CN102559592B - 一种鱼红细胞氧化应激模型的建立方法 - Google Patents

一种鱼红细胞氧化应激模型的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鱼红细胞氧化应激模型建立方法，将鲤鱼尾部消毒，从每尾鱼尾部抽取约1毫升血液。将血液放入6毫升含肝素钠的鲤鱼生理盐水中，血样在900g，4℃下离心10分钟，弃去上清液。红细胞沉淀悬浮在6毫升鲤鱼生理盐水中，然后在900g，4℃下离心10分钟。用鲤鱼生理盐水重新悬浮红细胞沉淀，洗涤2次后，细胞沉淀悬浮在6毫升鲤鱼生理盐水中，4℃保存备用。取适量的红细胞悬液，加入等体积的Fe2+/H2O2混合溶液，其终浓度为40μM/20μM，37℃孵育8-10小时。样品在1000g，4℃条件下离心3分钟，细胞样用流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳测定凋亡情况。本发明首次使用Fe2+/H2O2混合溶液为自由基·OH的来源，建立红细胞氧化应激模型。

Description

一种鱼红细胞氧化应激模型的建立方法
技术领域
本发明涉及一种鱼红细胞氧化应激模型的建立方法，属于生物技术领域。
背景技术
自由基(单态氧、超氧阴离子、羟自由基)所造成的氧化损伤是鱼体健康水平下降和多种疾病的诱因。同时自由基能直接对肌肉组织的生物大分子如核酸，蛋白质、脂类造成损伤，降低鱼产品品质。因此，研究鱼类氧化损伤和抗氧化机制，提高鱼体抗氧化能力，对鱼类健康养殖，保证鱼产品品质非常重要。
红细胞具有维持内环境稳定、运输、调节、防御等重要功能。但红细胞所处的环境经常与自由基接触。红细胞富含不饱和脂类及铁，其中铁离子是自由基反应的催化剂。因此，红细胞极易受到自由基损伤。一方面损伤膜上的酶和受体，另一方面破坏膜结构，造成功能酶的有序排列紊乱。红细胞氧化损伤会导致其形态上出现棘形、球形等变化，并最终发生细胞破裂、溶血。红细胞的抗氧化系统可以有效保护红细胞免受自由基损伤，保证红细胞的结构和功能正常。由于红细胞的这一些特性以及红细胞易于获取和制备，使之成为研究氧化损伤的最佳模型。
现有技术中，目前还未见关于鱼类红细胞氧化应激模型建立方法的研究报道。因此根据鱼类红细胞的生理生化特点，摸索建立鱼类红细胞氧化应激模型，对于研究鱼类的抗氧化机制，筛选有效的生物抗氧化物质，提高鱼类的抗氧化能力非常必要。但直接使用现有的陆生动物红细胞氧化应激模型的技术和方法来建立鱼类红细胞氧化应激模型，面临下列难题：
(1)离心是从血液中分离红细胞的主要方法，但现有方法主要用于的陆生恒温动物，如鼠、猪等，对于鱼类等水生变温动物并不完全适用。首先，鱼类红细胞结构与陆生动物相比存在明显差异，鱼类红细胞与白细胞一样都具有细胞核，细胞较大，而陆生动物红细胞没有细胞核，较白细胞小。因此，现有的离心参数不适用于鱼类红细胞的分离。需要筛选适用于鱼类红细胞分离的离心参数。其次，鱼类的血液pH和渗透压与陆生动物相比，存在差异。因此，分离鱼类红细胞所用生理盐水的pH和渗透压须调整。
(2)现有技术经常用H2O2建立细胞氧化应激模型。H2O2除了自身具有氧化作用外，也可导致·OH大量形成，加剧蛋白质及脂质的氧化损伤，模拟氧化环境。但H2O2在细胞培养液中代谢较快，浓度不稳定，造模效果的可控性较差。利用FeSO4和H2O2反应模拟体内产生较稳定的·OH浓度，可提高氧化模型的可控性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种简便有效的鱼类红细胞氧化应激模型建立方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种鱼红细胞氧化应激模型建立方法，依次包括以下步骤：
A1、按常规方法将体重相近的3尾鲤鱼尾部消毒，用注射器从每尾鱼尾部抽取约1毫升血液。
A2、将血液放入6毫升含肝素钠(40IU/ml)的鲤鱼生理盐水中，血样在900g，4℃下离心10分钟，弃去上清液。
A3、红细胞沉淀悬浮在6毫升鲤鱼生理盐水中，然后在900g，4℃下离心10分钟。
A4、用鲤鱼生理盐水重新悬浮红细胞沉淀，按步骤A3洗涤2次后，细胞沉淀悬浮在6毫升鲤鱼生理盐水中，4℃保存备用。
A5、取适量的红细胞悬液，加入等体积的Fe2+/H2O2混合溶液，其终浓度为40μM/20μM，37℃孵育8-10小时。
A6、样品在1000g，4℃条件下离心3分钟，细胞样用流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳测定凋亡情况。
优选的，所述的方法，所述步骤A2和A4中，所述鲤鱼生理盐水(mmol L-1)组成如下：NaCl，141.1；KCl，1.43；CaCl2，0.99；NaHCO3，2.64；glucose，6.16；渗透压为280mos mol L-1，pH为7.9。
优选的，所述的方法，所述步骤A5，氧化应激的最适孵育时间为9小时。
与现有技术相比，本发明的鱼红细胞氧化应激凋亡模型建立方法具有以下明显的优点：
