CN102539781A

CN102539781A - 华支睾吸虫病trfia诊断试剂盒及其使用

Info

Publication number: CN102539781A
Application number: CN2010106194820A
Authority: CN
Inventors: 徐劲; 余新炳; 吴英松; 邓传欢; 董志宁; 王征; 李来庆
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Foshan Shunde Zhiyan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102539781B

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了华支睾吸虫病TRFIA诊断试剂盒及其使用。本发明的华支睾吸虫病诊断试剂盒，包括：TRFIA反应板、阴性对照、阳性对照、铕标记物、样品稀释液、浓缩洗涤液和增强液，所述TRFIA反应板上包被有华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2，所述华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2是具有SEQIDNO.1的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽。还进一步公开了该华支睾吸虫病诊断试剂盒中的应用。本发明的华支睾吸虫病诊断试剂盒具有特异性强、灵敏度高、准确度高等特点，可较好地运用于华支睾吸虫病的诊断,本试剂盒的主要试剂均采用工作液形式，可直接使用，较传统的病原学诊断方法优势为：操作准确、简便、结果可信。

Description

华支睾吸虫病TRFIA诊断试剂盒及其使用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用时间分辨荧光分析法检测华支睾吸虫病的TRFIA试剂盒及其使用。

背景技术

华支睾吸虫病是一种人兽共患寄生虫病，成虫寄生在肝胆管内，成虫会破坏胆道上皮和粘膜下血管，并产生分泌排泄抗原，引起胆管和胆管周围的炎症反应，导致胆管局限性扩张和胆管上皮细胞增生。一些抗原成分还能够通过胆管上皮细胞进入肝组织，引起炎症反应和肝功能损伤。长期的严重感染会导致纤维组织增生和肝细胞的萎缩变性，甚至引起癌变、腹水和肝硬化。肝吸虫阻塞胆管，使胆汁流出不畅，易合并细菌感染和出现胆石症。

肝吸虫病的防治主要依靠综合防治措施。在流行区强化对人群的普查普治，并加强疫苗的研制，以减少传染源和保护易感人群。目前，肝吸虫病防治研究的重点集中在诊断和疫苗候选抗原、药物靶标、致病的分子机理研究。

转移酶类是催化底物之间进行某些基团的转移或交换的酶类，是生物体内肝细胞结合反应(属第二相反应)中重要的催化剂之一。谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase，GST)(EC2.5.1.18)是广泛存在于各种生物体内的由多个基因编码的、多功能的同工酶，是催化谷胱甘肽与多种亲电子化合物连接的酶家族，构成酶的亚单位至少有7个，大部分酶存在于细胞质中以同二聚体或异二聚体形式存在。

GSTs在生物体中的重要功能之一是对内、外源性毒物的解毒作用。包括人在内的生物体都暴露在大量外源化合物存在的环境中，一些化合物在代谢活化后有亲电子反应性，导致与内源性分子共价结合，蛋白质是重要的生物大分子，外源分子与其结合后经常改变其功能。谷胱甘肽转移酶主要通过酶催化作用促使谷胱甘肽与有害异物结合，或以非酶结合方式将体内各种具有潜在毒性的化学物质、染料、致癌物从体内排出，从而达到解毒目的，近年来发现谷胱甘肽转移酶对于研究肝脏疾病的发生、发展、转归和预防有重要意义。其催化反应特性决定了其在防止脂质过氧化损伤扩大、抵御及修复DNA损伤以降低肿瘤发生以及癌细胞耐药性形成等方面的重要作用。

GSTs是抗恶性疟原虫潜在的药物靶标，蠕虫的GSTs参与对由虫体代谢和宿主免疫系统所产生的脂质过氧化物和细胞毒性的羰基的解毒，也被认为是免疫疗法和化学疗法的一个潜在的靶标。其中，主要定位于成虫实质的血吸虫GST-26和GST-28，是WHO提出的6个最具潜力的候选疫苗分子之一。在大肠杆菌中表达恶性疟原虫的重组GST有催化活性。华支睾吸虫的26KDa GST和28kDa GST的编码基因在原核表达也有催化活性，并且重组的26kDaGST可用于检测IgG和IgE抗体。因而，原核表达有活性的重组GST是可行的.并且易于得到大量的重组蛋白质以用于功能研究。

