和Sc-VPS10基因未被敲除，Sc-PDI1和Sc-SSO1基因未被过表达的酿酒酵母菌株)和待检测菌株；
(4)菌株培养：对步骤(3)所述常规菌株和待检测菌株分别进行常规培养，收集菌液；
(5)酶活测定：将上述分别收集的菌液离心，取上层培养液进行异源蛋白胞外酶活测定；
(6)判断：以对常规菌株测定的异源蛋白胞外酶活值为基准，判定待检测菌株异源蛋白的分泌表达是否得到提高。
上述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法中：步骤(2)所述空质粒为pJFE2(PengB et al.，Metab Eng 2012，14(1)：9-18.)，该质粒以YCplac33(Gietz and Akio，Gene 1988，74：527-534.)为骨架，引入TEF1启动子-PGK1终止子和TDH1启动子-CYC1终止子。
上述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法中：步骤(3)所述转化优选采用醋酸锂转化法。
上述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法中：步骤(3)所述筛选得到转化成功的转化子的方式优选为：用添加20g/L葡萄糖的含有200μg/mlG418的全合成营养缺陷型培养基SC-Ura筛选正确的转化子。
本发明阐述的提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，通过敲除P-型Ca2+/Mn2+ATPase基因Sc-PMR1，可以促进蛋白质折叠；通过敲除蛋白质误分拣途径受体基因Sc-VPS10，可以减少异源蛋白被蛋白质误分拣途径误分拣到液泡中降解；通过过表达二硫键异构酶基因Sc-PDI1，可以促进二硫键的形成；通过过表达质膜t-SNARE基因Sc-SSO1，可促进蛋白质运输过程中分泌小泡与质膜t-SNARE的结合，与传统的酿酒酵母分泌表达体系优化方法(单重修饰改造)相比，本发明对酿酒酵母宿主菌的蛋白质合成分泌途径，进行了多重修饰改造，尤其针对大分子量二硫键丰富的异源蛋白分泌表达有促进作用。
本发明所述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法中专用的提高异源蛋白分泌表达的重组酿酒酵母菌株，其特征在于：该菌株是一株对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白分泌能力提高的酿酒酵母菌株，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSX010，已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5748。
本发明所述提高异源蛋白分泌表达的重组酿酒酵母菌株BSX010的菌学特征为：CEN.PK102-3A derivative；MATαura3-52 leu2-3112；vps10Δ，pmr1Δ，Sc-SSO1，Sc-PDI1，该酵母菌株是单细胞真核微生物，椭圆形，不运动，营养细胞为单倍体，在固体或液体的复合培养基(YPD，该培养基是现有技术中已有的)并且添加200μg/ml G418的培养条件下为出芽生殖，液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时，呈菌落存在，菌落表面湿润、光滑，呈乳白色。
实验证实：本发明提供的重组酿酒酵母菌株BSX010与常规的酿酒酵母菌株相比较，该菌株能使大分子量二硫键丰富的瑞氏木霉来源的外切葡聚糖酶(Tr-Cel7A)的胞外酶活提高2.56倍。
附图说明
本发明涉及的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSX010，已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5748。
本发明涉及的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSXC10，已于2011年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5657。
图1：PCR扩增带有筛选标记基因的Sc-VPS10基因的同源重组片段：Sc-VPS10基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2。
其中1：Sc-VPS10基因重组臂1；2：Sc-VPS10基因重组臂2；3：Sc-VPS10基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2；M：1kb DNA Ladder。
图2：PCR扩增带有筛选标记基因的Sc-PMR1基因的同源重组片段：Sc-PMR1基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2。
其中1：Sc-PMR1基因重组臂1；2：Sc-PMR1基因重组臂2；3：Sc-PMR1基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2；M：1kb DNA Ladder。
