CN102558091B - 一种苯并噻唑类衍生物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了通式(I)-(II)的苯并噻唑类化合物或其药用可接受的盐，对β-淀粉样蛋白聚集沉积具有抑制和显像作用。当作为显像剂使用时，需使用合适的放射性同位素或适用于磁共振检测的造影剂对其进行标记。该化合物的用途是在制备预防和治疗包括阿尔茨海默病在内的药物中的应用，所述的显像剂是作为β-淀粉样蛋白的聚集或沉积物的显像剂。

Description

一种苯并噻唑类衍生物及其用途

一、技术领域

本发明涉及一类生物活性化合物及其用途，具体地说是一种具有使淀粉样蛋白沉积物成像和抑制其聚集作用的苯并噻唑类衍生物。

二、背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，主要临床表现为认知功能障碍和记忆力衰退、性格和行为改变、判断力下降、生活自理能力丧失等，严重影响着人类的身体健康和生活质量。目前在发达国家，AD已经成为继心脏病、肿瘤和中风之后的第4大杀手。脑组织尸检证实含有大量的由β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成的老年斑(SPs)和由高度磷酸化的tau蛋白形成的神经纤维缠结(NFTs)，以及神经元丢失等，本发明中提到的淀粉样沉积物包括但不限于老年斑。

淀粉样蛋白沉积物构成的老年斑和神经纤维缠结作为AD的两个标志物，也是临床尸检或活检诊断AD的金标准。目前的检测方法主要包括活组织检查和尸检的组织学分析等，这两种方法都有明显的缺陷：活组织检查有较大的创伤和风险，尸检仅能用于死后诊断等。因此，一种简单有效且非侵入性的检测患者脑中这些特征标志物的方法对相关疾病尤其是阿尔茨海默病的诊断和治疗显得尤为重要。

由于脑内的淀粉样蛋白沉积物与正常脑组织具有许多相同的物理性质，如密度和水分含量等，以前曾试图使用磁共振成像(MRI)和计算机X射线断层扫描(CT)对沉积物直接成像，效果难以令人满意，或者仅在某些有利条件下检测到了淀粉样蛋白沉积物。

一些荧光染料，如刚果红(Congo Red，CR)、硫黄素S或硫黄素T等能在体外高度特异性地结合淀粉样蛋白沉积物，但由于带有电荷或极性大而难以通过血脑屏障。将这些高亲和力的配体改造，并使用放射性同位素标记，就可以采用正电子发射体层摄影术(PET)、单光子发射计算体层摄影术(SPECT)等技术对AD患者老年斑进行分布、定量等在体可视化检测，从而早期提高诊断的准确性。同时还可以为抗Aβ药物研究和治疗提供评价依据。

目前比较有潜力的几个配体，大都是基于刚果红、硫黄素(T或S)的结构改造，例如[¹¹C]PIB(Mathis，Wang et al.2003.46：2740-54；Wang，Klunk et al.2004.24：55-62；Klunk，Lopresti et al.2005.25：10598-606.)、[¹²³I]IMPY(Zhuang，Kung et al.2003.46：237-43.；Cai，Chinet al.2004.47：2208-18.)、[¹²³I]IBOX(Zhuang，Kung et al.2001.28：887-94.)、[¹⁸F]FDDNP(Shoghi-Jadid，Small et al.2002.10：24-35.；Nordberg 2004.3：519-27.)、[¹¹C]SB-13(Verhoeff，Wilson et al.2004.12：584-595.；Zhang，Oya et al.2005.48：5980-8.)、[¹¹C]-BF-227(Okamura，Suemoto et al.2005.25：10857-62；Kudo，Okamura et al.2007.48：553-61.)，其中[¹⁸F]FDDNP、[¹¹C]PIB、[¹¹C]SB-13、[¹¹C]-BF-227等已进入临床研究(Shoghi-Jadid，Small et al.2002.10：24-35.；Klunk，W.E.，H.Engler，et al.(2004).55(3)：306-19.；Verhoeff，N.P.L.G.，A.A.Wilson，et al.(2004).12(6)：584-595.；Kudo，Okamura et al.2007.48：553-61.；Nordberg，A.2007.20：398-402.)。

