CN102533910B - 免疫毒素的表达和纯化方法 - Google Patents

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Abstract

一种在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达免疫毒素的方法，包括：a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养可表达免疫毒素的巴斯德毕赤酵母；b)对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中甲醇诱导的温度在约17.5℃以下。

Description

免疫毒素的表达和纯化方法
本申请是2004年8月2日提交的题为“免疫毒素的表达和纯化方法”的第200480028919.6号(国际申请号PCT/US2004/024786)专利申请的分案申请。
本申请要求2003年8月1日提交的美国临时申请60/491,923的权益。美国政府对该申请拥有一定权利。
发明背景
技术领域：
本发明一般而言涉及蛋白表达和纯化方法，更具体地说，涉及免疫毒素的表达和纯化方法。
背景技术：
美国每年进行的器官移植手术约有24,000例，主要包括肾脏移植(14,000例)、肝脏移植(5,000例)、心脏移植(2,200例)，以及少量的胰、肺、心-肺和肠移植(2002年OPTN/SRTR年度报告)。
移植耐受仍然是患者和医生难以企及的目标，他们期望成功地实现异源器官移植而无需坚持使用无限期的、非特异性的免疫抑制剂，并免除其带来的副作用。许多此类患者使用环孢菌素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)和泼尼松(prednisone)，以及多种其他免疫抑制剂治疗，以诱导或维持免疫抑制。在美国，维持免疫抑制疗法的年均花费约$11,000(Immunosuppressive Drugs Coverage Act，NationalKidney  Foundation，参见http://www.kidney.org/general/pubpol/immufact.cfm)。虽然这些药物可有效防止排斥反应，但免疫抑制疗法的副作用是相当大的。免疫抑制疗法诱导免疫系统的非特异性无应答。移植接受者易于感染，并有患恶性肿瘤的风险，如以移植后淋巴增生性障碍的形式。移植免疫生物学的主要目标是开发对器官移植的特异性免疫耐受，而使患者从持续药理免疫抑制的副作用及其带来的并发症和费用中解脱出来。
开发了二价抗T细胞免疫毒素，A-dmDT390-bisFv(G4S)，用于对移植、T细胞白血病和自体免疫疾病进行耐受诱导。该免疫毒素由白喉毒素的前390个氨基酸残基(DT390)和来自抗CD3抗体UCHT1的两个成串的抗原结合结构域(sFv)构成，后者负责将该免疫毒素结合至T细胞受体复合物的CD3εγ亚基。抗CD3ε抗体部分使得该免疫毒素能够靶向特定细胞，而白喉毒素部分可杀死靶细胞。该免疫毒素可用于使至少部分T细胞耗尽，以治疗或防止T细胞介导的免疫系统疾病或病症。
施用抗T细胞免疫毒素提供了一种实现特异性免疫耐受的方法。它可应用于接受者体内具有稳定移植物功能的新器官移植物，也可用于已经存在的移植物。该免疫毒素可提供高度特异性免疫抑制，在灵长类中实现移植耐受，而没有非特异性免疫抑制药物、抗淋巴细胞血清或放射的副作用。将排斥应答抑制到不会减短移植接受者平均寿命的程度，是本领域的一个目标。
甲基营养酵母——巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已成功用于表达不同来源的异源蛋白(Gellissen 2000)。作为真核生物，巴斯德毕赤酵母能够进行多种翻译后蛋白修饰，如蛋白酶解加工、折叠、二硫键形成和糖基化作用。像其他酵母一样，巴斯德毕赤酵母具有胜过高等真核细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)或杆状病毒感染的昆虫细胞表达系统的显著优点。它易于操控，生长速度快，所需培养基价格低廉。这大大减少了生产时间和费用，特别在商业规模上更是如此。与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不同，巴斯德毕赤酵母并非强发酵酵母，可很容易地培养至＞100g干细胞/升的极高细胞密度(Siegel et al.，1989)。再加上采用强AOX1启动子驱使外源基因转录，使得巴斯德毕赤酵母成为高水平异源基因表达的优选系统。AOX1启动子在表达对表达宿主有害的外源蛋白时也具有优势，因为该启动子在非甲醇生长条件下受到严格调控和高度抑制。可诱导的和严格调控的AOX1启动子使得巴斯德毕赤酵母菌株(没有任何导致对DT有抗性的突变)可成功地以分泌形式表达基于DT的免疫毒素(Woo et al.，2002)。然而，如果白喉毒素(DT)的催化区能够进入胞质溶胶，它对所有的真核细胞来说都是很强的毒素。巴斯德毕赤酵母对这些毒素本性上是敏感的。
现有技术教导了培养巴斯德毕赤酵母的方法。例如，巴斯德毕赤酵母可在发酵罐中培养。一种巴斯德毕赤酵母的发酵方法包括使用甘油作为最初的碳源，随后进行短暂的碳饥饿，再使用甲醇作为碳源(Pichia pastoris Fermentation Using a BioFlo 110 Benchtop Fermentor，New Brunswick Scientific)。
Woo等记载，当在巴斯德毕赤酵母中表达二价抗人抗T细胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(G4S)时，含1％酪蛋白氨基酸的pH7.0的缓冲复合物培养基可提供摇瓶培养的最高表达，加入1至3mM范围的PMSF可提高表达水平。(25 Protein Expression and Purification 270-82(2002))。
Sreekrishna记载，以摇瓶培养巴斯德毕赤酵母，当细胞通入大量空气并在补充有酵母提取物和胨的pH6.0的缓冲培养基中培养时，可使分泌水平提高(Chapter 16，Industrial Microorganisms：Basic andApplied Molecular Genetics(1993))。含酵母氮碱基以及硫酸铵、生物素和甘油的生长培养基，使用磷酸钾以及酵母提取物和胨调节pH至6.0。诱导培养基含有甲醇代替甘油。
与之相比，本发明提供了一种使用巴斯德毕赤酵母制备免疫毒素的改进的方法。本发明所表达和纯化的免疫毒素可用于诱导免疫耐受的方法中。很有必要提供一种提高免疫毒素产量的表达和纯化方法。本发明在下文中阐述了此问题以及其他一些问题。
发明内容
本发明一方面涉及一种在巴斯德毕赤酵母毒素抗性EF-2突变株中表达免疫毒素的方法，包括：a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养巴斯德毕赤酵母；b)对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，诱导过程中添加0.5至0.75ml/min(每10L初始培养基)的限量甲醇，且甲醇诱导的温度在约17.5℃以下。
本发明另一方面涉及一种在巴斯德毕赤酵母中表达免疫毒素的方法，包括：a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养巴斯德毕赤酵母；b)使用含甲醇和甘油的添加物对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中巴斯德毕赤酵母与苯甲烷磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride)和氨基酸源相接触，且甲醇诱导的温度在约17.5℃以下。
本发明再一方面涉及一种纯化非糖基化免疫毒素的方法，包括：a)将含有非糖基化免疫毒素的溶液装入疏水作用柱(hydrophobicinteraction column)中；b)从疏水作用柱中获得含洗脱剂的第一非糖基化免疫毒素；c)将步骤(b)中获得的含洗脱剂的非糖基化免疫毒素装入阴离子交换柱中；d)通过使用硼酸钠溶液洗脱非糖基化免疫毒素，从阴离子交换柱中获得含洗脱剂的第二非糖基化免疫毒素；e)稀释步骤(d)中获得的含洗脱剂的第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸钠浓度达到约50mM或更低；f)在阴离子交换柱上浓缩在步骤(e)中获得的含洗脱剂的稀释的非糖基化免疫毒素；g)从阴离子交换柱获得纯化的非糖基化免疫毒素。
应该理解，上文的一般性叙述和下文的详细叙述均只起示例和解释作用，并不限制由权利要求书限定的本发明范围。
附图说明
附图显示一个或多个本发明的实施方案，并与文字叙述一起解释本发明的原理。
图1：(a)真核EF-2中白喉酰胺结构域的保守性以及DT抗性突变。(b)巴斯德毕赤酵母EF-2中可导致Arg替换Gly 701的核苷酸序列突变。带有下划线的序列为由核苷酸突变导致的限制酶Sac II位点。见SEQ ID NO：1-10。
图2：巴斯德毕赤酵母EF-2的5′端序列，显示短内含子(SEQ IDNO：11；mRNA)和(SEQ ID NO：12；gDNA)。5′剪接位点、分支位点以及3′剪接位点使用下划线标出。EF-2编码序列使用粗体标出。
图3：(A)(B)(C)(D)巴斯德毕赤酵母EF-2(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列和推得的氨基酸序列。核苷酸序列从起始密码子的开端处开始编号。蛋白序列中共有的GTP结合基序为AHVDHGKST(SEQID NO：14)，据推测在体内被EF-2激酶磷酸化的苏氨酸残基用圆圈标出，在所有的延长因子中均保守的效应物结构域为DEQERGITIKSTA(SEQ ID NO：15)。白喉酰胺结构域中22个高度保守的残基使用方框标出。