图3：PCR验证Sc-VPS10基因和Sc-PMR1基因被正确敲除的转化子。
其中1：以敲除Sc-VPS10基因的转化子为模板，用引物VPSL1和引物VPSL4，扩增VPS10基因同源重组臂之间的基因片段；2：以敲除Sc-VPS10基因的转化子为模板，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，扩增G418抗性基因片段；3：以敲除Sc-PMR1基因的转化子为模板，用引物PMRL1和引物PMRL4扩增PMR1基因同源重组臂之间的基因片段；4：以敲除Sc-PMR1基因的转化子为模板，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，扩增G418抗性基因片段。
图4：PCR验证G418筛选标记被丢失的转化子。
其中1：以Sc-VPS10基因被敲除的转化子基因组为模板，用引物VPSL1和引物VPSL4，扩增Sc-VPS10基因同源重组臂之间的基因片段；2：以Sc-VPS10基因被敲除的转化子基因组为模板，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，扩增G418抗性基因片段；3：以Sc-PMR1基因被敲除的转化子基因组为模板，用引物PMRL1和引物PMRL4，扩增Sc-PMR1基因同源重组臂之间的基因片段；4：以Sc-PMR1基因被敲除的转化子基因组为模板，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，扩增G418抗性基因片段。
图5：PCR扩增带有BamH I酶切位点的Sc-PDI1基因片段。
其中1：BamH I-PDI1基因片段；M：1kb DNA Ladder。
图6：PCR扩增带有BamH I酶切位点的Sc-SSO1基因片段。
其中M：1kb DNALadder；1：BamH I-SSO1基因片段。
图7：Bgl II酶切线性化pYMIKP。
其中M：1kb DNALadder；1：BglII酶切的pYMIKP。
图8：PCR扩增BamH I-PGK1p-PDI1-PGK1t基因片段以及BamH I酶切pYMIKP-SSO1。
其中1：BamH I-PGK1p-PDI1-PGK1t基因片段；M：1kb DNALadder；2：BamH I酶切的pYMIKP-SSO1。
图9：过表达Sc-PDI1和Sc-SSO1基因使用的重组质粒pYMIKP-SSO1-PDI1构建过程。
图10：PCR验证Sc-PDI1基因是否整合到基因组上。
其中1：PDI1-PGKt基因片段；M：1kb DNALadder。
图11：PCR验证Sc-SSO1基因是否整合到基因组上。
其中1：SSO1-PGKt基因片段；M：1kb DNALadder。
图12：XbaI酶切Tr-cel7A。1：XbaI酶切的Tr-cel7A；M：1kb DNALadder。
图13：XbaI酶切pJFE2。1：XbaI酶切的pJFE2；M：1kb DNA Ladder。
图14：分泌表达Tr-cel7A基因使用的重组质粒pJCF。
图15：PCR验证重组细胞中含有Tr-cel7A基因。
其中1：Tr-cel7A；M：1kb DNALadder。
图16：重组酵母BSXC10产生的胞外Tr-Cel7A酶活测定。
其中：▲：BSXC00(pJFE2)；■：BSXC01(Tr-cel7A)；●：BSXC10(vps10Δ，pmr1Δ，Sc-SSO1，Sc-PDI1，Tr-cel7A)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：参与蛋白运输过程的蛋白质误分拣途径受体基因Sc-VPS10的敲除
方法如下：
(1)PCR扩增Sc-VPS10基因的重组臂：以酿酒酵母CEN.PK102-3A基因组为模板，用引物VPSL1和引物VPSL2，扩增得到200bp的重组臂1(图1)，用引物VPSL3和引物VPSL4，扩增得到200bp的重组臂2(图1)；
其中，上述VPSL1、VPSL2、VPSL3和VPSL4引物序列为：
VPSL1：5’-ACAGCATGATGCAACAGCT-3’
VPSL2：5’-TATTAAGGGTTGTCGACCTGCACTTCAGGGCTTTTCCA-3’
VPSL3：5’-TGATATCAGATCCACTAGTGTAGATAATTCCATATACTTTT-3’
VPSL4：5’-CCGTAACATATGATATATCC-3’
PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)
10×Taq Buffer(含Mg2+) 5微升；
dNTP Mixture(各2.5mM) 4微升；
引物VPSL1和VPSL2(或VPSL3和VPSL4) 各1微升；
模板DNA 1微升；
Taq DNA聚合酶 0.5微升；
灭菌蒸馏水 补至50微升；
PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩Sc-VPS10基因的重组臂1和重组臂2。