目前已报道的靶向淀粉样蛋白沉积物的配体大致有以下几类：

1.刚果红和柯胺G的类似物

使用与刚果红结构类似的柯胺G(Chrysamine G)及其衍生物，如X-34、ISB、BSB、IMSB、FSB也能有效地结合Aβ，但脑吸收仍较低，可能是其结构中的羧基影响了通过血脑屏障的能力。

2.硫黄素T类似物

对硫黄素T进行分子结构改造，得到TZDM、IBOX、IMPY、6-OH-BTA-1等几种类似物。其中，[¹²⁵I]TZDM、[¹²⁵I]IBOX虽能结合淀粉样蛋白，但正常小鼠脑清除较慢，表明可能在体内存在较高程度的非特异性结合。[¹¹C]6-OH-BTA-1(PIB)是一种效果很好的AD分子探针材料，对于正常小鼠脑具有高的脑吸收和快速的脑清除，PIB的人体试验表明AD病人有高的脑吸收。

3.二苯乙烯类(茋类)

茋类的[¹¹C]SB-13在检测老年斑时显示出潜力，对于正常小鼠脑皮层有较高的初始脑吸收和快速脑清除。以半衰期更长的¹⁸F标记，研究表明这类化合物也是很有潜力的老年斑影像剂。

4.FDDNP类

将非甾体类抗炎药萘普生进行结构改造，得到一个中性亲脂的荧光染料DDNP，再以氟标记为[¹⁸F]FDDNP。PET结果显示能结合老年斑和神经元纤维缠结，而且亲脂性高，易于通过血脑屏障。

除了以上这几类主要的化合物，还有一些从天然产物改造的化合物或类似物，如姜黄素类(Ono，K.，et al.2004.75(6)：742-50.；Ryun，E.K.，et al.2006.49：6111-6119.)、黄酮类、橙酮类、查耳酮类、苯乙烯基色酮类衍生物等(Ono，M.，et al.2005.48(23)：7253-7260.；Ono，M.，et al.2007.15(21)：6802-9.；Ono，M.，et al.2007.361(1)：116-21.)。

三、发明内容

本发明旨在提供一种能与β-淀粉样蛋白结合的化合物从而干扰β-淀粉样蛋白的聚集或沉积(即抑制剂)，并且这样化合物通过放射性同位素标记后又作为β-淀粉样蛋白聚集形成的斑块或沉积形成的沉积物显像剂，所要解决的技术问题是遴选具有上述作用的化合物。

申请人遴选的化合物为苯并噻唑类衍生物。

一种苯并噻唑类衍生物，其特征在于：指的是通式(I)的化合物，

其中，

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆独立表示氢、卤素、-OH、-NH₂、-NHR^a、-NR^aR^b、-COOH、-COOR^a、-NO₂、-OC₁-C₁₂烷基、-C₁-C₁₂烷基、-CF₃、-CN、-OCH₂-苯基、-OCH₂取代苯基、-O-苯基、-O-取代苯基、-CH＝CH-苯基、-CH＝CH-取代苯基、-O(CH₂)_nNR^aR^b、-O(CH₂)_nOR^a、-(OCH₂)_nOR^a、-(OCH₂CH₂)_nOR^a、-(OCH₂CH₂)_nNR^aR^b、-CO-NR^aR^b、-Sn(烷基)₃，其中n为1-6，R^a和R^b独立地表示氢、C₁-C₆烷基或-(CH₂)_m-苯基，m为0-7；

