CN102539783A - 用双指示线免疫层析半定量诊断肌红蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断肌酸激酶同工酶的方法。急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)是冠心病中的一个非常严重的类型，是中老年人的常见急症，死亡率较高，据统计，约有1/3-1/2的患者在送至医院之前死亡。在今后20年内，急性心肌梗塞将是全世界范围内患者死亡的头号病因。肌红蛋白(Myo)是心肌受损后最早发生异常增加的心肌蛋白标志物，灵敏度很高，特异性稍低，具有很高的阴性预测值，用于排除心肌梗死。目前，临床上常用的Myo检测的方法为酶联免疫吸附试验和放射性免疫法等方法，上述方法费时、费力、不利于普及而且费用昂贵。免疫胶体金技术近年来发展迅速，得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。本发明采用胶体金免疫层析法，建立快速检测Myo的方法。并且能够半定量检测50ng/mL～200ng/mL这一Myo灰区范围。

Description

用双指示线免疫层析半定量诊断肌红蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断肌红蛋白的方法。

背景技术

随着我国人民生活水平的提高，高血脂、高血压、冠心病的发病率也明显增高。急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)是冠心病中的一个非常严重的类型，为冠状动脉闭塞、血流中断，使部分心肌因严重而持久的缺血发生局部坏死，从而导致心脏功能的严重损害，死亡率较高，据统计，约有1/3-1/2的患者在送至医院之前死亡。急性心肌梗塞在欧美多见，我国相对较少，且北京、天津华北地区较华南、华东稍多。在今后20年内，急性心肌梗塞将是全世界范围内患者死亡的头号病因。

急性心肌梗塞是中老年人的常见急症，如果能够早期诊断，对降低病死率有重要意义。其在急性期死亡率较高，尤其在发病早期。如果在症状发生后的头1-2小时内处理得及时和正确，就有可能使患者脱离危险。对疑似急性心肌梗塞的病人，要及时做心电图检查，并注意追随观察和对比如果能作白细胞计数和分类、血沉、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸磷酸激酶等检查，对早期诊断急性心肌梗塞更为有益。

肌红蛋白(Myo)：Myo是横纹肌中的一种氧合血红蛋白，在心肌损伤后能迅速释放入血。目前检测的Myo不能区分源于骨骼肌或心肌，因此是非心脏特异性的。在急性心肌梗塞后能迅速地从坏死的心肌中释放出来，具有高度的敏感性。其常于胸痛发作后1-2小时开始升高，急性心肌梗塞发作后4-8小时达高峰，故Myo是诊断急性心肌梗塞的早期标志物。肌红蛋白可作为急性心肌梗死(AMI)诊断的早期最灵敏的指标。但特异性差，骨骼肌损伤、创伤、肾功能衰竭等疾病，都可导致其升高。Myo阳性虽不能确诊AMI，但可用于早期排除AMI诊断的重要指标，如Myo阴性，则基本排除心肌梗死，还可用于再梗死的诊断，结合临床，如Myo重新升高，应考虑为再梗死或者梗死延展，由此肌红蛋白在急性心肌梗塞的检测中起着重要的作用。

急性心肌梗塞诊断方法主要有：诊断根据典型的临床表现，特征性的心电图改变以及实验室检查进行诊断。心电图上的ST段抬高和Q波出现是两个高度提示急性心肌梗塞的变化，然而仅仅大约一半的急性心肌梗塞病例就诊时有这些心电图的改变，大约1/4的急性心肌梗塞病人缺乏典型的胸痛，只有恰巧在贴近梗死发生时记录心电图，或者在以后的检查中发现长期存在的病理性Q波才可能发觉。因胸痛怀疑心肌梗塞去急诊在最后肯定是急性心肌梗塞的病人中，有一半是在最初的心电图检查中得不出急性心肌梗塞的诊断，因此对大部分病人而言，临床医师必须通过定时地测定心脏标记物来肯定或否定急性心肌梗塞的诊断。而在各种心肌标志物中，肌红蛋白(Myo)是心肌受损后最早发生异常增加的心肌蛋白标志物，灵敏度很高，特异性稍低，具有很高的阴性预测值，可用于排除心肌梗死。目前，临床上常用的Myo检测的方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射性免疫法，上述方法费时、费力、不利于普及而且费用昂贵。开发简单、快速的急性心肌梗塞诊断方法具有十分重要的经济价值和社会意义。