(2)PCR扩增带有筛选标记基因的同源重组片段：以步骤(1)得到的重组臂1和重组臂2以及质粒pUG6(Güldener U et al.Nucleic Acids Res 1996，24(13)：2519-2524.)为模板，用引物VPSL1和引物VPSL4，通过融合PCR扩增得到1984bp的两端带有重组臂以及带有loxP位点的G418抗性的筛选标记基因片段：Sc-VPS10基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2(图1)；
其中，上述VPSL1和VPSL4引物序列为：
VPSL1：5’-ACAGCATGATGCAACAGCT-3’
VPSL4：5’-CCGTAACATATGATATATCC-3’
PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)
10×Taq Buffer(含Mg2+) 5微升；
dNTPMixture(各2.5mM) 4微升；
引物VPSL1和VPSL4 各1微升；
模板DNA 1微升；
Taq DNA聚合酶 0.5微升；
灭菌蒸馏水 补至50微升；
PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩同源重组片段：Sc-VPS10基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2。
(3)同源重组片段转化敲除Sc-VPS10基因：转化25微升步骤(2)得到的基因片段Sc-VPS10基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2转化酿酒酵母CEN.PK102-3A，通过含200μg/ml G418的YPD(2％glucose)平板筛选转化子；
(4)PCR验证酿酒酵母转化子：提取步骤(3)所得转化子的基因组，以基因组为模板，用引物VPSL1和引物VPSL4以及Kanlox-up和Kanlox-down，PCR扩增得到1984bp的同源重组臂之间的基因片段和1584bp的G418抗性基因片段(图3)；
其中，上述Kanlox-up和Kanlox-down引物序列为：
Kanlox-up：5’-CAGGTCGACAACCCTTAAT-3’
Kanlox-down：5’-CACTAGTGGATCTGATATC-3’
PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)
10×Taq Buffer(含Mg2+) 5微升；
dNTPMixture(各2.5mM) 4微升；
引物VPSL1和VPSL4(或Kanlox-up和Kanlox-down) 各1微升；
模板DNA 1微升；
Taq DNA聚合酶 0.5微升；
灭菌蒸馏水 补至50微升；
PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。
(5)Cre重组酶表达载体转化：转化25微升质粒pSH47(Güldener U et al.NucleicAcids Res 1996，24(13)：2519-2524.)到步骤(4)验证正确的重组转化子，用SC-Ura平板筛选转化子；
(6)Cre重组酶诱导表达：将步骤(5)所得重组子在液体YPD中培养过夜，收集菌体，用无菌水洗涤两次，将菌体接入YPG培养基(2％galactose)培养步骤(5)所得转化子2h诱导表达Cre重组酶，将诱导培养液涂布于YPD平板分离单菌落；
(7)筛选G418抗性筛选标记去除菌落：将步骤(6)所得单菌落分别点于无G418YPD平板和含200μg/ml G418 YPD平板，在YPD平板上生长并且在含G418 YPD平板上不生长的转化子即为G418抗性筛选标记去除菌落；
(8)PCR验证Cre-loxP重组的重组子：提取步骤(7)所得G418抗性筛选标记去除菌落的基因组，以基因组DNA为模板，用引物VPSL1和引物VPSL4，PCR扩增得到400bp的片段(图4)，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，PCR不能扩增到G418抗性基因，验证后得到正确发生Cre-loxP重组的重组子；
PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)
10×Taq Buffer(含Mg2+) 5微升；
dNTPMixture(各2.5mM) 4微升；
引物VPSL1和VPSL4(或Kanlox-up和Kanlox-down) 各1微升；
模板DNA 1微升；
Taq DNA聚合酶 0.5微升；
灭菌蒸馏水 补至50微升；
PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。
(9)5-FOA丢失质粒pSH47：将步骤(8)所得重组子在液体YPD中转接培养过夜，划线于5-FOA培养基平板筛选去除质粒pSH47，最终得到酿酒酵母菌株BSX002。
实施例2：位于高尔基体膜上P-型Ca2+/Mn2+ATPase基因Sc-PMR1的敲除
方法如下：