Y为C或N。

一种苯并噻唑类衍生物，其特征在于：指的是通式(II)的化合物，

其中，

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆独立表示氢、卤素、-OH、-NH₂、-NHR^a、-NR^aR^b、-COOH、-COOR^a、-NO₂、-OC₁-C₁₂烷基、-C₁-C₁₂烷基、-CF₃、-CN、-OCH₂-苯基、-OCH₂取代苯基、-O-苯基、-O-取代苯基、-CH＝CH-苯基、-CH＝CH-取代苯基、-O(CH₂)_nNR^aR^b、-O(CH₂)_nOR^a、-(OCH₂)_nOR^a、-(OCH₂CH₂)_nOR^a、-(OCH₂CH₂)_nNR^aR^b、-CO-NR^aR^b、-Sn(烷基)₃，其中n为1-6，R^a和R^b独立地表示氢、C₁-C₆烷基或-(CH₂)_m-苯基，m为0-7；

Y为C或N。

一种苯并噻唑类衍生物(I)和(II)，优选以下基团：

Y为C或N，

R₁、R₄优选H、F、Cl、Br、I、OH、OC₁-C₁₂烷基，

R₂、R₃优选OH、OR^a、O(CH₂)_nOR^a、-(OCH₂CH₂)_nOR^a、-O(CH₂)_nNR^aR^b、NH₂、NHR^a、NR^aR^b、-COOH，

R₅、R₆优选OH、OR^a、NH₂、NHR^a、NR^aR^b、COOH、COOR^a，

其中R^a、R^b独立地表示C₁-C₆烷基或-(CH₂)_n-苯基，n为1-6。

上述苯并噻唑类衍生物的制备方法是以2-氨基苯并噻唑为原料，当与取代苯甲醛缩合后便得到苯并噻唑希夫碱类化合物(I)；若2-氨基苯并噻唑重氮化后再与芳香族化合物偶联后便得到苯并噻唑偶氮类化合物(II)。

上述苯并噻唑类衍生物(I)和(II)包括其药用可接受的盐、酯、酰胺、前药的用途是在制备预防和治疗β-淀粉样蛋白聚集或沉积疾病药物中的应用。

上述苯并噻唑类衍生物(I)和(II)经临床上常用的放射性同位素用公知的方法标记后可作为生物显影剂，即作为β-淀粉样蛋白的聚集或沉积物的显像剂的用途。显像剂通常用于相关疾病在未出现临床症状之前的早期诊断以及相关的在研药物的评价。

放射性同位素通常标记在苯环上或苯环的取代基上，所述的取代基包括(C₁-C₅)烷基、(C₁-C₅)烷氧基、[(C₁-C₅)烷基]氨基、[(C₁-C₅)烷基]烷基氨基。

标记后如下列结构式所示：

适用于MRI即磁共振成像检测用的放射性同位素包括¹⁹F、¹³C、¹⁵N、Mn²⁺、Gd³⁺、Dy³⁺、Fe²⁺、Fe³⁺元素或者纳米铁、Gd-DTPA、Gd-DOPA、Mn-DPDP、氧化铁颗粒、转铁蛋白、卟啉化合物或金属螯合物。

适用于PET即正电子发射体层摄影术或SPECT，即单光子发射计算体层摄影术检测的放射性同位素包括⁹⁹mTc、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、²²Na、⁵²Fe、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁷⁶Br、⁸²Rb。

β-淀粉样蛋白斑块或沉积物的疾病包括：阿尔茨海默病、瘙痒病(Scrapie)、Creutzfeldt-Jakob disease(CJD克雅(氏)病)、库鲁病(Kuru disease)、Down氏综合征、II型糖尿病胰岛瘤、甲状腺的骨髓癌、自发性骨髓瘤、地中海热病、淀粉样蛋白多发性神经病、淀粉样蛋白心肌病、全身性老年淀粉样蛋白病、Muckle-Wells综合征、具有淀粉样变的遗传性脑出血、分离的心房性淀粉样蛋白、包涵体肌炎和肌肉萎缩病中的β2-淀粉样蛋白沉积物、匹克氏病、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶变性、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病(拳击痴呆)、额颞痴呆症、Lytico-Bodig疾病、缠结为主型痴呆、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅性脑病、结节性硬化症等。