本发明人经过广泛而深入的研究，从华支睾吸虫中分离了编码谷胱甘肽转移酶2cDNA，并表达纯化了谷胱甘肽转移酶2，并进一步揭示了基于此多核苷酸与多肽的应用。

发明内容

本发明在提供分离的华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2及其制备与应用的基础上，提供一种华支睾吸虫病TRFIA诊断试剂盒。

本发明公开了一种分离的华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2，它是具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；入噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRS和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞大肠杆菌BL21/DE3；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO，COs.293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

前述分离的华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2的制备方法，一般来说有以下步骤：(1)用编码本发明的华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法〔如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理〔盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

根据本发明实施例列举的，一个恰当的制备华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2的方法为：

1)将华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2的编码基因克隆入原核表达载体pET-30a(+)；

2)将重组的表达载体转化大肠杆菌BL21/DE3感受态细胞后筛选阳性克隆；

3)大肠杆菌BL21/DE3的诱导表达；

4)收集大肠杆菌BL21/DE3的诱导表达后的培养液上清，经亲和层析获得纯化的蛋白。

上述华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2可用于制备华支睾吸虫病诊断试剂盒。

华支睾吸虫病的诊断除了常规的病原生物学检查，主要的方法是使用免疫学诊断试剂盒。主要有两类：酶联免疫试剂盒(ELISA)和快速免疫胶体金试剂盒(ICT)。华支睾吸虫病的诊断即可通过检测血清或尿液中的循环抗原判断现症感染，也可通过检测血清或唾液中的特异性抗体来快速筛查。由于华支睾吸虫主要是寄生在组织外，所产生的抗原成分绝大部分随着胆汁排入肠道，只有感染度高，虫体对胆管阻塞严重，引起胆管上皮严重破损时，其分泌排泄物才能进入肝脏和外周血中。进入外周血中的循环抗原大部分被抗体所中和，只有少量游离的循环抗原可被检测到。因此，检测循环抗原的方法虽然能反映现症感染，但是敏感性较低。目前，临床用于辅助诊断的主要是抗体检测试剂盒。检测抗体的方法分为两种，一是用标记二抗作为检测试剂与被包被在反应板或反应膜上的抗原所捕获的抗体相结合，一种是用标记的抗原作为检测试剂。二抗作为检测试剂，一般只能检测一种抗体，而且非特异性结合比较高；标记抗原作为检测试剂，能检测多种抗体，特异性更高。

本发明公开了一种华支睾吸虫病诊断试剂盒，包括：TRFIA反应板、阴性对照、阳性对照、铕标记物、样品稀释液、浓缩洗涤液和增强液，其中，TRFIA反应板上包被有上述华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2。

所述华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2为基因工程重组表达的华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2。

所述铕标记物为铕标记抗人IgG4二抗。

较佳的，样品稀释液的配方为：生理盐水；浓缩洗涤液的配方为：Tris-HCl缓冲液(pH7.8)，进一步的，所述样品稀释液中还含有防腐剂如硫柳汞0.01％(w/v，0.01g/100ml)。

所述增强液可选自常规。

除上述试剂外，华支睾吸虫病诊断试剂盒中还可包括封板膜及说明书。

本发明进一步公开了前述华支睾吸虫病诊断试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

1).配液：将浓缩洗涤液稀释配制洗涤液；

2).加样：分别在TRFIA反应板的相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照并用样品稀释液稀释；

3).孵育：用封板膜封板后置室温平摇60分钟；

4).用洗涤液洗涤后每孔加入铕标记物；

5).孵育：用封板膜封板后置室温平摇60分钟。

6).用洗涤液洗涤后每孔加入增强液混匀反应；

7).测定：测定各孔荧光值。

本发明的华支睾吸虫病诊断试剂盒以谷胱甘肽转移酶2作为诊断抗原，采用时间分辨荧光分析法(间接法)检测华支睾吸虫病人血清中的IgG4抗体，其一抗血清和二抗铕标记物的孵育时间各需60分钟(室温即可)。