(1)PCR扩增Sc-PMR1基因的重组臂：以酿酒酵母CEN.PK102-3A基因组为模板，用引物PMRL1和引物PMRL2，扩增得到200bp的重组臂1(图2)，用引物PMRL3和引物PMRL4，扩增得到200bp的重组臂2(图2)；
其中，上述VPSL1、VPSL2、VPSL3和VPSL4引物序列为：
PMRL1：5’-TGTTCCCTAGGCCATCGT-3’
PMRL2：5’-TATTAAGGGTTGTCGACCTGACACTTAAGCTTACGTCTG-3’
PMRL3：5’-TGATATCAGATCCACTAGTGTCGTTTTTCCTTCCTTCCC-3’
PMRL4：5’-TCTAGTCCGGAAAAAGAAG-3’
PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)
10×Taq Buffer(含Mg2+) 5微升；
dNTPMixture(各2.5mM) 4微升；
引物PMRL1和PMRL2(或PMRL3和PMRL4) 各1微升；
模板DNA 1微升；
Taq DNA聚合酶 0.5微升；
灭菌蒸馏水 补至50微升；
PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩Sc-PMR1基因的重组臂1和重组臂2。
(2)PCR扩增带有筛选标记基因的同源重组片段：以步骤(1)得到的重组臂1和重组臂2以及质粒pUG6为模板，用引物PMRL1和引物PMRL4，通过融合PCR扩增得到1984bp的两端带有重组臂以及带有loxP位点的G418抗性的筛选标记基因片段：Sc-PMR1基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2(图2)；
其中，上述PMRL1和PMRL4引物序列为：
PMRL1：5’-TGTTCCCTAGGCCATCGT-3’
PMRL4：5’-TCTAGTCCGGAAAAAGAAG-3’
PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)
10×Taq Buffer(含Mg2+) 5微升；
dNTPMixture(各2.5mM) 4微升；
引物PMRL1和PMRL4 各1微升；
模板DNA 1微升；
Taq DNA聚合酶 0.5微升；
灭菌蒸馏水 补至50微升；
PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩同源重组片段：Sc-PMR1基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2。
(3)同源重组片段转化酿酒酵母以敲除Sc-PMR1基因：转化25微升步骤(2)得到的基因片段Sc-PMR1基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2到实施例1所得酿酒酵母BSX002中，通过含200μg/ml G418的YPD(2％glucose)平板筛选转化子；
(4)PCR验证酿酒酵母转化子：提取步骤(3)所得转化子的基因组，以基因组为模板，用引物PMRL1和引物PMRL4以及Kanlox-up和Kanlox-down，PCR扩增得到1984bp的同源重组臂之间的基因片段和1584bp的G418抗性基因片段(图3)；
其中，上述Kanlox-up和Kanlox-down引物序列为：
Kanlox-up：5’-CAGGTCGACAACCCTTAAT-3’
Kanlox-down：5’-CACTAGTGGATCTGATATC-3’
PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)
10×Taq Buffer(含Mg2+) 5微升；
dNTPMixture(各2.5mM) 4微升；
引物PMRL1和PMRL4(或Kanlox-up和Kanlox-down) 各1微升；
模板DNA 1微升；
Taq DNA聚合酶 0.5微升；
灭菌蒸馏水 补至50微升；
PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。
(5)Cre重组酶表达载体转化：转化25微升质粒pSH47到步骤(4)验证正确的重组转化子，用SC-Ura平板筛选转化子；
(6)Cre重组酶诱导表达：将步骤(5)所得重组子在液体YPD中培养过夜，收集菌体，用无菌水洗涤两次，将菌体接入YPG培养基(2％galactose)培养步骤(5)所得转化子2h诱导表达Cre重组酶，将诱导培养液涂布于YPD平板分离单菌落；
(7)筛选G418抗性筛选标记去除菌落：将步骤(6)所得单菌落分别点于无G418YPD平板和含200μg/ml G418 YPD平板，在YPD平板上生长并且在含G418 YPD平板上不生长的转化子即为G418抗性筛选标记去除菌落；
(8)PCR验证Cre-loxP重组的重组子：提取步骤(7)所得G418抗性筛选标记去除菌落的基因组，以基因组DNA为模板，用引物PMRL1和引物PMRL4，PCR扩增得到400bp左右的片段(图4)，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，PCR不能扩增搭配G418抗性基因，验证后得到正确发生Cre-loxP重组的重组子；
PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)
10×Taq Buffer(含Mg2+) 5微升；
dNTPMixture(各2.5mM) 4微升；
引物PMRL1和PMRL4(或Kanlox-up和Kanlox-down) 各1微升；
模板DNA 1微升；
Taq DNA聚合酶 0.5微升；
灭菌蒸馏水 补至50微升；
PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。
(9)5-FOA丢失质粒pSH47：将步骤(8)所得重组子在液体YPD中转接培养过夜，划线于5-FOA培养基平板筛选去除质粒pSH47，最终得到酿酒酵母菌株BSX006。
实施例3：参与蛋白质折叠过程的二硫键异构酶基因Sc-PDI1和参与蛋白质运输过程的质膜t-SNARE基因Sc-SSO1的过表达
方法如下：
(1)PCR扩增Sc-PDI1基因和Sc-SSO1基因：以酿酒酵母CEN.PK102-3A基因组为模板，用引物BPDIF和BPDIR，扩增BamH I-PDI1基因片段(图5)，用引物BSSOF和BSSOR，扩增BamH I-SSO1基因片段(图6)；
其中，上述BPDIF、BPDIR、BSSOF和BSSOR引物序列为：
BPDIF：5’-CGCGGATCCATGAAGTTTTCTGCTGGTGCC-3’
BPDIR：5’-CGCGGATCCTTACAATTCATCGTGAATGGC-3’
BSSOF：5’-CGCGGATCCATGAGTTATAATAATCCGTAC-3’
BSSOR：5’-CGCGGATCCTTAACGCGTTTTGACAACGGC-3’
PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)
5×Prime 
Buffer含Mg2+) 10微升；
dNTPMixture(各2.5mM) 4微升；
引物BPDIF和BPDIR(或BSSOF和BSSOR) 各1微升；
模板DNA 1微升；
Prime
HS DNA Polymerase(2.5U/μl) 0.5微升；
灭菌蒸馏水 补至50微升；
PCR反应条件：98℃预变性5分钟，98℃变性10秒，56℃退火15秒，72℃延伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩BamH I-PDI1基因片段和BamH I-SSO1基因片段。
(2)重组质粒pYMIKP-PDI1和pYMIKP-SSO1的构建：将步骤(1)所得BamHI-PDI1基因片段和BamH I-SSO1基因片段通过BamH I酶切，将空质粒pYMIKP(Liu et al.，Journal of Shandong University(Natural Science)2005，40(3)：105-109.)通过Bgl II酶切(图7)，利用PCR产物回收试剂盒纯化酶切产物，然后利用利用T4连接酶连接，16℃反应12小时，得到重组质粒pYMIKP-PDI1和pYMIKP-SSO1；
(3)PCR扩增带有EcoR I的PGK1p-PDI1-PGK1t基因片段：以步骤(2)所得重组质粒pYMIKP-PDI1为模板，用引物BPGKF和BPGKR，扩增BamHI-PGK1p-PDI1-PGK1t基因片段(图8)；
其中，上述BPGKF和BPGKR引物序列为：
BPGKR：5’-CCGGAATTCTCTAACTGATCTATCCAAAAC-3’
BPGKR：5’-CCGGAATTCTAACGAACGCAGAATTTTCGA-3’
PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)
5×Prime
Buffer含Mg2+) 10微升；
dNTPMixture(各2.5mM) 4微升；
引物BPGKF和BPGKR 各1微升；
模板DNA 1微升；
Prime
HS DNA Polymerase(2.5U/μl) 0.5微升；
灭菌蒸馏水 补至50微升；
PCR反应条件：98℃预变性5分钟，98℃变性10秒，56℃退火15秒，72℃延伸3分钟30秒，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩BamHI-PGK1p-PDI1-PGK1t基因片段。
(4)重组质粒pYMIKP-SSO1-PDI1的构建：将步骤(3)所得的PGK1p-PDI1-PGK1t基因片段通过BamH I酶切，将步骤(2)所得的质粒pYMIKP-SSO1通过BamH I酶切(图8)，利用PCR产物回收试剂盒纯化酶切产物，然后利用利用T4连接酶连接，16℃反应12小时，得到重组质粒pYMIKP-SSO1-PDI1(图9)；
(5)重组质粒转化酿酒酵母：用Apa I将步骤(4)所得重组质pYMIKP-SSO1-PDI1酶切线性化，然后转化25微升酶切线性化的pYMIKP-SSO1-PDI1到实施例2的步骤(9)所得菌株BSX006中，用含200μg/ml G418 YPD平板筛选转化子；