图4：使用已经体外突变的EF-2的3′序列进行定向突变。突变质粒pBLURA-Δ5’mutEF-2包括四个重要元件：β-内酰胺酶基因(Ampr)、尿嘧啶选择标记(URA3)、3′AOX1转录终止序列(TT)和体外突变的FF-23′序列Δ5’mutEF-2。
图5：对来自巴斯德毕赤酵母JC308菌株的所选Ura+克隆的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。(a)使用引物1和M的PCR产物；(b)使用引物2和w的PCR产物；(c)Sca II消化的使用引物2和3的PCR产物。
图6：在突变型和野生型巴斯德毕赤酵母菌株中胞质溶胶表达的DT-A链的蛋白质印迹分析。(a)泳道1～6为使用pPIC3-DtA转化的6个独立mutEF2JC307-8克隆的细胞提取物，+C：纯化的A-dmDT390-bisFv。M：SeeBlue plus2蛋白标记(Invitrogen)。(b)在两个独立菌落mut-3和mut-5(分别为mutEF2JC307-8(3)和(5))，C3和C4培养物中，胞质溶胶表达的DT-A链。蛋白样本加于4～12％NuPAGE凝胶(Invitrogen)上。
图7：细胞内表达DT-A对带有突变型或野生型EF-2的巴斯德毕赤酵母菌株的存活的影响。Mut-3和Mut 5分别为EF-2突变体mutEF2JC307-8-DtA(3)和(5)，Mut-3在胞质溶胶中表达DT A链，而mut-5并非如此。C3和C4是野生型EF-2菌株，在胞质溶胶中表达(C4)或不表达DT A链。每一类的第一个柱表示甲醇诱导前的菌落形成单位。每一类的第二个柱代表甲醇诱导后的菌落形成单位。
图8：质粒构建示意图。(a)pBLARG-A-dmDT390-bisFv；(b)pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv；(c)pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv。
图9：A-dmDT390-bisFv表达情况的蛋白质印迹分析。培养基(a)和细胞提取物(b)样本加于4～12％NuPAGE凝胶(Invitrogen)上。+c泳道为纯化的A-dmDT390-bisFv。泳道1～9是使用2拷贝A-dmDT390-bisFv基因转化的mut EF2JC303中，所选的9个克隆样本。泳道10、11和12是单拷贝克隆样本：泳道12为非突变型EF-2克隆JHW#2，泳道10和11是两个选出的mutEF2JC307-8(1)和mutEF2JC307-8(2)克隆，后者也称为YYL#8-2。
图10：比较不同巴斯德毕赤酵母菌株的甲醇消耗速率。所有这些菌株均为Mut+(甲醇利用增加)，除了pJHW#3为MutS(甲醇利用缓慢)。pJHW#2到5和EF-2突变体YYL#8-2均表达二价免疫毒素A-dmDT390-bisFv。X-33为不表达A-dmDT390-bisFv的野生型菌株，但使用表达载体转化。
图11：X-33和JW102之间，以及在指定温度下对JW102添加不同营养物之间的甲醇消耗速率曲线的比较。YE和casa分别代表添加酵母提取物和酪蛋白氨基酸。
图12：降低发酵中的搅拌速度减少免疫毒素聚集体。在高搅拌速度下进行发酵导致50％以上的分泌免疫毒素在上清液中以无活性的聚集体形式存在。另外，聚集体在诱导时间内累积。然而，将搅拌速度从800rpm降低到400rpm减少了免疫毒素聚集体。免疫毒素聚集体在诱导时间内水平保持不变。
图13：在30℃、250rpm下，经20小时诱导之后，TWEEN对纯化免疫毒素聚集的影响。使用纯化免疫毒素，通过搅拌，TWEEN可防止聚集体的形成。通过在30℃、250rpm下诱导20小时，大约50％的纯化免疫毒素聚集。然而，通过搅拌，0.01％～0.04％的TWEEN可显著减少纯化免疫毒素的聚集。
图14：甲醇诱导的前44小时内湿细胞密度收获量的变化。MeOH，只有甲醇并加入酪蛋白氨基酸；M∶G＝4∶1，补充甲醇/甘油混合物并补充酪蛋白氨基酸；YE+MeOH，补充酵母提取物以及只有甲醇；YE+4:1，补充酵母提取物并补充甲醇/甘油混合物。
图15：根据诱导温度不同，二价免疫毒素的表达水平及其最终纯化产率。A：诱导温度不同表达水平的变化。B：从甲醇诱导22、44和67小时时所取的1升上清液中所获最终纯化产率的变化。22小时、44小时和67小时代表甲醇诱导时间。C：诱导温度不同甲醇消耗量的变化。
图16：优化的发酵批次的代表。在所示时间点取的样本在4～20％SDS-tris-甘氨酸凝胶上分级，并且该凝胶使用考马斯蓝染色。箭头表示二价免疫毒素的位置。使用Mark 12标记(Invitrogen)。
图17：通过butyl 650M捕捉步骤获得的蛋白的SDS-PAGE电泳分析。泳道1～4，样本流过组分#1～#4；泳道5，汇集的样本流过组分；泳道6～8，洗涤组分#1～#3；泳道9，汇集的洗涤组分；泳道10、11、17，上清液；泳道12，Mark 12蛋白标准样本(Invitrogen)；泳道13～15，洗脱组分#1～#3；泳道16，汇集的洗脱组分。IT，免疫毒素。
图18：通过Poros 50HQ硼酸盐阴离子交换步骤获得的蛋白的SDS-PAGE电泳分析。泳道1，Mark 12蛋白标准样本(Invitrogen)；泳道2，从Butyl 650M HIC步骤获得的样本；泳道3～7，样本流过组分#1～#5；泳道8，使用25mM溶于缓冲液B的硼酸盐洗脱的组分#1；泳道9，使用50mM溶于缓冲液B的硼酸盐洗脱的组分#2；泳道10，使用75mM溶于缓冲液B的硼酸盐洗脱的组分#3；泳道11，使用100mM溶于缓冲液B的硼酸盐洗脱的组分#4；泳道12，使用1M溶于缓冲液B的NaCl洗脱的组分#5；IT，免疫毒素。
图19：纯化免疫毒素的分析凝胶过滤和SDS-PAGE电泳分析。A：Superdex 20010/300GL凝胶过滤色谱图。B：考马斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶图谱。
图20：(a)(b)(c)Ala-dmDT390-bisFv(UCHT1)的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。
图21：甲醇诱导过程中的细胞生长、甲醇消耗和免疫毒素分泌曲线比较。组A：X-33菌株和产生免疫毒素的毒素抗性EF-2突变体mutEF2JC307-8(2)。这两个菌株在甲醇诱导过程中具有相似的甲醇消耗速率和湿细胞密度增长曲线。组A中所示数据来自X-33。对于毒素抗性突变体，在甲醇诱导44h时，最大甲醇消耗速率和湿细胞密度增长分别为2.2ml/min和9.17％。组B-F：菌株JW102。在所有组A-F中的恒定条件是在诱导之前的甘油分批阶段，并继之以甘油补料分批阶段。对于诱导，仅使用纯甲醇(MeOH)或者使用4∶1甲醇∶甘油(M/G)混合补料。诱导过程中持续注入溶于甲醇的10mM的PMSF。当不添加酵母提取物(YE)时则添加酪蛋白氨基酸。诱导条件：组A，添加M/G，不添加YE；组B，添加甲醇，不添加YE；组C，添加甲醇，添加YE；组D，添加M/G，添加YE；组E，添加M/G，不添加YE；组F，添加M/G，添加YE。诱导温度，A-E为23～25℃，F为15℃(注意组F的右侧轴与其他组相比压缩2倍)。甲醇消耗速率(ml/min)，虚线；湿细胞密度(％，w/v)，实线；分泌免疫毒素水平(mg/L)，短划线。因为在10L生物反应器发酵中有大量的工作，所以重复组A-E的结果是不切实际的。优化方法组F进行了3次，点为平均值，当均值的标准差超过10％时在图中表示出来。湿细胞密度和分泌免疫毒素水平的准确数据点显示为方块和圆圈。因为每分钟测量一次甲醇消耗速率，所以省略了甲醇消耗速率的准确数据点。
图22：蛋白降解和免疫毒素生产。A：在补充甲醇和酵母提取物的培养物(图21C)中，甲醇诱导过程中免疫毒素水平的时程。免疫毒素条带使用IT和箭头标出。B：对等体积的纯化免疫毒素(250μg/ml)与等体积的在甲醇诱导后所示时间收集的上清液，在培育(28℃，20h，250rpm摇动)后通过SDS-PAGE对残留免疫毒素进行分析。等体积纯化免疫毒素和PBS缓冲液的混合物，或者来自0h的上清液用作对照(CON)。10μl制备的样本加于SDS-PAGE，并在非还原条件下在4～20％SDS-tri-甘氨酸凝胶上分级。凝胶使用考马斯蓝染料染色。使用Mark 12标记(Invitrogen)作为蛋白标记。
图23：温度对生产免疫毒素的影响。在所示诱导时间点(44，50，67h)从不同诱导温度(15～23℃)批次中取得的样本，在非还原条件下在4～20％SDS-tris-甘氨酸凝胶上分级。对于所有批次，持续添加酵母提取物和甲醇-甘油补料。凝胶使用考马斯蓝染料染色。IT-dp表示二价免疫毒素的降解产物。这些降解产物通过蛋白质印迹使用抗DT抗体和抗(G4S)3接头抗体识别。抗(G4S)3接头抗体可检测二价免疫毒素和降解产物，因为免疫毒素包含三个(G4S)3接头。箭头指向与二价免疫毒素无关的条带。IT表示免疫毒素。使用Mark 12标记(Invitrogen)作为蛋白标记。
图24：在15℃下的甲醇诱导过程中，对于存在和不存在PMSF的上清液中的蛋白酶活性进行分析。上清液是在甲醇诱导0、22、44和67h时，从持续添加酵母提取物和甲醇-甘油补料处理的发酵批次中取得的。上清液与作为底物的无切口的CRM9一起培育。培育后，10μl样本在还原条件下在4～20％SDS-tris-甘氨酸凝胶上分级。染色和干燥后，通过使用NIH成像软件将凝胶数字化并分析无切口CRM9的条带密度。在甲醇诱导中补充PMSF，实线；无PMSF，虚线。每个数据点为3个发酵批次的平均值，并带有均值的标准差。
具体实施方式
在公开和描述本发明的化合物、组合物、物品、装置和/或方法之前，应该理解，除非另有说明，并不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，除非另有说明，并不限于特定试剂，因其毫无疑问地可有多种变化形式。还应理解，本文所用术语只是出于描述特定实施方案的目的，而非意在限制。