苯并噻唑类衍生物(I)和(II)与药学上允许的辅料加工成药物组合物通过公知的方法给药，例如，经口腔、静脉内、肌内、皮下、直肠、脑池内、阴道内、腹腔内、膀胱内、局部(粉剂、软膏或滴剂)或作为颊用或鼻用喷剂等给药方式进行给药；将标记化合物给药于患者可采用全身或局部给药途径，例如，标记化合物可以以传输于患者全身的方式给药，也可将标记化合物给药于特定器官或感兴趣的组织，例如，将脑中的淀粉样沉积物定位和定量，以检测或追踪阿尔茨海默病的发病进程药物的用途。

四、附图说明

图1苯并噻唑类衍生物22结合AD人脑切片上的老年斑染色图片(两张邻近的AD人脑切片分别被染色：A.阳性对照，硫磺素S；B.化合物22)。

五、具体实施方式

以下实施例描述了本发明的方法和组合物，但并不限于此。通常遇到并且对本领域技术人员显而易见的对这些条件和参数的其他适宜修改和改变都在本发明的精神和范围内。

实施例1：苯并噻唑希夫碱类化合物的合成方法

苯并噻唑希夫碱类化合物的合成是由2-氨基苯并噻唑和取代的苯甲醛缩合而成，在乙醇中回流，以有机酸(如醋酸、对甲苯磺酸)或路易斯酸(如氯化锌)催化。

实施例2：苯并噻唑偶氮类化合物的合成方法

苯并噻唑偶氮类化合物的合成，先由2-氨基苯并噻唑和亚硝酸钠在酸性条件下低温反应生成重氮盐，再与芳香化合物偶联得到苯并噻唑偶氮类化合物。

实施例3：苯并噻唑类衍生物的¹¹C放射性同位素标记方法

苯并噻唑类衍生物的¹¹C放射性同位素标记包括对芳环上氨基和羟基的¹¹C放射性标记。其中，对氨基和甲氨基进行放射性同位素改造，可得到¹¹C标记的甲氨基和二甲氨基；对酚羟基进行放射性同位素改造，可得到¹¹C标记的甲氧基。

实施例4：苯并噻唑类衍生物的¹²⁵I放射性同位素标记方法

由溴代苯并噻唑衍生物，在钯催化下与三丁基锡反应得到三丁基锡前体，再与放射性的碘化钠反应得到放射性同位素¹²⁵I标记的化合物。

实施例5：苯并噻唑类衍生物的¹⁸F放射性同位素标记方法

实施例6：化合物3的制备

在50mL圆底烧瓶中，依次加入180mg 2-氨基-6-甲氧基苯并噻唑(化合物1)、151mg 4-硝基苯甲醛(化合物2)、20mL乙醇和0.5mL醋酸，加热回流反应10h。析出固体，抽滤。以无水乙醇洗涤2次，得产物(化合物3)，产率86％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ9.15(s，1H)，8.38-8.35(d，2H，J＝9.0Hz)，8.21-8.18(d，2H，J＝8.7Hz)，7.92-7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.34-7.33(d，1H，J＝2.4Hz)，7.15-7.12(dd，1H，J＝2.4Hz，9.0Hz)，3.91(s，3H)。IR(cm^-1，KBr压片)1601，1558，1513，1483，1342，1220，844.

实施例7：化合物5的制备

在50mL圆底烧瓶中，依次加入180mg 2-氨基-6-甲氧基苯并噻唑(化合物1)、149mg4-二甲氨基苯甲醛(化合物4)、20mL乙醇和0.5mL醋酸催化剂，加热回流反应24h。减压除去溶剂，过硅胶柱，以氯仿：甲醇50/1洗脱，收集相应组分，得产物(化合物5)，产率65％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.79(s，1H)，7.89-7.86(d，2H，J＝9.0Hz)，7.81-7.78(d，1H，J＝8.9Hz)，7.27-7.26(d，1H，J＝2.6Hz)，7.04-7.00(dd，1H，J＝2.6Hz，8.9Hz)，6.74-6.71(d，2H，J＝9.0Hz)，3.87(s，3H)，3.09(s，6H)。IR(cm^-1，KBr压片)γ3033，2938，2832，1603，1577，1471，1230，1167，1061，839。