(6)PCR验证酿酒酵母转化子：提取步骤(5)所得转化子基因组，以基因组为模板，分别用引物BPDIF和EPGKR，PCR扩增PDI1-PGKt基因片段(图10)，用BSSOF和BPGKR，PCR扩增SSO1-PGKt基因片段(图11)，验证Sc-PDI1基因和Sc-SSO1基因是否整合到基因组上；
PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)
10×Taq Buffer(含Mg2+) 5微升；
dNTPMixture(各2.5mM) 4微升；
引物BPDIF和EPGKR(或BSSOF和BPGKR) 各1微升；
模板DNA 1微升；
Taq DNA聚合酶 0.5微升；
灭菌蒸馏水 补至50微升；
PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。
(7)复筛转化子：将步骤(6)验证正确的转化子在含10,000μg/ml G418 YPD平板上复筛，以提高质粒的拷贝数(Wang et al.，Biotechnol Lett 2004，26，885-890.)，最后获得重组酿酒酵母菌株BSX010。
上述重组酿酒酵母菌株BSX010是一株对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白分泌能力提高的酿酒酵母菌株，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSX010，已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5748。
上述重组酿酒酵母菌株BSX010的菌学特征为：CEN.PK102-3A derivative；MATαura3-52 leu2-3112；vps10Δ，pmr1Δ，Sc-SSO1，Sc-PDI1，该酵母菌株是单细胞真核微生物，椭圆形，不运动，营养细胞为单倍体，固体或液体的复合培养基(YPD，该培养基是现有技术中已有的)并且添加200μg/ml G418的培养条件下为出芽生殖，液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时，呈菌落存在，菌落表面湿润、光滑，呈乳白色。
实施例4：Tr-Cel7A在酿酒酵母中分泌表达
方法如下：
(1)构建分泌表达载体pJCF
①带有Flag标签的Tr-cel7A基因片段通过全基因合成获得(图12)；
②重组质粒pJCF的构建：将步骤①所得带有Flag标签的Tr-cel7A基因片段(核苷酸如SEQ ID NO.1所示)通过Xba I，将空质粒pJFE2(Peng et al.，Metab Eng 2012，14(1)：9-18.)用Xba I酶切(图13)，用PCR产物回收试剂盒纯化酶切产物，CIAP处理Xba I酶切的pJFE2，然后利用T4连接酶连接，16℃反应12小时，得到重组质粒pJCF(图14)；
(2)重组菌株构建：
①重组质粒转化酿酒酵母：分别转化25微升(1)部分步骤②所得具有外切葡聚糖酶I基因的重组质粒pJCF到出发酿酒酵母菌株CEN.PK102-3A和实施例3的步骤(7)所得重组酿酒酵母菌株BSX010中，用含SC-Ura平板筛选转化子；
②从步骤①所得重组转化子中，采用试剂盒提取质粒pJCF(图14)，以提取的质粒为模板，用引物XcelF和XcelR扩增Tr-cel7A(图15)，PCR验证正确后，分别获得表达有Tr-Cel7A的常规菌株BSXC01和待检测菌株BSXC10；
上述待检测菌株BSXC10命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSXC10，已于2011年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5657；
上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSXC10 CGMCC No.5657的菌学特征为：CEN.PK102-3A(EntianKD and Kotter P，Method Microbiol 1998，26：431-449.)derivative；MATα ura 3-52 leu2-3112；vps10Δ，pmr1Δ，Sc-SSO1，Sc-PDI1，Tr-cel7A，该酵母菌株是单细胞真核微生物，椭圆形，不运动，营养细胞为单倍体，固体或液体的全合成营养缺陷型培养基(SC-Ura，该培养基是现有技术中已有的)并且添加200μg/mlG418的培养条件下为出芽生殖，液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时，呈菌落存在，菌落表面湿润、光滑，呈乳白色；
(3)菌株培养：将常规菌株BSXC01和待检测菌株BSXC10分别接到在添加2％的葡萄糖以及200μg/ml G418的Sc-Ura完全合成培养基中，初始OD600＝1.0左右，30℃培养48h，每隔12h取样；