如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式的“一”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非上下文中另外明确指出。因此，例如，提及“一种药物载体”包括两种或更多种这类载体的混合物等等。
本文中范围可以表示为从“大约”一个具体的数值，和/或至“大约”另一个具体的数值。当表示为这种范围时，另一个实施方案包括从前述的一个具体的数值和/或至前述的另一个具体的数值。类似地，当通过在前面使用“大约”将数值表示为近似值时，应当理解的是，该具体的数值构成另一个实施方案。应当进一步理解的是，每个范围的端点在与另一个端点相关和独立于另一个端点时都是有意义的。还应当理解的是此处公开了许多数值，且除了数值本身外每一个数值在此还以“大约”该具体数值公开。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“大约10”。还应当理解的是，当公开了一个数值时，也公开了“小于或等于该数值”，“大于或等于该数值”以及数值间可能的范围，如本领域技术人员所恰当理解的。例如，如果公开了数值“10”，也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个本申请中，以多种不同格式提供数据，这些数据代表了端点和起点，以及这些数据点任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，应该理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15，以及10和15之间的数值也认为已经公开。
在本说明书及其后的权利要求书中，将会提及许多被界定为具有如下含义的术语：
“可选的”或“可选地”意即：随后所描述的事件或情况可以发生或不发生，以及该描述包括其中所述事件或情况发生的例子及其不发生的例子。
“接触”是指将一种物质置于可与另一种物质发生物理关联的条件下。
“非糖基化”是指没有糖基化作用，或者使用本领域常规的测定糖基化的方法，检测不到糖基化作用。因此，非糖基化包括已使糖基化位点发生突变使得糖基化作用不发生，在不发生糖基化作用的系统中表达，或者在野生状态下不具有糖基化作用位点。
“装入”柱中是指将样本放在某位置，以使至少一部分样本最终进入柱中由树脂占据的位置。
“酶消化”是指使用一种或多种不同的酶将蛋白或肽在肽键处水解。此类酶包括但不限于胰岛素、糜蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或羧肽酶A。
“酵母提取物”是指通过对酵母细胞内的蛋白进行蛋白酶解而获得的肽和氨基酸的制备物。
“诱导”是指为给定的启动子提供信号，促使给定基因的表达。
“添加”是指以一定速率提供新鲜培养基或营养物，以至少部分取代被消耗掉的培养基或营养物。
“部分”是指可分为多个部分的分子或化合物的一个部分。在本发明中，部分可以指免疫毒素的毒素部分或抗体部分。
本发明中，术语“二价”是指单个组合物能够与两个配体相结合。例如，A-dmDT390-bisFv(G4S)免疫毒素可结合两个CD3分子。还应理解，术语“两价”在本领域中具有相似的含义。在此，术语“二价”和“两价”指相同的性质，可互换使用。
本发明提供了一种在巴斯德毕赤酵母变体中表达和纯化变体ADP核糖基化毒素和毒素融合蛋白的系统。本发明方法具有遵循优质生产规范(Good Manufacturing Practices)的优点。
正如广泛使用的情况一样，免疫毒素可选为融合蛋白。免疫毒素可包括白喉毒素部分。应该理解且涵盖于本文之中的是，本方法可使用其他ADP核糖基化免疫毒素。例如，特别考虑的是免疫毒素包含绿脓杆菌外毒素A(Psuedomonas exotoxin A)部分的融合蛋白。毒素部分可为截短型(truncated)部分和/或可包含相对于野生型毒素的变异。免疫毒素可进一步包括CD3抗体部分或其他抗体部分。还应理解，免疫毒素可包括除CD3抗体以外的靶向抗体部分。本领域技术人员可根据靶细胞，知道在免疫毒素中使用何种部分。例如，CD22抗体可用于将免疫毒素融合蛋白引导至B细胞。
本发明提供了一种在巴斯德毕赤酵母毒素抗性EF-2突变株中表达免疫毒素的方法，包括：在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养巴斯德毕赤酵母；在约17.5℃以下的温度下进行甲醇诱导。
本发明一方面提供了一种在巴斯德毕赤酵母毒素抗性EF-2突变株中表达免疫毒素的方法，包括：在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养巴斯德毕赤酵母；对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，诱导过程中添加0.5至0.75ml/min(每10L初始培养基)的限量甲醇，且甲醇诱导的温度在约17.5℃以下。
本发明另一方面提供了一种在巴斯德毕赤酵母中表达免疫毒素的方法，包括：在包含蛋白(如大豆蛋白)的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养巴斯德毕赤酵母；使用含甲醇和甘油的添加物(如甲醇和甘油的比例为约4∶1)对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中巴斯德毕赤酵母与苯甲烷磺酰氟和氨基酸源(如酵母提取物)相接触，且甲醇诱导的温度在约17.5℃以下。
在该表达方法中，将巴斯德毕赤酵母与苯甲烷磺酰氟和氨基酸源接触的操作包括，将这些细胞与苯甲烷磺酰氟和氨基酸源接触至少2小时，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的小时数，或者介于其中的任何量。优选地，苯甲烷磺酰氟溶于4∶1的甲醇甘油诱导添加物中，浓度不超过10mM。
甲醇诱导温度优选在约17.5℃以下，更优选约15℃。本方法实践中适于发生甲醇诱导的其他温度包括17.0、16.5、16.0、15.5、14.5、14.0、13.5、13、12.5、12℃或者介于其中的任何量。
生长培养基是指所选有机体生长所需的任何物质。生长所需的物质包括但不限于碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、钠、铁、微量元素和有机生长因子。生长培养基中可包括多种原料以提供所需物质。这些物质包括但不限于单糖，提取物如胨、大豆胨(soytone)、胰胨(tryptone)、酵母提取物，二氧化碳，维生素，氨基酸，嘌呤和嘧啶。本发明方法的一个实例利用了DIFCO公司生产的大豆的酶消化产物的存在。本发明方法的另一个实例利用了DIFCO公司生产的酵母提取物的存在。应该理解，可使用生产此类产品的任何厂商(如NewEngland Biosciences)生产的酵母提取物和酶消化产物。
在本方法的一个具体的非限制性实例中，生长培养基的组成为约4％甘油，约2％酵母提取物，约2％大豆蛋白的酶消化产物，约1.34％含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮碱基，以及约0.43％PTM1溶液。生长培养基可选进一步包括消泡剂。更具体地，消泡剂的浓度为约0.01％或更高。例如，消泡剂浓度可为0.07％，或者约0.01％至约0.07％之间的任何量。消泡剂的最佳水平可选择为：使液体-空气界面之上的泡沫层减少至1/2英寸或更薄所需的最小量。因此，生长培养基的组成可为约4％甘油，约2％酵母提取物，约2％大豆蛋白的酶消化产物，约1.34％含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮碱基，约0.43％PTM1溶液，以及约0.02％消泡剂。
应该理解，本领域技术人员知道可以改变生长培养基的组成以利于最佳生长。特别考虑的变化是高于或低于生长培养基中组分百分比最多20％。因此本文公开了一种生长培养基，其中该生长培养基的组成为约3.2-4.8％甘油，约1.6-2.4％酵母提取物，约1.6-2.4％大豆蛋白的酶消化产物，约1.07-1.61％含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮碱基，以及约.34-.52％PTM1溶液。例如，特别公开了一种培养基，其中该生长培养基的组成为约3.6％甘油，约2.4％酵母提取物，约1.9％大豆蛋白的酶消化产物，约1.43％含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮碱基，以及约0.43％PTM1溶液。
在本发明的表达方法中，可选地，生长培养基中溶解氧浓度保持在40％或更高(如45％、50％、55％、60％或65％)的数值。例如，在本发明中，甲醇诱导开始之前采用添加甘油批料阶段(glycerol-fedbatch phase)以获得高细胞密度。当溶解氧浓度上升到40％以上时开始添加甘油批料阶段。每当溶解氧上升至40％以上时即添加甘油，直至该水平降至40％以下。停止添加甘油后溶解氧再次升高时，添加物换为甲醇。溶解氧(DO)水平升高或达到尖峰说明已耗尽碳源。通常DO尖峰用于显示生长所用的甘油已耗尽，说明应该转为甲醇诱导阶段。
另外，生长阶段可选pH值为约3.0-4.0，甲醇诱导阶段pH值为约6.7-7.4。例如，生长阶段pH值为3.5，甲醇诱导阶段pH值为7.0。
可增加甲醇诱导时间以提高产量。通常的诱导时间包括22h、44h、67h和163h。诱导可长达12天(288h)。因此，特别考虑的甲醇诱导持续约22h至约12天(288h)。例如，应该理解，甲醇诱导可持续163h。