实施例8：化合物7的制备

在50mL圆底烧瓶中，依次加入180mg 2-氨基-6-甲氧基苯并噻唑(化合物1)、122mg4-羟基苯甲醛(化合物6)、20mL乙醇和51mg对甲苯磺酸催化剂，加热回流反应14h。减压除去溶剂，过硅胶柱，氯仿洗脱，收集相应组分，得产物(化合物7)，产率80％。¹H NMR(300MHz，DMSO-D₆)δ8.93(s，1H)，7.85-7.82(d，1H，J＝8.9Hz)，7.55-7.52(m，2H)，7.32-7.31(d，1H，J＝2.6Hz)，7.08-7.05(dd，1H，J＝2.6Hz，8.9Hz)，6.96-6.93(m，2H)，3.87(s，3H)。

实施例9：化合物9的制备

在50mL圆底烧瓶中，依次加入180mg 2-氨基-6-甲氧基苯并噻唑(化合物1)、107mg 4-吡啶甲醛(化合物8)、20mL乙醇和70mg对甲苯磺酸催化剂，加热回流反应16h。减压除去溶剂，过硅胶柱，氯仿洗脱，收集相应组分，得产物(化合物9)，产率78％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.93(s，1H)，8.75-8.72(d，2H，J＝8.9Hz)，8.10-8.07(d，2H，J＝8.9Hz)，7.89-7.86(d，1H，J＝9.0Hz)，7.32-7.31(d，1H，J＝2.6Hz)，7.12-7.09(dd，1H，J＝2.6Hz，9.0Hz)，3.89(s，3H).

实施例10：化合物12的制备

在50mL反应瓶中依次加入2-氨基-6-溴苯并噻唑(化合物10)2.29g(10.0mmol)、5mL浓盐酸和20mL水，冰浴冷却，将0.83g NaNO₂(12.0mmol)溶于5mL水中，在快速搅拌下，缓慢滴加入上述体系中，于0℃反应40min。滴加用蒸馏水溶解的尿素(1.5mmol)以除去过量的亚硝酸钠，得重氮盐溶液。

在反应瓶中加入200mL氯化铵-氨水缓冲溶液(pH约为9)、邻甲氧基苯酚(化合物11)1.24g(10.0mmol)，冰浴冷却，在氮气保护下，一边搅拌一边缓慢滴入上述重氮盐溶液，滴加完毕，保持0℃反应1h，滴加稀盐酸调节pH值至5～6左右后再搅拌1h。抽滤，水洗，滤饼经硅胶柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯1∶6为洗脱剂，得产物(化合物12)，产率72％。¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ8.25(d，1H，J＝2.5Hz)，8.11(d，1H，J＝8.9Hz)，7.78(dd，1H，J＝2.5Hz，8.9Hz)，7.20-7.16(m，3H)，5.06(br，1H)，3.91(s，3H).

实施例11：C-11放射性同位素标记得化合物13

在3mLV形瓶中，1mg化合物7溶于400μL DMSO，加入10mg干燥的KOH，涡旋5min。[¹¹C]CH₃I以30mL/min鼓泡通过溶液，在95℃加热反应5min。然后，反应产物用半制备HPLC纯化，Prodigy ODS柱，洗脱剂为60％乙腈/40％三乙胺磷酸盐缓冲液(pH7.2)，收集含¹¹C标记的放射性化合物13。

实施例12：I-125放射性同位素标记得化合物16

在20mL三乙胺和二氧六环的混合溶剂(体积比1/1)中，依次加入溴化物141mmol(360mg)、双(三丁基锡)0.6mL、四(三苯基膦)合钯0.05mmol(58mg)，回流反应18小时。停止反应，减压除去溶剂后，过硅胶柱纯化，以石油醚/乙酸乙酯(5∶1)洗脱，得到三丁基锡前体15，产率25％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ9.12(s，1H)，7.84-7.81(d，2H，J＝8.9Hz)，7.78-7.75(d，1H，J＝9.0Hz)，7.26-7.24(d，1H，J＝2.5Hz)，7.04-7.00(dd，1H，J＝2.5Hz，9.0Hz)，6.73-6.75(d，2H，J＝8.9Hz)，3.09(s，6H)，0.86-1.46(m，27H).