1、本发明首次使用Fe2+/H2O2混合溶液为自由基·OH的来源，建立红细胞氧化应激模型。
2、本发明根据鱼类红细胞特点确定了离心分离的关键参数。
3、Fe2+/H2O2混合溶液的最佳使用浓度和适宜孵育时间。
4、本发明所述的培养条件和方法，能够帮助初次进行红细胞分离和氧化应激的研究人员，比较顺利的完成鱼类红细胞分离和氧化应激模型的建立。
附图说明
图1不同剂量Fe2+/H2O2使培养液产生·OH的浓度。Fe2+/H2O2混合液可以稳定产生·OH。
图2不同浓度Fe2+/H2O2诱导的鲤鱼红细胞凋亡。Fe2+/H2O2浓度为40μM/20μM时，红细胞的凋亡率达到最大。
图3不同时间40μM/20μM Fe2+/H2O2溶液诱导鲤鱼红细胞凋亡的DNA碎片裂分析。结果表明孵育时间为9小时时，红细胞的凋亡率达到最大。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
以下实施例中所用鲤鱼生理盐水具体配方为(mol L-1)：NaCl，141.1；KCl，1.43；CaCl2，0.99；NaHCO3，2.64；glucose，6.16。渗透压为280mos mol L-1，pH为7.9。试剂：双氧水H2O2(30％)，硫酸亚铁FeSO4(分析纯)。
实施例1：一种鱼红细胞氧化应激模型的建立方法，依次进行以下步骤：
1、将体重150克左右鲤鱼3尾，按常规方法将尾部消毒，用注射器从每尾鱼尾部抽取约1毫升血液。
2、将血液放入6毫升含40IU/ml肝素钠的鲤鱼生理盐水中，血样在900g，4℃下离心10分钟，弃去上清液。
3、红细胞沉淀悬浮在6毫升鲤鱼生理盐水中，然后在900g，4℃下离心10分钟。
4、用鲤鱼生理盐水重新悬浮红细胞沉淀，按步骤3洗涤2次后，细胞沉淀悬浮在6毫升鲤鱼生理盐水中，4℃保存备用。
5、取适量的红细胞悬液，加入等体积的Fe2+/H2O2混合溶液，其终浓度分别为0/0、10μM/5μM、20μM/10μM、30μM/15μM、40μM/20μM和50μM/25μM，37℃孵育8小时。样品在1000g，4℃条件下离心3分钟，细胞样用流式仪测定凋亡情况。不同Fe2+/H2O2浓度所引起红细胞凋亡的结果如表1、图1和图2所示。
表1不同浓度Fe2+/H2O2混合溶液，产生·OH的浓度，诱导红细胞凋亡的比例(％)
  Fe2+/H2O2   ·OH(U/ml)   凋亡比例(％)
  0/0   0   1.2
  10μM/5μM   18   4.1
  20μM/10μM   39   6.0
  30μM/15μM   51   9.2
  40μM/20μM   73   16.7
  50μM/25μM   82   9.9
6、取适量的红细胞悬液，加入等体积Fe2+/H2O2混合溶液，其终浓度为40μM/20μM，37℃孵育0、6、7、8、9、10、11小时。样品在1000g，4℃条件下离心3分钟，细胞样用琼脂糖凝胶电泳测定凋亡情况。检测结果见图3。根据结果确定的最佳孵育时间为9小时。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种鱼红细胞氧化应激模型建立的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
A1、按常规方法将体重相近的3尾鲤鱼尾部消毒，用注射器从每尾鱼尾部抽取约1毫升血液；
A2、将血液放入6毫升含肝素钠40IU／ml的鲤鱼生理盐水中，血样在900g，4℃下离心10分钟，弃去上清液；
A3、红细胞沉淀悬浮在6毫升鲤鱼生理盐水中，然后在900g，4℃下离心10分钟；
A4、用鲤鱼生理盐水重新悬浮红细胞沉淀，按步骤A3洗涤2次后，细胞沉淀悬浮在6毫升鲤鱼生理盐水中，4℃保存备用；
A5、取适量的红细胞悬液，加入等体积的Fe2+／H2O2混合溶液，其终浓度为40μM／20μM，37℃孵育8-10小时；
A6、样品在1000g，4℃条件下离心3分钟，细胞样用流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳测定凋亡情况；
所述鲤鱼生理盐水组成如下：NaCl141.1mol L-1；KCl1.43mol L-1；CaCl20.99molL-1；NaHCO32.64mol L-1；glucose6.16mol L-1；渗透压为280mos mol L-1，pH为7.9。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A5，氧化应激的最适孵育时间为9小时。
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CN101873863A (zh) * 2007-09-11 2010-10-27 马来西亚棕榈油总署 用于预防和抑制人红细胞的氧化应激与溶血的从棕榈油研磨过程所得的液体植物提取物

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