因而本发明的一个实施方案为一种在巴斯德毕赤酵母中表达免疫毒素的方法，包括：a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养巴斯德毕赤酵母；b)对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中所述甲醇诱导包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始体积的限量甲醇，其中诱导进行的温度在17.5℃以下，补充消泡剂至0.07％，搅拌减慢至400RPM，且其中诱导步骤进行约22至288h之间。
更具体地，本发明的一个实施方案包括一种在巴斯德毕赤酵母中表达免疫毒素的方法，包括：a)在生长培养基中培养可表达免疫毒素的巴斯德毕赤酵母，所述生长培养基包括约4％甘油，约2％酵母提取物，约2％大豆蛋白的酶消化产物，约1.34％含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮碱基，以及约0.43％PTM1溶液，其中生长期间pH值约为3.5，且生长培养基中溶解氧浓度保持在40％或更高的数值；b)对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中所述甲醇诱导包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始体积的限量甲醇，其中诱导进行的温度为15℃，pH值约7.0，补充消泡剂0.02％，搅拌减慢至400RPM，且诱导阶段约163h。
已经开发了可选择性杀伤人T细胞的二价抗T细胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(G4S)，用以治疗T细胞白血病、自体免疫病和移植耐受诱导(美国专利申请09/573,797，通过引用纳入本文)。二价抗T细胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(G4S)，由白喉毒素(DT)的前390个氨基酸残基(DT390)和来自抗CD3抗体UCHT1的两个成串的抗原结合结构域(sFv)构成。通过引入两个突变已将DT390免疫毒素中的两个N糖基化位点除去(Liu et al.，2000)，导致生成分子量96.5kDa的非糖蛋白。免疫毒素还可包括接头分子，用以连接抗体部分与毒素部分。接头(L)可为Gly-Ser接头。Gly-Ser接头可以是但不限于(Gly4Ser)n或(Gly3Ser)n。更具体地说，接头可为(Gly4Ser)3接头(GGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO：17)，本文也称为(G4S)，或者(Gly3Ser)4接头(GGGSGGGSGGGSGGGS)(SEQ ID NO：18)，本文也称为(G3S)。在一个优选的实施方案中，免疫毒素包括A-dmDT390-bisFv(G4S)。
免疫毒素对6.0以下的pH水平敏感，这与低pH可诱导DT390部分的易位结构域(translocation domain)的不可逆构象改变相一致。易位结构域介导DT390的A链以质子依赖方式从内体或质膜到胞质溶胶的易位。催化型A链在胞质溶胶中通过延长因子2(EF-2)的ADP核糖基化负责蛋白合成抑制。这种蛋白合成抑制作用对许多真核细胞具有毒性。由于阳离子交换色谱法和亲和色谱法需用低pH缓冲液洗脱，所以免疫毒素的pH敏感性限制了这两种技术的使用。
使用毒素抗性真核细胞可克服免疫毒素的毒性问题。然而，筛选和鉴定毒素抗性真核细胞是一项烦琐、费力、费时的工作。而且，在EF-2突变体CHO细胞表达系统中生产二价免疫毒素被限制在5mg/L，无法通过选择多基因插入提高其产量。由于这种限制，除三个例外(12，20，25)，所有治疗用途的重组免疫毒素的生产均限于使用大肠杆菌(E.coli)制备，迫使包含体(6)变性再重新折叠。然而，来自大肠杆菌的二价免疫毒素的多结构域结构的重新折叠不能有效完成，无法恢复其全部生物活性(25)。还有，二价免疫毒素的多结构域结构妨碍大肠杆菌的高效生产。因此，现有生产系统的缺点驱使我们试图开发有效的二价免疫毒素的巴斯德毕赤酵母生产系统。
对于二价抗T细胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv来说，巴斯德毕赤酵母是良好的表达系统，这是因为，与原核表达系统相比，它可提供最佳的蛋白折叠，而与哺乳动物细胞表达相比(CHO细胞)，它可提供更高的产量。抗体融合蛋白需要正确的二硫键，酵母的内质网提供了与真核的抗体制造细胞相似的氧化环境。二价免疫毒素的多结构域结构需要真核表达系统来正确地折叠这种复杂的蛋白。而免疫毒素一旦表达，多数真核生物对其蛋白合成抑制作用敏感。然而，一种芽殖酵母——巴斯德毕赤酵母对DT具有一定程度的耐受性(Neville et al.，1992；Woo et al.，2002)，在发酵罐培养中免疫毒素的产量可达40mg/L。通过遗传工程改造的巴斯德毕赤酵母(JW102，从pJHW#2重新命名(Woo et al.，2002))的发酵，由分泌途径制备免疫毒素。如实施例41所示，本方法在163h的诱导阶段之后可提供120mg/l的产量，纯化后的产量为90.8mg/L(见表6)。
在经过基因优化，减少DNA序列中的AT含量之后，在生物反应器内经过24-44小时的诱导，受AOX1启动子控制的分泌表达水平可达25-30mg/L。巴斯德毕赤酵母对在胞质溶胶中表达的白喉毒素A链的毒性作用敏感，该链使延长因子2(EF-2)ADP核糖基化导致蛋白合成停止。通过分泌途径表达的A-dmDT390-bisFv的毒性可通过诱导后甲醇消耗水平的不断降低来说明。给细胞提供甘油和甲醇的混合添加物。在胞质溶胶中表达DT的催化结构域(A链)对巴斯德毕赤酵母来说是致命的。当使用甲醇诱导带有构建体A-dmDT390-bisFv(UCHT1)的细胞以表达免疫毒素时，24小时后近50％被杀死(Woo et al.，2002)。与之相比，当在具有DT抗性突变的CHO细胞中表达相同的免疫毒素时，没有观察到毒性作用(Liu，et al.，2000；Thompson，et al.，2001)。在真核细胞的胞质溶胶中，DT的催化结构域催化延长因子2(EF-2)的ADP核糖基化，导致蛋白合成抑制和细胞死亡(by protein starvationand or apoptosis，Van Ness et al.，1980；Houchins，2000)。真核EF-2对这些毒素所致的ADP核糖基化的敏感性在于该蛋白的结构。EF-2是约850个氨基酸的单条多肽链，由两个结构域组成。N末端G结构域负责结合和水解可促进翻译的GTP，C末端R(或白喉酰胺)结构域被认为与核糖体相互作用(Kohno et al.，1986；Perentesis et al.，1992)。白喉酰胺结构域(图1a)在22残基的区域中包括一个在所有真核生物EF-2中高度保守的组氨酸残基。该保守性组氨酸经过特别的翻译后修饰变为衍生物白喉酰胺，白喉酰胺为DT所致ADP核糖基化时的独特靶标(Van Ness et al.，1880)。在酿酒酵母中，可使该保守性组氨酸发生突变并使用某些其他2个氨基酸替换，可产生对ADP核糖基化具有抗性的功能性EF-2(Phan et al.，1993；Kimata and Kohno 1994)。然而，其EF-2在白喉酰胺位置发生突变的细胞比表达野生型EF-2的细胞生长缓慢。在CHO细胞中，位于白喉酰胺C末端一侧第3位置的另一个高度保守的甘氨酸若被精氨酸单一替换，也可阻止白喉酰胺的形成(Kohno & Uchida，1987；Foley et al.，1992)，生成不可ADP核糖基化的EF-2。该突变对酿酒酵母EF-2具有相同的效果(Kimata et al.，1993)。与白喉酰胺的突变相比，EF-2中Gly到Arg的突变不会影响CHO和酿酒酵母的细胞生长(Foley et al.，1992；Kimata and Kohno1994；Kimata et al.，1993)。
为了确定可否通过使巴斯德毕赤酵母对毒素不敏感来实现进一步提高A-dmDT390-bisFv的表达水平，使巴斯德毕赤酵母的EF-2基因产生突变，701位的Gly变为Arg，该突变在其他生物体内已经显示可阻止EF-2的ADP核糖基化。EF-2诱变需要克隆该基因，将带有选择标记URA3的体外突变序列引入基因组中，以及对突变的克隆进行PCR鉴定。巴斯德毕赤酵母的整个EF-2基因已被克隆和测序。巴斯德毕赤酵母EF-2的编码序列为2526个核苷酸，编码842个氨基酸。巴斯德毕赤酵母EF-2与酿酒酵母和裂变酵母(S.pombe)的EF-2长度相同，并分别与两者在氨基酸序列上具有88％和78％的相同性(identity)。与这两种酵母相比，巴斯德毕赤酵母只有一个含较短内含子的EF-2基因拷贝。在弄清EF-2的完整序列之前，曾使用各种方法使巴斯德毕赤酵母发生突变，以获得DT抗性株。由于缺少有效的筛选方法，所有这些努力都以失败而告终。基于获得的EF-2序列，构建了靶向巴斯德毕赤酵母EF-2基因的pBLURA-Δ5’mutEF-2，通过同源重组在该基因中引入Gly 701到Arg的突变。该构建体包括EF-2的3’端1028个核苷酸和营养缺陷标记URA3，其中EF-2已经体外诱变含有上述的氨基酸替换。还开发了PCR检测方法，以便在尿嘧啶筛选之后快速准确地分辨突变克隆。使用构建体pBLURA-Δ5’mutEF-2进行的定向克隆手段使得在巴斯德毕赤酵母EF-2基因的突变体中，约40％的尿嘧啶阳性克隆被发现含有引入的突变。使用不同的营养缺陷标记培育EF-2突变体，(特别是mutEF2JC308(adel arg4 his4)，mutEF2JC303(arg4 his4)和mutEF2JC307(his4))，证实了EF-2中Gly 701至Arg的突变使之对胞质溶胶中表达的DT A链产生抗性。