室温下，在用于放射性标记的三丁基锡前体化合物15的乙醇溶液(100μg/50μL EtOH)中加入1.5mCi[¹²⁵I]NaI(活性2200Ci/mmol)和100μL 1N HCl，向上述混合溶液中加入50μL3％H₂O₂，反应10min。然后加入饱和NaHSO₃溶液淬灭反应，反应混合液以碳酸钠溶液中和后，再以乙酸乙酯萃取。萃取物经无水硫酸钠柱干燥，N₂吹干。放射性配体用HPLC纯化，Cosmosil C18柱，流动相为乙腈∶水(2/3)，流速1.0mL/min。纯化后的含¹²⁵I标记的放射性化合物16于-20℃保存。

实施例13：F-18放射性同位素标记得化合物20

在圆底瓶中依次加入化合物17297mg(1mmol)、2-溴乙醇125mg(1mmol)、碳酸钾207mg(1.5mmol)和DMF10mL，回流反应10h。减压除去溶剂，过硅胶柱，石油醚∶乙酸乙酯2/1洗脱。收集相应组分，得产物18。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ9.12(s，1H)，7.83-7.80(d，2H，J＝8.9Hz)，7.78-7.76(d，1H，J＝9.0Hz)，7.33-7.31(m，1H，)，7.14-7.10(m，1H)，6.74-6.72(d，2H，J＝8.9Hz)，3.92(m，2H)，3.76(m，2H)，3.09(s，6H)，2.35(br，1H).

称取171mg(0.5mmol)产物18溶于15mL无水吡啶，冷至0℃，在搅拌下加入137mg(0.72mmol)对甲苯磺酰氯，保持0℃反应1h，再室温反应1h。减压除去吡啶，加入20mL水，以20mL二氯甲烷萃取二次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过硅胶柱，以氯仿∶甲醇15/1洗脱。收集相应组分，得前驱体19。

取对甲苯磺酰前体194mg溶于0.2mLDMSO，加入干燥的¹⁸F活性物，120℃加热反应4min。加入2mL水，1mL乙酸乙酯萃取二次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。使用氩气吹扫去溶剂，残余物溶于乙腈，HPLC纯化得到¹⁸F标记的放射性化合物20。色谱条件：Hamilton PRP-1 column(7.0×305mm，10μm)；CH₃CN/dimethyl glutaratebuffer(5mM，pH 7)＝10/1；flow rate＝2mL/min)。

实施例14：AD脑匀浆的竞争结合试验(Ki测定)

使用本领域的经典方法，使用AD病人死后的脑组织匀浆做竞争结合实验。将PBS/BSA、已知的放射性配体([¹²⁵I]IMPY，2-(4′-二甲氨基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-α]吡啶)、AD及对照的脑组织匀浆、待测配体(配制10个梯度浓度)进行分装混匀，依次加入到硼硅玻璃试管中，恒温37℃孵育2h，然后用ZT-II型多头细胞样品收集器通过WhatmanGF/B滤纸(1％的聚乙烯亚胺溶液浸泡过)抽滤将结合和游离的放射配体分离，用10mM的PBS溶液洗3次，然后用γ计数器(科大中佳GC-1200γ放射免疫计数器)测量数据，将试验的结果使用Graphpad 5.0软件，进行非线性回归分析，由此计算得到Ki值。取值是3个独立试验的平均取值士SEM，每个试验重复一次。

