CN102552876A - 蓖麻毒素b链蛋白的免疫调节新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蓖麻毒素B链蛋白在免疫调节方面的新用途，属于医药领域范围。蓖麻毒素B链蛋白在制备免疫调节剂中的应用，蓖麻毒素B链蛋白在制备肿瘤辅助治疗剂中的应用。蓖麻毒素B链蛋白可以活化小鼠腹腔巨噬细胞，促进小鼠脾T、B淋巴细胞增殖，增强NK细胞活性，具有免疫调节作用，可作为免疫调节剂，并可用于肿瘤的辅助治疗。

Description

蓖麻毒素B链蛋白的免疫调节新用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及蓖麻毒素B链蛋白在免疫调节方面的新用途。

背景技术

    蓖麻毒素(ricin toxin, RT)源自蓖麻籽的糖蛋白，分子量64kDa。蓖麻毒素的全毒素由A、B两条多肽链通过一个二硫键连接在一起。RTA是一种核糖体灭活蛋白，在哺乳动物细胞内可抑制蛋白质合成；RTB链无毒，具有凝集素活性，可与细胞表面的半乳糖或甘露糖的受体结合，协助A链进入细胞内发挥生物学功能。RTB是一个两叶形或哑铃形结构的分子，由不同的两个球形区域构成相同的折叠拓扑结构，每一个区域又包括三个亚区(α，β，γ)，只有1α和2β有明显的半乳糖结合活性。当两个球形区域都突变时，RTB将失去凝集素活性。目前普遍认为RTB链没有免疫活性。RTB基因与病毒基因连接后融合表达，得到的融合蛋白质具有病毒的抗原性， RTB蛋白能与细胞上含半乳糖的糖蛋白或糖脂结合，具有良好的免疫效果，因此RTB常用作蛋白质表达载体。蓖麻毒素B链蛋白通过基因克隆方法获得，见《蓖麻毒素B链的克隆表达与鉴定》，食品与生物技术学报，2009，28（1），作者刘文森等。

发明内容

本发明提供一种蓖麻毒素B链蛋白的免疫调节新用途。

 蓖麻毒素B链蛋白在制备免疫调节剂中的应用。

蓖麻毒素B链蛋白在制备肿瘤辅助治疗剂中的应用。

本发明研究发现蓖麻毒素B链蛋白可以促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO，活化巨噬细胞杀伤肿瘤细胞，体内体外实验证实其单独作用可以促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，还可协同ConA和LPS促进小鼠脾T、B淋巴细胞的增殖，增强NK细胞活性，具有免疫调节作用。

附图说明

图1 是蓖麻毒素B链蛋白对腹腔巨噬细胞NO分泌的影响图；

图2是蓖麻毒素B链蛋白对巨噬细胞细胞毒作用的影响图；

图3是蓖麻毒素B链蛋白体外对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响图；

图4是蓖麻毒素B链蛋白体内对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响图；

图5是蓖麻毒素B链蛋白体内对小鼠NK细胞活性的影响图。

具体实施方式

蓖麻毒素B链蛋白在制备免疫调节剂中的应用。

蓖麻毒素B链蛋白在制备肿瘤辅助治疗剂中的应用。

蓖麻毒素B链蛋白以下称RTB链蛋白。

实施例1：RTB链蛋白对腹腔巨噬细胞NO分泌的影响

试剂与药品： RTB链蛋白，自制，溶于生理盐水中，稀释成不同浓度（下同），NO检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

动物：Balb/c小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。

方法：采用NO检测试剂盒检测小鼠腹腔巨噬细胞NO的分泌。处死小鼠， 腹腔注射5ｍPBS，轻揉小鼠腹部，剪开腹部，重复冲洗腹腔2或3次；取制备好的巨噬细胞，调整细胞数为1×10⁷个/ml ；将巨噬细胞接种到96孔培养板，加入不同浓度RTB链蛋白100μl/孔，24h后收取上清，采用NO检测试剂盒检测小鼠腹腔巨噬细胞NO分泌。

结果：如图1所示， RTB链蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞NO分泌具有时间和剂量依赖性，10μg/ml和100μg/ml剂量浓度均可刺激NO分泌。LPS为阳性对照。100μg/ml与阳性对照组比较差异显著(P<0.05)。

实施例2： RTB链蛋白对巨噬细胞细胞毒作用的影响

试剂与药品：RTB链蛋白，自制，RPMI-1640培养基购自GIBCO公司。

动物：Balb/c小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。

方法：MTT法检测小鼠腹腔巨噬细胞毒作用。处死小鼠， 腹腔注射5ｍl PBS，轻揉小鼠腹部，剪开腹部，重复冲洗腹腔2或3次；取制备好的巨噬细胞，调整细胞数为1×10⁷个/m；每孔0.1ml将巨噬细胞接种96孔培养板，分别加入不同浓度RTB链蛋白置37℃，5％CO2培养箱中培养48h，加入B16靶细胞（效靶比为10：1）作用48h；终止培养前，每孔加入10μl MTT，继续孵育4h，每孔加入100μl DMSO，振摇10min，于570nm波长处测定吸光度值(A值)。