当EF-2突变体在AOX1启动子的调控之下用于表达A-dmDT390-bisFv时，与未突变的表达株JW102相比，在摇瓶中制备该蛋白时并未显示出优势。然而，若在JW102的最适条件下进行大规模发酵培养，突变株YYL#8-2[MUT2JC307-8(2)]的产量在96小时内持续提高，达到高于未突变JW102株1.46倍的水平。至于细胞生长和甲醇消耗速度，表达A-dmDT390-bisFv的突变株和不表达的野生株是相等的。因此，似乎表达A-dmDT390-bisFv对突变株没有毒性。EF-2突变体允许在组成型GAP启动子(PGAP)的调控下表达A-dmDT390-bisFv。在摇瓶培养中，由PGAP调控表达A-dmDT390-bisFv的产量比由PAOX1调控表达要高出约30％。若采用发酵培养，由PGAP调控表达的产量可更为显著地提高，这是由于发酵可使细胞生长至极高的密度。
在巴斯德毕赤酵母表达系统中，使用简单的合成培养基(definedmedium)已成功表达和/或分泌了多种异源蛋白，如疫苗用肉毒菌神经毒素片段(Potter et al.，2000)、乙型肝炎病毒表面抗原(Hardy et al.，2000)、明胶(Werten et al.，1999)、胶原(Nokelainen et al.，2001)和胰岛素(Wang et al.，2001)。胞质溶胶中表达DT的催化结构域导致蛋白合成抑制，使合成培养基中所有细胞死亡，但在天然培养基中不会如此(Liu et al.，2003)。该发现表明，天然培养基在减弱由EF-2的ADP核糖基化导致的蛋白合成抑制方面起着重要作用。使用摇瓶培养时，在合成培养基中观察到极少量二价免疫毒素生成，但在天然培养基中没有。已经开发了基于合成培养基的巴斯德毕赤酵母发酵方法，用以表达异源蛋白，但使用天然培养基以分泌形式表达二价免疫毒素会提高产量。
在当前利用巴斯德毕赤酵母大规模制备二价免疫毒素过程中，将诱导温度降至15℃会显著提高生物活性免疫毒素的分泌量，因而可补偿巴斯德毕赤酵母分泌能力的限制。另外，使用含酵母提取物的天然培养基明显减弱了免疫毒素对巴斯德毕赤酵母宿主的毒性作用，进一步提高了免疫毒素的分泌量。
通过按如下方式优化巴斯德毕赤酵母的发酵条件，生物反应器培养时的二价免疫毒素表达水平可比摇瓶培养提高4倍：(1)使用基于大豆蛋白胨(Soytone Peptone)和酵母提取物的天然培养基，(2)甲醇诱导过程中，使用甲醇/甘油混合添加物(4：1)补充能源，(3)诱导过程中继续添加PMSF和酵母提取物，(4)甲醇诱导过程中将温度降至15℃。甲醇诱导过程中降低温度可导致分泌量相比23℃时提高2倍。
如上所述，生产二价免疫毒素的主要问题是在甲醇诱导阶段甲醇利用量减少。甲醇利用量减少是由限速酶醇氧化酶(AOX1)的活性降低所致。这相对于从分泌区泄漏或者从轻度酸性分泌区通过质子依赖的易位，而到达胞质溶胶区的二价免疫毒素所导致的蛋白合成抑制来说，还是次要的(Arata et al.，2002)。在EF-2基因中具有毒素抗性突变的巴斯德毕赤酵母菌株中，甲醇利用量不受产生免疫毒素的影响(Liu et al.，2003)，这一事实说明在菌株JW102中，毒素诱导的ADP核糖基化是AOX1活性降低的原因。然而，AOX1水平是由合成和降解两方面的平衡来控制的，降解机制可因毒素介导的ADP核糖基化而加强。出于未知原因，酵母提取物可提高甲醇利用量，但对野生型水平不起作用。另外，低甲醇利用量会负面影响巴斯德毕赤酵母细胞的生长。这在本方法中，通过在甲醇诱导过程中加入另一种碳源——甘油，以及持续添加酵母提取物来解决。这两项措施将甲醇利用量提高到非表达菌株的80％。
为了进一步补偿由表达的免疫毒素所致的巴斯德毕赤酵母蛋白合成抑制，采用使甲醇代谢限速酶——醇氧化酶I(AOX1)具有最大活性的发酵条件(Veenhuis et al.，1983)。既然免疫毒素基因和AOX1基因处于同一强启动子的调控之下，免疫毒素应该被高水平表达。然而，先前曾观察到，在异源蛋白的分泌中，各种蛋白似乎分别具有最佳分泌水平。在哺乳动物、昆虫和酵母细胞中，分泌型异源蛋白的超过最佳水平的表达(过表达)可导致分泌型蛋白产量减少(Bannister andWittrup，2000；Liebman et al.，1999；Liu et al.，2003；Pendse et al.，1992)。为了确定二价免疫毒素在巴斯德毕赤酵母中是否过表达，在甲醇诱导过程中降低诱导温度。由于在低温下包括蛋白合成在内的大部分细胞活性均降低，所以降低诱导温度应该降低二价免疫毒素的合成速率。对所导致的任何分泌变化均作出判断。在较低的诱导温度下，二价免疫毒素的表达水平提高，在17.5℃时达到最大值，生物活性的免疫毒素的分泌在15℃时达到最大值，尽管存在甲醇消耗率在15℃时下降至23℃时的75％这一事实。因为在诱导过程中持续添加PMSF和酵母提取物可有效抑制上清液中的蛋白酶活性，所以似乎不能用较低诱导温度下蛋白酶活性降低来解释15℃下二价免疫毒素的分泌水平增加了近2倍。前述的巴斯德毕赤酵母分泌二价免疫毒素的限制可能实际上反映了在23℃时过表达，在15℃时表达减少，从而实现分泌区内输入和输出的较好平衡。
简单地说，使用巴斯德毕赤酵母(JW102)，在发酵罐中以甲醇作为碳源，在AOX1启动子的调控下以分泌途径制备免疫毒素。高效制备免疫毒素主要有两大障碍，免疫毒素对巴斯德毕赤酵母的毒性和巴斯德毕赤酵母分泌免疫毒素的能力限制。对巴斯德毕赤酵母的毒性导致在合成培养基中进行甲醇诱导的过程中，出现甲醇消耗代谢率下降、细胞生长速率减缓以及产量极低等。这些问题通过以下手段克服：(1)使用基于大豆蛋白的酶消化产物(如大豆蛋白胨)和酵母提取物的天然培养基，(2)在甲醇诱导过程中使用甲醇/甘油混合添加物(4∶1)补充能源，(3)甲醇诱导过程中持续添加PMSF和酵母提取物。将诱导温度降至15℃，与诱导温度23℃时的分泌相比，分泌的免疫毒素产量提高几乎2倍，达40mg/L(诱导67小时)，尽管此时甲醇消耗量下降。另外，使用本方法，以无生物活性的寡聚体形式存在的免疫毒素部分减少。
本发明还提供了一种纯化非糖基化免疫毒素的方法，包括：a)将含有非糖基化免疫毒素的溶液装入疏水作用柱中；b)从疏水作用柱中获得含洗脱剂的第一非糖基化免疫毒素；c)将步骤(b)中获得的含洗脱剂的非糖基化免疫毒素装入阴离子交换柱中；d)通过使用硼酸钠溶液洗脱非糖基化免疫毒素，从阴离子交换柱中获得含洗脱剂的第二非糖基化免疫毒素；e)稀释步骤(d)中获得的含洗脱剂的第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸钠浓度达到约50mM或更低；f)在阴离子交换柱上浓缩在步骤(e)中获得的含洗脱剂的稀释的非糖基化免疫毒素；g)从阴离子交换柱获得纯化的非糖基化免疫毒素。可选地，本方法进一步包括在使用硼酸钠溶液洗脱之前，先使用约25mM硼酸钠溶液洗涤阴离子交换柱。被纯化的非糖基化免疫毒素优选通过本文教导的方法表达。
纯化方法的步骤(d)中，硼酸钠溶液浓度在约25mM至约200mM之间，优选在约75mM至约100mM之间。例如，步骤(e)中硼酸钠浓度为约20mM。
从巴斯德毕赤酵母上清液中大规模纯化二价抗T细胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(G4S)时所遇到的主要问题，是存在具有相似电荷、大小和疏水特性的宿主糖蛋白。这个问题通过采用硼酸盐阴离子色谱来解决。硼酸盐阴离子对碳水化合物具有亲和性，可使这些结构带有负电荷。硼酸钠浓度在50至100mM之间时，非糖基化免疫毒素不与Poros 50HQ阴离子交换树脂结合，但是糖蛋白，包括与免疫毒素相关的聚集体却可以结合。通过利用硼酸钠存在时的免疫毒素的这种特性，开发了3步纯化过程：(1)Butyl 650M疏水作用色谱，(2)硼酸盐存在下的Poros 50HQ阴离子交换色谱，(3)Q阴离子交换色谱。该方法具有以下几个优点：(1)相对简单，无渗析或渗滤步骤；(2)重复性好；(3)最终产率超过50％；(4)最终纯度超过98％。以前，硼酸树脂一直用于从蛋白质中分离糖蛋白。然而，将硼酸盐阴离子与常规阴离子交换树脂结合可实现从糖蛋白中分离免疫毒素，没有必要根据优质生产规范准则评估非标准树脂。因此，将硼酸盐阴离子交换色谱用于从巴斯德毕赤酵母糖蛋白中分离免疫毒素。
免疫毒素只有单体形式具有功能活性。然而，从发酵过程中收获的上清液包含免疫毒素的单体、二聚体和更高的寡聚体形式，以及巴斯德毕赤酵母蛋白。在这些巴斯德毕赤酵母蛋白之中，一种约45kDa的糖蛋白以二聚体形式(～90kDa)存在。二聚体和更高的寡聚体形式的免疫毒素可相对容易地使用常规疏水作用色谱和阴离子交换色谱分离。然而，分离纯单体免疫毒素非常困难，因为45kDa的糖蛋白与单体免疫毒素的大小、疏水性和等电点非常相似。
以前，一直使用固定的苯硼酸树脂从蛋白质中分离糖蛋白(Myohanen et al.，1981；Bouritis et al.，1981；Williams et al.，1981；Zanette et al.，2003)。根据pH值、糖的存在与否、糖的类型、糖的浓度和缓冲液类型，这些固定树脂可结合并选择性阻碍糖蛋白。将免疫毒素与45kDa的糖蛋白分离时使用硼酸盐阴离子交换色谱，而不使用固定苯硼酸亲和色谱，因为苯硼酸树脂的分离能力太差。硼酸盐与具有邻近顺式羟基的糖残基形成复合物(Boeseken，1949)，并且这些复合物可逆(Weigel，1963)。硼酸盐与糖蛋白上的碳水化合物形成可逆复合物，导致糖蛋白的负电荷增加。该性质使得非糖蛋白和糖蛋白的分离可以在阴离子交换色谱上进行(Nomoto et al.，1982；Nomoto and Inoue，1983)。
在分离免疫毒素与糖蛋白的过程中，硼酸盐阴离子交换色谱和苯硼酸亲和色谱具有不同的结合特性。在苯硼酸亲和色谱中，糖蛋白以及免疫毒素在低离子强度条件下结合，它们可使用0-100mM硼酸钠梯度或0-50mM山梨糖醇梯度共洗脱，说明免疫毒素通过另一种机制与至少一种结合的糖蛋白发生物理相互作用，或者与苯硼酸柱发生相互作用。纯化的二价免疫毒素也可与苯硼酸柱结合，这一事实说明结合通过另一种机制进行。