免疫胶体金技术是20世纪70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。目前金标记技术常与膜载体配合，形成特定的免疫检测方式，如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊断的一个重要发展方向，是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。近年来该技术发展迅速，已经在临床诊断特别是床边检测(POCT)中得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。

利用胶体金的检测方法测定血清中Myo作为急性心肌梗塞的诊断，已被开发，其检测下限为50ng/mL。但是对于临床上单独使用50ng/mL这一标准不能直接、快速区分急性心肌梗塞严重程度，所以开发能够检测Myo 50～200ng/mL这一Myo诊断灰区的半定量胶体金试纸也是十分必要的。目前国内外均无相关的试纸条出售。

发明内容

本发明的目的：开发简单、快速的急性心肌梗塞诊断方法具有十分重要的经济价值和社会价值。本实验采用胶体金免疫层析法，建立快速检测Myo的方法。并且能够半定量检测50ng/mL～200ng/mL这一Myo灰区范围。

本发明是通过以下技术方案实现的：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗Myo单克隆抗体1并均匀涂布于胶金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的Myo单克隆抗体2固定于两个检测线(即T线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。

本发明方法包括如下步骤：

一、胶体金溶液配制

1.配制1％氯金酸溶液；

2.配制2％柠檬酸三钠溶液；

3.将0.02％的氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入2％的柠檬酸三钠2mL；

4.溶液由浅蓝色，深蓝，再加热出现酒红色，继续煮沸10min；

停止加热，继续搅拌至室温。

二、胶体金标记物的制备

1.取两个1.5mL试管，分别加入1mL胶体金溶液；

2.加入适量硼砂缓冲液把pH调整为8.5；

3.加入20μg/mL Myo单克隆抗体1，使其达到最小蛋白浓度，混匀，振荡30min；

4.加入20μL的10％BSA，混匀，振荡30min；

5.12000rpm离心5min，轻轻吸除上清；

6.用1mL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；

7.重复5.步操作；

8.重复6.步操作；

9.重复5.步操作；

10.用fix buffer配制在540nm处OD(光密度)值为0.5～1.0的胶体金免疫复合物；

11.玻璃纤维素膜点样，形成胶金垫，真空冻干3小时。

三、在硝酸纤维素膜上划线

1.T1线用浓度为1.5mg/mL的Myo单克隆抗体2划线，用于检出50ng/mL的Myo；

2.T2线用浓度为0.5mg/mL的Myo单克隆抗体2划线，用于检出200ng/mL的Myo；

3.C线用2.0mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划线；

4.将硝酸纤维素膜置于40℃烘箱干燥3天。

四、胶体金试纸条的组装

1.将样品垫、胶金垫、NC膜和吸收垫4部分按顺序组装(见附图1)；

2.将其组装好后用剪刀剪成4mm/条后进行检测。

五、检测

试纸平放，将样品加到检测条的样本垫上，由于毛细效应，液体的层析方向向前，与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后，根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。C线与靠近C线的检测带出现红色为样本中Myo水平大于50ng/mL(见附图2)，C线与两条检测带都出现红色为样本中Myo水平大于200ng/mL(见附图3)，只有C线出现红色的为阴性(见附图4)，T线和C线均不显色则试纸条无效。

本发明检测对象单一且针对性强，准确率高。检测速度快，所需时间短，只需5min，不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测，满足医院、门诊等部门快速、准确地诊断心肌梗塞的要求，并且便于基层推广和运用。