(4)测定胞外分泌的Tr-Cel7A酶活：酶活测定方法参照文献(Deshpande MV etal.，Anal Biochem 1984，138(2)：481-487；Wood TM and Bhat KM，Methods in Enzymology1988，160：87-112；Wu B et al.，Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2006，38(6)：372-378.)。收集常规菌株BSXC01和待检测菌株BSXC10的菌液，离心取100微升上清，与50微升Tr-Cel7A专一性底物底物pNPC(pH5.0，乙酸钠缓冲液配制)混匀，于50℃温浴12h后，用150微升10％Na2CO3终止反应，于405nm处测定吸光值，测定胞外Tr-Cel7A酶活。在50℃，pH 5.0条件下，每分钟水解底物pNPC产生出pNP的微摩尔数，定义为1个酶活力单位。
结果：外切葡聚糖酶I Tr-Cel7A在酿酒酵母中得到活性表达；与仅表达Tr-Cel7A的常规酿酒酵母菌株BSXC01相比，重组酿酒酵母菌株BSXC10产生的胞外Tr-Cel7A酶活提高了2.56倍(图16)。
本实验Tr-cel7A基因全长(GenBank：E00389)由上海博尚生物公司实施合成。本实验所使用的大肠杆菌DH5α感受态细胞以及Taq酶均购于北京全式金生物技术有限公司；所使用的高保真Prime
HS DNA Polymerase、限制性核酸内切酶、CIAP酶以及T4DNA连接酶均购于宝生物(大连)有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒以及酶切产物纯化试剂盒均购于OMEGA bio-tek(USA)。相应的实验操作按产品说明书进行。
本实验所用培养基如下：
大肠杆菌培养使用LB培养基，每L含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g；固体培养基含琼脂20g；115℃灭菌30分钟；添加氨苄青霉素至100μg/ml用于进行抗性筛选。
YPD为一种培养酵母所用的丰富培养基，每L含蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖20g；固体培养基含琼脂20g。
SC-Ura3-葡萄糖基本培养基(1升)配制如下：YNB(酵母基础氮源，无氨基酸)6.7g/L，0.77g/L省却尿密啶的混合物，20g/L葡萄糖；固体培养基含琼脂20g/L。
5-FOA培养基(1升)配制如下：6.7g/L YNB(酵母基础氮源，无氨基酸)，0.77g/L省却尿密啶的混合物，50mg/L尿嘧啶，20g/L葡萄糖，1g/L 5-FOA(5-氟乳清酸)，500ml蒸馏水，用NaOH调pH至6.0-7.0，用0.2μm孔径滤膜过滤除菌；4％的琼脂115℃灭菌30分钟；使用时将两部分1/1混合铺倒平板。
Claims (4)
1.一种提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，步骤是：
(1)宿主菌改造：以单倍体双缺菌株CEN.PK102-3A为出发酿酒酵母菌株，利用Cre-loxP系统敲除P-型Ca2+/Mn2+ATPase基因Sc-PMR1和蛋白质误分拣途径受体基因Sc-VPS10，通过构建整合型表达载体pYMIKP-SSO1-PDI1实现二硫键异构酶基因Sc-PDI1和质膜t-SNARE基因Sc-SSO1在基因组上的过表达，获得对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白分泌能力提高的重组酿酒酵母菌株BSX010；
(2)分泌表达载体构建：以pJFE2为空质粒构建重组质粒pJCF，获得包含有异源蛋白的分泌表达载体；
(3)重组菌株构建：将步骤(2)构建的分泌表达载体分别转化到出发酿酒酵母菌株CEN.PK102-3A和步骤(1)所得重组酿酒酵母菌株BSX010中，并通过筛选得到转化成功的转化子，即建立表达异源蛋白的常规菌株和待检测菌株；
(4)菌株培养：对步骤(3)所述常规菌株和待检测菌株分别进行常规培养，收集菌液；
(5)酶活测定：将上述分别收集的菌液离心，取上层培养液进行异源蛋白胞外酶活测定；
(6)判断：以对常规菌株测定的异源蛋白胞外酶活值为基准，判定待检测菌株异源蛋白的分泌表达是否得到提高。
2.如权利要求1所述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，其特征在于：步骤(3)所述转化采用醋酸锂转化法。
3.如权利要求1所述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，其特征在于：步骤(3)所述筛选得到转化成功的转化子的方式为：用添加20g/L葡萄糖的含有200μg/mlG418的全合成营养缺陷型培养基SC-Ura筛选正确的转化子。
4.一株提高异源蛋白分泌表达的重组酿酒酵母菌株，其特征在于：该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSX010，已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5748。
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