在以前的使用摇瓶培养的纯化方法中，采用包括DEAE阴离子交换色谱和蛋白L亲和色谱的2步操作过程来纯化免疫毒素(Woo et al.，2002)。然而，在巴斯德毕赤酵母的高密度发酵罐培养上清液中，含有严重影响阴离子交换树脂能力的物质。另外，蛋白L亲和步骤需要超大型柱，费用较高，且没有优质生产规范(GMP)认证。因而，需要开发其他方法。利用Butyl 650M的疏水作用色谱可顺利进行捕捉步骤，但同样，浓缩的巴斯德毕赤酵母糖蛋白与免疫毒素具有相似的电荷、大小和疏水性。刀豆素A(concanavalin A)亲和树脂有望可除去糖蛋白，但具有潜在毒性的刀豆素A从树脂上流下，造成对最终产品的不可接受的污染。
阴离子交换柱可以是但不限于阴离子丙烯酸、阴离子琼脂糖、阴离子纤维素、阴离子葡聚糖或阴离子聚苯乙烯。阴离子交换柱优选Poros HQ 50和Q阴离子交换柱。在本发明中，通过使用Poros 50 HQ硼酸盐交换色谱，可实现免疫毒素单体形式的基本纯化，尽管洗脱部分的免疫毒素被稀释。因此，随后通过Q阴离子交换色谱进行浓缩步骤。
疏水作用柱可以是但不限于Phenyl-CL-4B，OctylAgarose，Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow，Phenyl-Agarose，Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow，Octyl-Sepharose 4 Fast Flow，Butyl SepharoseTM4 Fast Flow，Octyl Agarose，Phenyl-Agarose，Hydrophobicchromatography media-monoamino MAA-8，Hexyl-Agarose，Dodecyl-Agarose，Hexyl-Agarose，4-Phenylbutylamine-Agarose，Ethyl-Agarose，Matrix，Butyl-Agarose，Propyl Agarose，Affinitychromatography media AAF-8，Octyl Agarose，Butyl-Agarose，Decyl-Agarose，Phenyl-Agarose，Methyl Matrix：Ceramic HyperD FHydrogel Composite，Octyl Agarose，Trityl-Agarose，Q Sepharose，Ether 650，Phenyl 650，Butyl 650或Hexyl 650。疏水作用柱优选Butyl650M疏水作用柱。
这里的硼酸盐阴离子交换色谱可用于纯化巴斯德毕赤酵母表达的其他蛋白。巴斯德毕赤酵母正越来越多地用作治疗用重组蛋白的表达系统(Cereghino et al.，2002)。由于巴斯德毕赤酵母和人类的糖基化作用模式具有显著差异，许多这些重组蛋白已经去掉了其糖基化作用位点。然后这些重组蛋白可使用硼酸盐阴离子交换色谱来纯化。
可考虑使用任何缓冲液、流速和柱大小，只要与装在柱上的免疫毒素相比，其可以成功影响免疫毒素的洗脱，使之处于更加纯净的状态。
本发明中使用的免疫毒素包括与抗体部分(靶向部分)相连的突变型毒素部分(如DT毒素)。可使用的毒素包括但不限于白喉毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素。抗体部分优选单链(sc)可变区。
除非另有说明，本发明实施时将采用分子生物学、微生物学、重组DNA、蛋白质化学和免疫学领域内的常规技术。这些技术在参考文献中给出详细解释，包括Sambrook，et al.，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL第二版(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)；DNA CLONING，第I和II卷，D.N Glover编著(IRL Press，1985)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS，M.J.Gait编著(IRL Press，1984)；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION，B.D.Hames和S.J.Higgins编著(IRL Press，1984)；TRANSCRIPTION AND TRANSLATION，B.D.Hames和S.J.Higgins编著，(IRL Press，1984)；ANIMAL CELLCULTURE，R.I.Freshney编著(IRL Press，1986)；IMMOBILIZEDCELLS AND ENZYMES，K.Mosbach(IRL Press，1986)；B.Perbal，APRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING，Wiley(1984)；系列METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，Inc.；GENETRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS，J.H.Miller和M.P.Calos编著(Cold Spring Harbor Laboratory，1987)；METHODSIN ENZYMOLOGY，第154和155卷，分别由Wu和Grossman编著，以及Wu编著，(Academic  Press，1987)，IMMUNOCHEMICALMETHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY，R.J.Mayer和J.H.Walker编著(Academic Press London，Harcourt Brace U.S.，1987)，PROTEIN PURIFICATION：PRINCIPLES AND PRACTICE，第2版(Springer-Verlag，N.Y，(1987)，和HANDBOOK OF EXPERIMENTALIMMUNOLOGY，第I-IV卷，D.M.Weir et al.，(Blackwell ScientificPublications，1986)；Kitts et al.，Biotechniques  14：810-817(1993)；Munemitsu et al.，Mol.and Cell.Biol.10：5977-5982(1990)。
本发明利用了编码含白喉毒素的融合蛋白的核酸，其中该核酸可由酵母细胞表达。可由酵母表达的核酸包括修饰的天然白喉编码序列。为了促进本发明的核酸由酵母细胞的表达，对富含A和T核苷酸的核酸区进行修饰，以使其编码的免疫毒素融合蛋白可由酵母表达。例如，这种修饰使之可由巴斯德毕赤酵母表达。这种修饰设计为可抑制聚腺苷酸化信号和/或减少RNA转录的提前终止。更具体地说，对天然白喉编码序列的一个或多个富含AT区进行修饰，减少AT含量。富含AT区包括AT含量至少60％的至少150个连续核苷酸的区域，或者AT含量至少65％的至少90个连续核苷酸的区域，富含AT区的AT含量优选降至55％或更低。富含AT区还包括AT含量至少63％的至少150个连续核苷酸的区域，或者AT含量至少68％的至少90个连续核苷酸的区域，富含AT区的AT含量降至55％或更低。优选将天然白喉编码序列进一步修饰以编码C末端截短的白喉毒素。而且，优选将天然白喉编码序列进一步修饰，以在天然白喉毒素氨基末端甘氨酸残基之前编码一个或多个氨基酸。而且，优选将天然白喉编码序列进一步修饰，以编码α-交配因子信号肽或其一部分。
本发明的免疫毒素可在多种生物体内表达和纯化。这些生物体包括酵母如巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母，细菌如大肠杆菌，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或杆状病毒感染的昆虫细胞。使用酵母表达系统(包括，例如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母)有以下几个优点。首先，有证据表明，由酵母分泌系统产生的蛋白显示正确的二硫配对(disulfide pairing)。其次，使用酵母表达系统，可进行高效的大规模生产。酿酒酵母前-原-α交配因子前导区可用于指导酵母的蛋白分泌(Brake，et al.(82))。前-原-α交配因子的前导区包括信号肽和原-片段，其中原-片段又包括由KEX2基因编码的酵母蛋白酶的识别序列：该酶在Lys-Arg二肽切割信号序列的羧基一侧将前体蛋白切除。核酸编码序列与前-原-α交配因子前导区发生框内(in-frame)融合。该构建体可放置于强转录启动子的调控之下，如醇脱氢酶I启动子、醇氧化酶I启动子、糖分解启动子(glycolytic promoter)或者半乳糖利用途径启动子。核酸编码序列随后是翻译终止密码子，再后是转录终止信号。或者，核酸编码序列可与另一条蛋白编码序列(如Sj26或β-半乳糖苷酶)融合，以有利于融合蛋白通过亲和色谱法纯化。可在用于酵母表达的构建体内插入蛋白酶切割位点，以便将该融合蛋白的各部分分开。
当白喉毒素A链在胞质溶胶区合成而没有分泌信号时，该毒素对酵母是有毒性的(Parentesis et al.，1988)。该毒素催化活性对EF-2具有特异性，发生于第699位的独特的翻译后组氨酸残基，该残基在所有真核生物EF-2的保守性氨基酸序列中均有发现。酵母EF-2中的第701位甘氨酸变为精氨酸残基，可导致对DT产生抗性。