表1.几种化合物使用AD人脑匀浆做的竞争结合测定的Ki值(参照配体：[¹²⁵I]IMPY)。

实施例15：苯并噻唑衍生物22的AD人脑石蜡切片染色实验

以硫磺素S为阳性对照，使用连续的AD人脑石蜡切片进行对比染色，步骤如下：

1、脱蜡致水：二甲苯10分钟*2次，100％乙醇10分钟*2次，90％乙醇5分钟，80％乙醇5分钟，70％乙醇5分钟，超纯水漂洗数秒，PBS(pH7.4)5分钟；

2、高锰酸钾溶液(0.25％，PBS配制)处理20分钟(切片出现棕色)，PBS 2分钟，偏重亚硫酸钾(1.0％，PBS配制)和草酸(1.0％，PBS配制)的混合溶液处理切片至棕色褪去，PBS 2分钟3次；

3、增加切片渗透性：0.3％Trioton X-100处理切片20分钟，PBS处理8分钟；

4、组化笔画圈，将化合物22对应的切片和硫磺素S对应的切片分别进行染色，步骤分别如下：

苯并噻唑衍生物的染色：上接第4步

5、PBS配制的3％BSA滴染切片10分钟；

6、苯并噻唑衍生物的工作液(母液：1mg+DMS0200μL+PBS800μL，工作液为母液用PBS稀释10倍)300μL滴染，37℃湿盒中1h；

7、70％乙醇15分钟，PBS 10分钟2次；

8、70％甘油封片，4℃保存。

硫磺素S染色的步骤，上接第4步：

5、硫磺素S(0.5％，PBS配制)，染色20分钟(滴染)；

6、70％乙醇分化10分钟，PBS 5分钟

7、80％甘油封片。

实施例16：β-淀粉样蛋白聚集抑制作用的实验

参照LeVine的方法，应用硫磺素T(ThT)荧光分析法考察小分子化合物抑制Aβ纤维形成的能力(LeVine，H.Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer’s disease beta-amyloidpeptides：detection of amyloid aggregation in solution.Protein Sci.1993，2，404-410；LeVine，H.Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T.Methods Enzymol.1999，309，274-284.)。将Aβ1-40(50μM)、ThT(10μM)和系列不同浓度的待测化合物共孵育8天，测量485nm处ThT的荧光变化(相对于不加抑制剂的Aβ，激发波长430nm)。化合物22在与Aβ浓度比0.02/1时(即1μM)，可显著降低ThT荧光信号，显示出高的抑制率(＞95％)；而化合物5需较高的浓度(2/1，即100μM)，也可降低ThT荧光95％，而在0.02/1(1μM)，ThT信号可降低30％。

Claims (3)

1.一种苯并噻唑类衍生物的用途，其特征是在制备预防和治疗β-淀粉样蛋白聚集或沉积疾病药物中的应用；所述的苯并噻唑类衍生物，指的是通式(-I)的化合物，

其中，当Y为C时：

R₁、R₃、R₄、R₅为氢，R₂为－OCH₃，R₆为－N(CH₃)₂；或者

R₁、R₄、R₅为氢，R₂、R₃为－OCH₃，R₆为－N(CH₃)₂；或者

R₁、R₄、R₅为氢，R₂、R₃、R₆为－OCH₃；

当Y为N时：

R₁、R₄、R₅为氢，R₂、R₃为－OCH₃，R₆为－N(CH₃)₂。

2.一种苯并噻唑类衍生物，其特征在于：指的是通式(II)的化合物，

其中，当Y为C时：

R₁、R₄、R₅为氢，R₂、R₃为－OCH₃，R₆为－N(CH₃)₂；

当Y为N时

R₁、R₄、R₅为氢，R₂、R₃为－OCH₃，R₆为－N(CH₃)₂。

3.一种如权利要求2所述的苯并噻唑类衍生物的用途，其特征是在制备预防和治疗β-淀粉样蛋白聚集或沉积疾病药物中的应用。