附图说明

图1为本发明实施例试纸条的图示

图2为本发明实施例试纸条的阳性结果(Myo水平大于50ng/mL)

图3为本发明实施例试纸条的阳性结果(Myo水平大于200ng/mL)

图4为本发明实施例试纸条的阴性结果

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本实例先用2％的柠檬酸三钠溶液制备20nm的金水，并标记Myo单克隆抗体1喷金标垫，Myo单克隆抗体2、羊抗鼠多克隆抗体分别包被至检测线(T线)、质控线(C线)，然后组装成试纸条，置37℃烘箱烘干并裁成4mm/条，室温干燥保存备用。

实施例

1.准备Myo单克隆抗体1和2。并清洗实验所需的玻璃器皿。

2.胶体金的制备

先将0.02％氯金酸溶液溶液加热煮沸，迅速加入2％的柠檬酸三钠2mL；

溶液颜色由浅蓝色变为深蓝，继续加热出现酒红色，继续煮沸10min；出现透明的酒红色，停止加热，继续搅拌至室温。这样就制备了20nm的胶体金溶液。然后用电镜镜检，确保制备的金颗粒尽量使其大小一致、均匀，颗粒直径在20nm左右，否则重新制作。

3.胶体金标记物的制备

取两个1.5mL试管，分别加入1mL胶体金溶液；向其中加入适量硼砂缓冲液把pH调整为8.5；加入20μg/mL Myo单克隆抗体1，使其达到最小蛋白浓度，混匀，于振荡仪上快速振荡30min；加入20μL的10％BSA，混匀，振荡30min；于离心机中12000rpm，离心5min，轻轻吸除上清；用1mL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；于离心机中12000rpm，离心5min，轻轻吸除上清；用1mL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；于离心机中12000rpm，离心5min，轻轻吸除上清；用fix buffer配制在540nm处OD(光密度)值为0.5～1.0的胶体金免疫复合物；在玻璃纤维素膜上点样，形成胶金垫，真空冻干3小时。

4.胶体金试纸条的组装

分别将1.5mg/mL和0.5mg/mL的Myo单克隆抗体2划在硝酸纤维素膜的检测线(T线)上，将2.0mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划在质控线(C线)上。然后将硝酸纤维素膜置于烘箱中40℃干燥3天。然后将各个部分按附图1组装成试纸条。

5.胶体金试纸条的使用及结果判读

检测前，先提取被检者的血清样本。

然后把试纸条试纸平放，将样品加到检测条的样本垫上，由于毛细效应，液体的层析方向向前，与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后，根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。C线与靠近C线的检测带出现红色为样本中Myo水平大于50ng/mL(见附图2)，C线与两条检测带都出现红色为样本中Myo水平大于200ng/mL(见附图3)，只有C线出现红色的为阴性(见附图4)，T线和C线均不显色则试纸条无效。

实施例可直接检测样品中的Myo，使用方法不需要专业培训，操作方便、快速，5min即可获得结果，可达到快速、简便、及时地检测Myo的目的。

Claims (3)

1.一种用双指示线免疫层析半定量诊断肌红蛋白的方法，其特征在于，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗Myo单克隆抗体1并均匀涂布于胶体金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的Myo单克隆抗体2固定于两个检测线(即T线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。

2.根据权利要求1所述的一种用双指示线免疫层析半定量诊断肌红蛋白的方法，其特征在于，抗体划线浓度为：

T1线用浓度为1.5mg/mL的Myo单克隆抗体2划线，用于检出50ng/mL的Myo；

T2线用浓度为0.5mg/mL的Myo单克隆抗体2划线，用于检出200ng/mL的Myo；

C线用2.0mg/mL羊抗鼠多克隆载体划线；

将硝酸纤维素膜置于40℃烘箱干燥3天。

3.根据权利要求1所述的一种用双指示线免疫层析半定量诊断肌红蛋白的方法，其特征在于，运用不同浓度的抗体溶液在相同的基质上划线，以胶体金方法检测多个不同浓度水平物质的方法。

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