附图说明

图-1重组蛋白GST2的催化活性检测中加入不同体积重组GST2的产物-时间曲线

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：谷胱甘肽转移酶2的克隆

用NCBI的ORF FINDER程序寻找Unigene中完整的开放阅读框(ORF)，用BLASTx程序判定是否为全长基因，其中的全长基因是已知基因还是新基因，编号为c003el0a的最大的ORF为639bp，我们将它简称为GST2。

1)华支睾吸虫基因组的提取：

从猫肝中收集10条华支睾吸虫成虫，PBS洗净后，离心去上清。匀浆后加入10倍体积的裂解缓冲液(STE，含2％SDS，0.2mg/ml，蛋白酶K)，混匀，37℃水浴过夜。次日，将溶液放至室温，加入等体积平衡酚，上、下轻轻颠倒约10min，室温10000rpm离心15min，取上层水相，重复抽提2次，取上层水相，加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，混匀，12000rpm离心10min，弃上清，70％乙醇洗两次，12000rpm离心5min，弃上清，待乙醇挥发尽后，加30μl TE(10mmol/LTris-HCI，1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解，取5μl用1％琼脂糖凝胶分析，余下样品-20℃保存备用。

2)感受态细胞的制备：

从培养板上挑取BL21/DE3单菌落入5ml LB培养液中，37℃250转/分(rpm)振摇过夜。次日取150μl加至3ml LB培养液中，37℃250rpm振摇至A₆₀₀＝0.6。取出菌液，冰浴30min，4℃，4000rpm离心5min，弃上清，加入0.1mol/L的氯化钙750μl，冰浴30min，4℃，4000rpm离心5min，弃上清，加入0.1mol/L的氯化钙400μl，分装100μl/管，4℃保存24h内用或每管加入30％灭菌甘油混匀后-70℃保存，3个月内使用。

3)GST2基因的扩增与克隆：

1.1基因的扩增、原核表达质粒的构建及鉴定

分别以文库质粒cDNA和基因组DNA为模板，

上游引物P1为5′GCGAATTCCACATGAAACACAGACACTGTG3′，引入了两个保护性碱基和EcoR I酶切位点；

下游引物P2为5′CGGTCGACGTTAATCGTCGCCACAGTC3′，引入了两个保护性碱基和Sal I酶切位点。

用TaKaRa Ex Taq^TM酶扩增该基因的反应条件如下：95℃预变性3min，94℃变性1min，61℃退火50sec，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸8min。PCR产物用12g/L的琼脂糖凝胶电泳分析验证，获得分子量为639bp的片段。PCR产物回收，进行EcoR I和Sal I双酶切，与进行同样双酶切的原核表达载体pET-30a(+)按物质量比3-4∶1用T4DNA连接酶于16℃连接18h。取100μl BL21/DE3感受态细胞，加入上述连接产物，轻轻混匀后冰浴1h，42℃水浴90sec，冰浴5min，加入LB培养液400μl，混匀后放入37℃水浴2min，37℃150rpm摇1h。所有菌液铺至经预热的含卡那霉素的LB平板中，在37℃温箱倒置培养12-16h。含阳性质粒的菌液用30％灭菌甘油-70℃冻存备用。

鉴定：测序结果表明，克隆入pET-30a(+)的华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2的基因序列为SEQ ID NO.2。

AATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCCACATGAAACACAGACACTGTGCGCTATTCTATTTCAACGTCCGTGGCAGAGCTGAGGCGATTAGGATGGTACTGCACGCTAACGATGTTTCGTTTGAGGATGTGCGTTTCGATAAGGACCAATGGTCTGAACGCAAACACGAGTTTCCGGGTGGTAAATTACCGCTTCTCCAAGTAAGAGAAGAGGGATCACAAGAGAAGAAGACTTATACAGAGAGCATGGCGATCGCCCGAGTGCTCGCAAAACACTACAGTATGATGGGCGATTCTGAAGAGGAATATTACAAGATTGAACGAATGATTGGGCAGTGTGCCGATTTGGATAAGGAGTTTGTCAATGTCTTTTTCGCACGAGAAGACCAAAAGAAAGAAGTACTTGAGAAAGCAATGGGTGGAGAGGTGCCGAGACTACTGGAACTTATTTGCAAATCACTCTCTGAATCTGGTGGCAAGTTCGTCGCTGGTAACAAAGTAACTCTTGGAGACATATGCCTTATGGCATCCATGGAAAATGTACGGAGAGCGGACCCTCAGCTTTTGAAAACGAAATATTCGACATTATTGGCCCTCGAGGCGGAGGTGTTCAAGGTCCTGCCGAAACTTGCGGACTACGTCAAAACACGACCAGAAACCGTCCTGTGAAGCAGACTGTGGCGACGATTAACGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGT(SEQID NO.2)

1.2CsGST2基因在大肠杆菌BL21/DE3的诱导表达

以含空质粒pET-30a(+)的BL21/DE3为阴性对照。含重组质粒的pET-30a(+)-CsGST2的BL21/DE3接种于含有卡那霉素的培养基，37℃，250rpm，振荡培养过夜后按10ml/L转接，在37℃，250rpm，振荡培养至A₆₀₀＝0.6，取出1ml作为诱导前样品，其余菌液加入IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导培养4-5h，取出1ml作为诱导后样品。所有样品4℃，8000rpm，15min离心后收集菌体，少许沉淀加5μl DTT，95μl 1×SDS，30μl上清加2μl DTT，8μl 4×SDS，重悬混匀，沸水浴5min，沉淀13000rpm离心1min，上清稍点动即可，取上层液10μl行SDS-PAGE(分离胶150g/L，浓缩胶50g/L)，用考马斯亮蓝染色，观察有表达后，蛋白在上清内有表达，沉淀内无表达，进行大量表达及纯化。

1.3CsGST2基因在大肠杆菌BL21/DE3的大量诱导表达

37℃，250rpm，振荡培养过夜的菌液按20ml/L的比例转接至1000ml LB培养液中，37℃，250rpm，振荡培养至A₆₀₀＝0.6，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导培养4-5h，用4℃，8000rpm，15min离心后弃尽上清培养液，收集菌体，加入1×结合缓冲液(5mM咪唑+0.5MNaCl+20mM Tris-HCl，PH7.9)12-15ml重悬混匀完全，收集，存于-20℃，次日超声裂解细菌(功率150W，持续1sec，停2sec，共15min)，4℃，13000rpm，15min，收集上清，0.45μm微孔滤膜过滤。

1.4亲和层析纯化蛋白

Ni-NTA树脂，梯度浓度咪唑20mM、30mM、40mM、60mM、200mM及400mM咪唑将洗脱出来的GST2蛋白行SDS-PAGE验证为目的蛋白，取纯度高、量大的收集在一起，装入透析袋(透析液为1×PBS，PH7.4)，4℃透析24h(换液2-3次)。透析后的溶液用0.22μm微孔滤膜过滤，分装，-80℃保存备用。

鉴定：蛋白测序结果表明，纯化获得蛋白的序列为SEQ ID NO.1。

MKHRHCALFYFNVRGRAEAIRMVLHANDVSFEDVRFDKDQWSERKHEFPGGKLPLLQVREEGSQEKKTYTESMAIARVLAKHYSMMGDSEEEYYKIERMIGQCADLDKEFVNVFFAREDQKKEVLEKAMGGEVPRLLELICKSLSESGGKFVAGNKVTLGDICLMASMENVRRADPQLLKTKYSTLLALEAEVFKVLPKLADYVKTRPETVL(SEQ ID NO.1)

1.5谷胱甘肽转移酶2活性测定

重组蛋白催化活性研究

1).重组蛋白GST2的定量：

用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准(参见Bradford MM.A rapid and sensitivemethod for the quantitation of protein utilizing the principle of protein-dye binding.AnalytBiochem，1976，72：248-254)。