结果：如图2所示，三个剂量浓度均可增强巨噬细胞肿瘤杀伤活性。

 

实施例3：RTB链蛋白体外对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响

试剂与药品：脂多糖及ConA购自Sigma公司，MTT购自Sigma公司。

动物：Balb/c小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。

方法：

3.1 MTT法检测RTB链蛋白对未活化小鼠脾淋巴细胞增殖影响。无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，加入96孔细胞板每孔100μl，再加入不同浓度RTB链蛋白各100μl，培养44h，收取上清备用，每孔加入10μl MTT，继续孵育4h，每孔加入100μl DMSO，振摇10min，于540nm波长处测定吸光度值(A值)。计算增值指数SI，(SI=样品孔吸光值/阴性对照孔吸光值)。

3.2 MTT法检测RTB链蛋白对LPS和ConA活化T、B淋巴细胞细胞增殖影响。无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，加入96孔细胞板每孔100μl，再加入不同浓度RTB链蛋白及Con A 100μl，使Con A终浓度为2.5μg/ml，培养44h，收取上清备用，每孔加入10μl MTT，继续孵育4h，每孔加入100μl DMSO，振摇10min，于540nm波长处测定吸光度值(A值)。计算增值指数SI (SI=样品孔吸光值/阴性对照孔吸光值)。

结果：如图3所示，RTB链蛋白在单独作用时对小鼠脾淋巴细胞的增殖具有明显作用，与ConA和LPS协同作用时，RTB链蛋白在三个剂量水平均能明显刺激T、B淋巴细胞的增殖，并且随着剂量的增加，其刺激增殖的能力也明显增加，与阳性对照组相比差异显著(P<0.01)。

实施例4：RTB链蛋白体内对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响

试剂与药品：脂多糖及ConA购自Sigma公司，MTT购自Sigma公司；

动物：Balb/c小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。

方法：

4.1 RTB链蛋白免疫Balb/c小鼠。将Balb/c小鼠随机分成5组，分为生理盐水组，实验组（40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg），弗氏佐剂阳性对照组。分别于0、7天免疫2次，第二次免疫后3天处死小鼠。

4.2 MTT法检测RTB链蛋白对未活化小鼠脾淋巴细胞增殖影响。无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，加入96孔细胞板每孔100μl，再加入不同浓度RTB链蛋白各100μl，培养44h，收取上清备用，每孔加入10μl MTT，继续孵育4h，每孔加入100μl DMSO，振摇10min，于540nm波长处测定吸光度值(A值)。计算增值指数SI(SI=样品孔吸光值/阴性对照孔吸光值)

4.3 MTT法检测RTB链蛋白对LPS和ConA活化T、B淋巴细胞增殖影响。无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，加入96孔细胞板每孔100μl，再加入不同浓度RTB链蛋白及Con A 100μl，使Con A终浓度为2.5μg/ml，培养44h，收取上清备用，每孔加入10μl MTT，继续孵育4h，每孔加入100μl DMSO，振摇10min，于540nm波长处测定吸光度值(A值)。计算增值指数SI (SI=样品孔吸光值/阴性对照孔吸光值)。

结果：如图4所示，RTB链蛋白在单独作用时对小鼠脾淋巴细胞的增殖具有明显作用，与ConA和LPS协同作用时，RTB链蛋白在三个剂量水平均能明显刺激T、B淋巴细胞的增殖，并且随着剂量的增加，其刺激增殖的能力也明显增加，与阳性对照组相比差异显著(P<0.01)。

实施例5：RTB链蛋白体内对小鼠NK细胞活性的影响

试剂与药品：MTT购自Sigma公司；

动物：Balb/c小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。

方法：

5.1 RTB链蛋白免疫Balb/c小鼠。将Balb/c小鼠随机分成4组，分为生理盐水组，实验组（40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg）。分别于0、7天免疫2次，第二次免疫后3天处死小鼠。

5.2 MTT法检测RTB链蛋白对NK细胞活性影响。无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，加入96孔细胞板每孔100μl，加入YAK-1靶细胞，设10:1效靶比，培养18h，每孔加入10μl MTT，继续孵育4h，每孔加入100μl DMSO，振摇10min，于540nm波长处测定吸光度值(A值)。

结果：如图5所示，10mg/kg和20mg/kg剂量浓度均可提高NK细胞活性，与阴性对照组相比差异显著(P<0.05)

Claims (2)

1.蓖麻毒素B链蛋白在制备免疫调节剂中的应用。

2.蓖麻毒素B链蛋白在制备肿瘤辅助治疗剂中的应用。

Images