在另一个纯化方法中，(Ala)dmDT390-bisFv(UCHT1)在毕赤酵母(Pichia)培养基中生产，产量在5mg/ml水平，不论是否存在突变型EF-2基因。在以下两方面之间存在极紧耦合：一方面是α-交配因子信号序列的存在，另一方面是(Ala)dmDT390-bisFv(UCHT1)区室化，进入分泌途径而远离胞质溶胶区中的EF-2毒素底物，因为胞质溶胶中的一个毒素分子在24小时内就可以使99％的EF-2失活。利用α-交配因子信号序列在毕赤酵母中生产(Ala)dmDT390-bisFv(UCHT1)，而非使毕赤酵母产生毒素抗性的突变，已经提供了成功的结果。另外，酵母产生的毒素(蓖麻毒素A链)和信号序列Kar2的结合可导致生产细胞的死亡(Simpson et al.，1999(80))。在毕赤酵母中的免疫毒素融合蛋白的基因剂量较高的情况下，mEF-2有可能对生产具有益处。对生产免疫毒素融合蛋白来说，酵母相对于哺乳动物细胞的另一个优势为，未经任何处理的酵母即对存在于外部培养基中的水平高达3.3×10-6M的白喉毒素具有极高的抗性。显然，酵母荚膜阻止了毒素被逆行运输回胞质溶胶区，而在哺乳动物细胞和酵母原生质球中会发生此类现象(Chen etal.，1985)。
本发明可利用包含编码免疫毒素融合蛋白的核酸的细胞。该细胞可为原核细胞，包括，例如细菌细胞。更具体地说，细菌细胞可为大肠杆菌细胞。或者，该细胞可为真核细胞，包括，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括，例如，如Moehring和Moehring所选择的DT抗性CHO-K1RE 1.22c细胞系)、骨髓瘤细胞、毕赤酵母细胞或昆虫细胞。可将免疫毒素融合蛋白编码序列引入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，例如通过氨甲喋呤抗性编码载体，或者使用适当的选择标记引入其他细胞系。可通过DNA印迹分析来确定转化细胞中是否存在载体DNA。可通过RNA印迹分析来确定是否有相应于插入编码序列的RNA产生。已经开发了许多其他适合的宿主细胞系，包括骨髓瘤细胞系、成纤维细胞系，以及多种肿瘤细胞系如黑色素瘤细胞系。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子、增强子，以及必需的信息处理位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。表达控制序列优选来自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒等的启动子。含有所研究的核酸片段的载体可通过公知的方法转入宿主细胞中，且这些方法可根据细胞宿主类型而变化。例如，氯化钙转化通常用于原核细胞，而磷酸钙、DEAE葡聚糖或脂质体(lipofectin)介导的转染或者电穿孔可用于其他细胞宿主。
用于本发明的核酸可与一个或多个可指导和调控插入核酸的转录的功能元件有效连接，并且该核酸可被表达。例如，核酸可与细菌或噬菌体启动子有效连接，用于指导核酸的体外转录。
提供了巴斯德毕赤酵母的突变株。该突变株包括在至少一个编码延长因子2(EF2)的基因中发生突变。该突变包括在修饰的组氨酸残基白喉酰胺的羧基一侧的两个残基位置发生Gly到Arg的替换。籍此，可使该突变株产生对于白喉毒素ADP核糖基化毒性作用的抗性。
提供了一种表达白喉毒素蛋白部分的方法。本发明的此方法包括，在可使细胞中蛋白编码核酸表达的条件下，使用包括毒素蛋白编码核酸的载体转染本发明的突变巴斯德毕赤酵母细胞。所述条件为用于巴斯德毕赤酵母细胞的条件，且可根据该特定系统优化。
抗体部分优选经由抗CD3途径或其他T细胞表位途径。免疫毒素可为单价，但目前来讲优选二价抗体部分，因为已经发现二价抗体可增强细胞杀伤能力约15倍。可考虑将任何数量的化学耦合或重组DNA方法用于生成本发明的免疫毒素。因此，提到融合毒素或耦合毒素，未必是限制性的。免疫毒素可为重组法制备的融合蛋白。可在重组产生的二价抗体(靶向部分)和重组产生的突变型毒素部分的特殊位点，通过化学硫醚键连接制备免疫毒素。免疫毒素的靶向部分可包括人μCH2、μCH3和μCH4区，以及来自鼠Ig抗体的VL和VH区。这些区可来自抗体UCHT1，以使该抗体部分为scUCHT1，它是具有人μCH2、μCH3和μCH4区和如图所示的小鼠可变区的单链CD3抗体。可考虑多种DT突变型毒素部分，包括例如DT390和DT389，带有多个突变或者以野生型毒素部分的形式。
毒素部分保留其毒性功能，以及全部膜易位至胞质溶胶的功能。位于该蛋白的受体结合区域的结合功能的丧失，可通过减少与非靶细胞的结合来实现减小全身毒性。因此，该免疫毒素可安全施用。通常由毒素结合功能提供的寻路(routing)功能由靶向抗体抗CD3来提供。重要的寻路途径有(1)定位于有被小窝进行胞吞作用，(2)从溶酶体寻路中逃逸，(3)返回质膜。
任何以此方式寻路的抗体均可与毒素部分一起发挥作用，而不论该抗体所针对的表位，只要毒素沿该途径可实现足够的蛋白酶解加工。足够的加工可通过细胞杀伤水平来确定。
作为核内体酸化的结果，受体构型受特定受体的诱导而变化，可导致抗体与其受体的脱离，这时抗体进入溶酶体途径。这可以通过以下方式避免或控制在最小水平：将抗体导向质膜附近的相同受体上的外功能区表位(Ruud，et al.(1989)Scand.J.Immunol.29：299；Herz etal.(1990)J.Biol.Chem.265：21355)。
突变型DT毒素部分可为具有和没有点突变或置换的截短型突变体，如DT390、DT389或DT383，或其他的截短型突变体，以及具有点突变的全长毒素，如DTM1或CRM9(在溃疡棒状杆菌(C.ulcerans)中克隆)，与DTM1和DT483的scUCHT1融合蛋白，DT390和DT389，并且已经在大肠杆菌中克隆和表达。抗体部分可为具有本文所详细叙述的寻路和其他特性的scUCHT1或其他抗CD3或抗T细胞抗体。因此，用于本发明方法的免疫毒素的一个实例包括融合蛋白免疫毒素UCHT1(或其片段)-DT390。
有一条糖基化作用的共有序列(NXS/T(SEQ ID NO：19))，可将其去除或插入以控制糖基化作用。糖基化作用存在于所有真核生物中，如巴斯德毕赤酵母。
有多种免疫毒素的变体。蛋白变体和衍生物为本领域技术人员所公知，可包括氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常可归入三类中的一类或多类：置换、插入或缺失变体。插入包括氨基和/或羧基末端融合，以及在序列内部插入单个或多个氨基酸残基。插入通常为比氨基或羧基末端融合小的插入，例如大约一至四个残基。具免疫原性的融合蛋白衍生物，例如实施例中所述的，是通过体外交联或者使用编码该融合蛋白的DNA转化的重组细胞培养，以使足够大的可产生免疫原性的多肽与靶序列融合来制备。缺失的特征是一个或多个氨基酸残基从蛋白序列中去除。通常在蛋白分子内的任何位点，不超过大约从2至6个残基缺失。这些变体一般通过将编码该蛋白的DNA中的核苷酸进行定点诱变制备，由此产生编码该变体的DNA，然后在重组细胞培养中表达。在具有已知序列的DNA中的预定点造成置换突变的技术已为公知，例如M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸置换通常为单个残基，但可以同时在多个不同位置发生；插入通常为大约1至10个氨基酸残基；缺失的范围为大约1至30个残基。缺失或插入优选在相邻的一对中发生，即2残基缺失或2残基插入。置换、缺失、插入或其任意形式的结合可一起实现最终的构建体。突变不可将序列置于读框之外，优选不产生可导致二级mRNA结构的互补区。置换变体是去掉至少一个残基并在该位置插入另一个残基形成的变体。该置换一般按照下表进行，被称为保守性置换。
氨基酸缩写
  氨基酸   缩写
  丙氨酸   Ala，A
  Allosoleucine   AIle
  精氨酸   Arg，R
  天冬酰胺   Asn，N
  天冬氨酸   Asp，D
  半胱氨酸   Cys，C
  谷氨酸   Glu，E
  谷氨酰胺   Gln，K
  甘氨酸   Gly，G
  组氨酸   His，H
  异亮氨酸   Ile，I
  亮氨酸   Leu，L
  赖氨酸   Lys，K
  苯丙氨酸   Phe，F
  脯氨酸   Pro，P
  焦谷氨酸   PGlu
  丝氨酸   Ser，S
  苏氨酸   Thr，T
  酪氨酸   Tyr，Y
  色氨酸   Trp，W
  缬氨酸   Val，V
氨基酸置换
初始残基示例性保守性置换，其他为本领域所公知。
  Ala   ser
  Arg   lys，gln
  Asn   gln，his
  Asp   glu
  Cys   ser
  Gln   asn，lys
  Glu   asp
  Gly   pro
  His   asn，gln
  Ile   leu，val
  Leu   ile，val
  Lys   arg，gln；
  Met   leu，ile
  Phe   met，leu，tyr
  Ser   thr
  Thr   ser
  Trp   tyr
  Tyr   trp，phe
  Val   ile，leu
可通过下列方法使功能或免疫同一性发生较大变化：选择与氨基酸置换表中的置换相比，保守性较低的置换，即选择对维持以下方面的效果有显著差异的残基：(a)置换区的多肽骨架结构，例如折叠或螺旋构象，(b)靶位点的分子电荷或疏水性，或者(c)侧链大小。通常会使蛋白性质发生最大变化的置换是：(a)亲水性残基(如丝氨酰基或苏氨酰基)置换疏水性残基(如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)(或者前者被后者置换)；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换任何其他残基(或者被任何其他残基置换)；(c)具有正电侧链的残基(如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)置换负电残基(如谷氨酰基或天冬氨酰基)(或者前者被后者置换)；或者(d)具有较大侧链的残基(如苯丙氨酸)置换没有侧链的残基(如甘氨酸)(或者前者被后者置换)，在这种情况下，(e)增加硫酸化和/或糖基化位点的数目。