2).试剂的配制：

CDNB用无水乙醇配制成20mmol/L溶液。GSH用水配制成20mmol/L溶液。

3).反应体系为：

0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.5)，GSH，CDNB，重组蛋白，反应体积为3ml，反应温度为25℃(在加入无水乙醇配制的试剂时，应注意无水乙醇的体积不超过反应总体积的四分之一)(参见Habig WH，Pabst MJ，Jacoby WB.Glutathione S-transferase：the firstenzymatic mercapturic acid formation.J Biol Chem，1974，249：7130-7139.)。空白对照用0.1mol/L磷酸钠缓冲液，所有孵育反应做三管，取平均值。测最大反应速度时，以仅不加重组蛋白的反应体系作阴性对照，以华支睾吸虫成虫粗酶作阳性对照。用先加有缓冲液、GSH和CDNB的反应体系(GSH和CDNB的终浓度均为1mmol/L)在25℃水浴中孵育5min，加入不同体积重组蛋白启动反应，测定1-5min的A₃₄₀。选定合适的重组蛋白量后，用仅不加CDNB的反应体系作阴性对照，将加有GSH(终浓度1mmol/L)、重组蛋白和缓冲液的反应体系在25℃水浴中孵育5min，加入不同浓度CDNB启动反应，测在25℃反应5min的A₃₄₀，根据产物S-(2，4-二硝基苯)谷肤甘肽(P)的毫摩尔消光系数Δe＝9.6L·mmol^-1·cm^-1，计算酶的活性单位(参见Habig WH，Pabst MJ，Jacoby WB.GlutathioneS-transferase：the first enzymatic mercapturic acid formation.J Biol Chem，1974，249：7130-7139.)。米氏常数Km根据米氏方程用统计软件SPSS13.0以底物浓度的倒数作为自变量、速度的倒数作为应变量进行线性回归计算获得。

4).重组蛋白GST2的催化活性

在1-5min内，加入1、5、10μl的重组蛋白GST2，生成产物量不同，如图-1所示，当加入5μl或10μl GST2反应5min，产物的量不再随时间的延长而增加，GST2的活性单位为22.76±0.096μmol·mg^-1·min^-1。5μl GST2在25℃催化不同浓度CDNB反应5min A₃₄₀的上升值见表-1，同上处理数据得到GST2的平均Km为111μmol。

5μl GST2催化不同浓度CDNB的A₃₄₀

表-1

实施例2：谷胱甘肽转移酶2的物理化学性质

将亲和层析纯化的谷胱甘肽转移酶2，用enterokinase酶切除载体序列后，经SDS-PAGE电泳，和标准分子量曲线，测得其分子量约为30kDa；利用Amerham等电聚焦电泳仪，经pH3-10和pH7-10梯度固定胶的等电聚焦电泳，测得其等电点为6.97。蛋白质的结构稳定。

实施例3：制备诊断试剂盒

此前华支睾吸虫抗体的检测多采用粗抗原或分泌排泄抗原包被反应板，敏感性、特异性均不十分理想，而本发明采用实施例1获得的基因工程重组抗原GST2包被反应板，用间接TRFIA法检测华支睾吸虫病人体内的IgG4抗体。

试剂盒的装配：

1.反应板的制备(96孔/板)：

将实施例1获得的纯化的华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶-2(GST2)用碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)配成2μg/ml，96孔反应板，每孔加100μl，包被后室温平摇30分钟，4℃过夜，次日早晨再次室温平摇30分钟后，倒掉包被液，拍干，0.5％BSA(w/v)+3％海藻糖(w/v)+PBS(PH7.2)封闭，200μl/孔，4℃封闭过夜。倒去封闭液，拍干，抽干铝箔纸包装备用。

2.样品稀释液(11ml/瓶)：

生理盐水，加硫柳汞0.01％(w/v)，0.22μm滤膜过滤。

3.血样阴、阳性对照处理(0.10ml/瓶)：

阳性对照：

病人粪便经镜检(一粪三检)证实有虫卵，取病人静脉全血室温静止2小时，4℃过夜，4000rpm，离心10分钟，分离上清-20℃保存备用，经ELISA实验验证OD值1.9-2.0的血清；

阴性对照：

粪便经镜检(一粪三检)未发现有虫卵，静脉全血室温静止2小时，4℃过夜，4000rpm，离心10分钟，分离上清-20℃保存备用，并经ELISA实验验证OD值0.1左右的血清。

阴、阳性对照加硫柳汞0.01％(w/v)，0.22μm滤膜过滤一次，每瓶0.10ml分装备用。

4.铕标记物(11ml/瓶)：

铕标记抗人IgG4二抗1∶400稀释，11ml/瓶分装。

5.浓缩洗涤液(30ml/瓶，25×)：

Tris-HCl缓冲液(PH7.8)，用0.22μm滤膜过滤，用时加蒸馏水或去离子水作25倍稀释。

6.增强液(6ml/瓶)：同其他时间分辨荧光分析法试剂盒。

7.封板膜：3片。

8.说明书：1份。

实施例4：试剂盒的使用

4.1试剂盒使用步骤：

1).配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水作1∶25稀释。

2).加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照5μl，然后每孔加入95μl样品稀释液。

3).孵育：用封板膜封板后置室温平摇60分钟。

4).洗涤：用洗涤液冲洗4次，拍干。

5).加酶：每孔加入铕标记物100μl。

6).孵育：用封板膜封板后置室温平摇60分钟。

7).洗涤：用洗涤液冲洗6次，拍干。

8).显色：每孔加入增强液100μl，室温平摇5分钟。

9).测定：测定各孔荧光值。

血清稀释度为1∶20，铕标记的二抗的稀释度为1∶400，一抗血清和二抗铕标记物的孵育时间各需60分钟(室温)，无需特殊的设备，反应条件易实现，使本试剂盒操作起来更便捷。

4.2试剂盒敏感性检测实验：

取171份镜检阳性血清，采用上述试剂盒检测，最终TRFIA结果为阳性者162份，阳性检出率为94.74％。

4.3试剂盒特异性检测实验：

取258份阴性血清，采用上述试剂盒检测，TRFIA结果测出233份阴性，阴性检出率为90.31％。

用本发明所描述试剂盒，按说明书所示方法，进行交叉反应实验，结果见表-2：

交叉反应实验结果(Results of cross-reaction)

结论：本发明的试剂盒无论是敏感性还是特异性均好于目前同类的其他试剂盒的。实验结果表明，本试剂盒具有特异性强、灵敏度高、准确度高等特点，可较好地运用于华支睾吸虫病的诊断，本试剂盒的主要试剂均采用工作液形式，可直接使用，较传统的病原学诊断方法有很大的优势：操作准确、简便、结果可信。

Claims

1.一种华支睾吸虫病诊断试剂盒，包括：TRFIA反应板、阴性对照、阳性对照、铕标记物、样品稀释液、浓缩洗涤液和增强液，其特征在于，所述TRFIA反应板上包被有华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2，所述华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2是具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽。

2.如权利要求1所述华支睾吸虫病诊断试剂盒，其特征在于，所述铕标记物为铕标记抗人IgG4二抗。

3.如权利要求1所述华支睾吸虫病诊断试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为生理盐水。

4.如权利要求1所述华支睾吸虫病诊断试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为：pH7.8的Tris-HCl缓冲液。

5.如权利要求1-4任一权利要求所述华支睾吸虫病诊断试剂盒，其特征在于，所述华支睾吸虫病诊断试剂盒中还可包括封板膜及说明书。

6.如权利要求1-5任一权利要求所述华支睾吸虫病诊断试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

1).将浓缩洗涤液稀释配制洗涤液；

2).分别在TRFIA反应板的相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照并用样品稀释液稀释；

3).用封板膜封板后置室温平摇孵育；

4).用洗涤液洗涤后每孔加入铕标记物；

5).用封板膜封板后置室温平摇孵育；

6).用洗涤液洗涤后每孔加入增强液混匀反应；

7).测定各孔荧光值。

7.如权利要求6所述华支睾吸虫病诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤3和5的孵育时间均为60分钟。