例如，一个氨基酸残基被另一个生物或者化学上相似的氨基酸残基替换，这作为保守性置换已为本领域技术人员所熟知。例如，保守性置换可使用一个疏水性残基置换另一个疏水性残基，或者使用一个极性残基置换另一个极性残基。这种置换所包括的组合例如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；以及Phe、Tyr。各条明确公开的序列的此类保守性置换变异形式均包含于本发明提供的嵌合体多肽之中。
置换或缺失诱变可用于插入N糖基化作用位点(Asn-X-Thr/Ser)或O糖基化作用位点(Ser或Thr)。可能还需要使半胱氨酸或其他不稳定残基发生缺失。潜在的蛋白酶解位点(如Arg)的缺失和置换，可通过例如使一个碱性残基缺失或者使一个残基被谷氨酰胺酰基或组氨酰基残基置换来实现。
一定的翻译后衍生作用是重组宿主细胞对所表达的多肽作用的结果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基常在翻译后脱去酰胺，变成相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。或者，这些残基在温和的酸性条件下脱去酰胺。其他的翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的o-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and MolecularProperties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco pp 79-86[1983])，N末端胺的乙酰化，以及在某些情况下，C末端羧基的酰胺化。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)的表达载体还可包括可影响mRNA表达的、转录终止必需的序列。这些区域在编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中，转录为聚腺苷酸片段。3′非翻译区还包括转录终止位点。转录单位优选还包括聚腺苷酸区。该区的一个作用是增加了转录单位像mRNA一样被处理和转运的可能性。表达构建体中聚腺苷酸信号的识别和利用方法已经较好地建立起来。优选将同源聚腺苷酸信号用于转基因构建体。在某些转录单位中，聚腺苷酸区来自SV40早期聚腺苷酸信号，并且包括大约400个碱基。转录单位还优选包括其他标准序列，单独或与以上序列相结合，以提高构建体的表达水平或稳定性。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供本发明所要求保护的化合物、组合物、产品、装置和/或方法的制备和评估手段的完全公开和描述，仅仅出于示例性目的，并非意在限制本公开的范围。已经努力确保有关数字(如数量、温度等)的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，温度以℃为单位或者为环境温度，压力等于或接近大气压。
实施例1：使用经诱变处理的寡核苷酸转化
56个核苷酸的寡聚体(见引物列表)包含两点突变，将氨基酸701从甘氨酸换为精氨酸。经诱变处理的寡聚体(56聚体，100μg)与ARG4DNA片段共转化进入GS200(Mut+，His-，Arg-)菌株。带有启动子的ARG4基因通过Sph I和EcoR V取自质粒PMY30(由Prof.Jim Cregg，Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences，Claremont，CA 91711提供)。共获得大约1000个转化体。为了筛选具有正确突变的突变型克隆，采用使用引物mdb1EF-2和2253EF-2C的诊断PCR。突变检测引物(mdb1EF-2)可以区分正常基因和氨基酸701突变的基因的DNA序列。对于正常基因来说，得不到PCR产物，因为3′端的2个核苷酸与正常基因的DNA序列不匹配，Taq聚合酶阻止了其延伸。对于突变基因，引物可完美退火，所以Taq聚合酶可产生PCR产物。用这种PCR方法筛选了1000多个菌落，但没有发现突变型菌落。(在以上的PCR检测中，来自酿酒酵母的氨基酸701突变的EF-2用作阳性对照。该突变基因已经事先制备出来，意在将其引入巴斯德毕赤酵母中。然而，以此转化的巴斯德毕赤酵母生长速率极低，产生所需蛋白的水平也很低。)
使用包含EF-2基因保守区和氨基酸701突变的部分DNA片段进行转化。巴斯德毕赤酵母EF-2的部分序列(位置1717至2289，图3(a)(b)(c)(d))在体外发生突变，将氨基酸701从甘氨酸变为精氨酸(图1b)，然后与ARG4基因片段共转化进入GS200菌株。共获得2000多个Arg4阳性转化体，再通过诊断PCR使用引物mdb2EF-2和2253EF-2C从中筛选EF-2突变。未观察到突变。
引物列表：
来自酿酒酵母EF-2的引物：
5’引物：TTG GTT ATT GAC CAA ACT AAG GCT CTCCAA(SEQ ID NO：20)
3’引物：ACC TCT CTT CTT GTT TAA GAC GGA GTA GAT(SEQ ID NO 21)
在巴斯德毕赤酵母EF-2的克隆和突变中使用的引物：
dT22-Not：5’-CTT GCT TTT GCG GCC GCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT(SEQ ID NO：22)
EF-2C2：5’-G ATA AGA ATG CGG CCG CCA TTT CTT GGT CTT TGG GTTGAA G(SEQ ID NO：23)
EF-2C1：5’-GAT AAG AAT GCG GCC GCC AAC TTA GTT GTT GAC CAG TCTAAG(SEQ ID NO：24)
5’EF-2：5’-ATA GCT AGC ACT TTG AAG TTC TTA ATT TTG TTC CTC (SEQID NO：25)
3’EF-2C：5’-ATA AGA ATG CGG CCG CAA GTT AAT GAA ACA TTA AGCTTA
CAA C(SEQ ID NO ：26)
wEF-2：5’-G AAT GAC TTG TCC TCC ACC (SEQID NO：27)
mEF-2：5’-G AAT GAC TTG TCC TCC GCG G(SEQ ID NO：28)
EF-1426：5’-CAA CTA GCT AGC GCT CAC AAC ATG AAG GTC ATG AAATTC(SEQ ID NO：29)
EF-1318：5’-AGA ACC GTC GAG CCT ATT GAC GAT(SEQ ID NO：30)
经诱变处理的寡核苷酸：
5’-CC CTG CAC GCC GAT GCT ATC CAC AGA AGA GGA GGA CAA
GTC ATT CCA ACC ATG AAG (SEQ ID NO：31)
mdb1EF-2：5’-GCC GAT GCT ATC CAC AGA AGA(SEQ ID NO：32)
mbb2EF-2：GCC GAT GCT ATC CAC CGC CGC(SEQ ID NO：33)
2253EF-2C：TCT CTT CTT GTT CAA AAC AGA GTA GAT ACC(SEQ ID NO ：34)
实施例2：使用突变型EF-2部分片段和ARG4片段进行原生质球转化。
在实施例1的方法中，没有针对野生型DT的筛选步骤。因而采用双转化。首先，突变型EF-2片段通过电穿孔法转化进入GS200菌株。然后，将电穿孔细胞过夜培养，使其在细胞内表达突变型EF-2。培养的细胞用于制备原生质球。生成的原生质球使用野生型DT(200μg/ml)和ARG4片段(10μg)处理1小时，并且通过CaCl2和PEG转化。只获得少量正常菌落大小的转化体，没有突变菌株。另外，还获得100个或更多的微小菌落。对这其中100个进行筛选，没有检测到突变菌株。
实施例3：巴斯德毕赤酵母EF-2基因的克隆和测序
在克隆巴斯德毕赤酵母EF-2基因的全序列之前，已经获得其部分序列。最开始，从基因组DNA中扩增巴斯德毕赤酵母EF-2的保守性R结构域，该过程使用来自酿酒酵母EF-2的相同结构域的两个引物(Perentesis et al.，1992)。5′引物包括酿酒酵母EF-2中从位置1933至1962的序列，而3′引物与2227至2256区域互补。然后在巴斯德毕赤酵母EF-2基因的编码区内，这条324个核苷酸的序列在5′端延伸至位置284，在3′端延伸至位置2289。后来发现这条延伸的序列包含几处错误。为了克隆整个巴斯德毕赤酵母EF-2基因，首先使用两条不同的引物从EF-2mRNA分别合成了两种cDNA。引物dT22-Not包括与mRNA的3′polyA尾巴互补的一串22个T残基，以及限制酶Not 1的识别序列。引物EF-2C2有25个核苷酸，它与巴斯德毕赤酵母EF-2编码序列的位置747至771的核苷酸(图3(a)(b)(c)(d))互补。cDNA合成后，一串同聚物A残基通过同聚物加尾反应加至由引物C2延伸的cDNA的3′端(Sambrook et al.，1989)。EF-2的5′端序列通过PCR从经过修饰的、使用EF-2C2和dT22-Not引物合成的cDNA扩增，而3′端序列从使用引物dT22-Not和EF-2C1合成的cDNA扩增，后者包括对应于位置1927至1953的27个核苷酸。然后将代表巴斯德毕赤酵母EF-2的5′端和3′端序列的PCR产物分别克隆进入pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)。
选出5个包含巴斯德毕赤酵母EF-2的5′序列的独立的克隆用来测序。它们首先使用位于载体内分别靠近插入物上游和下游的M13反向引物和M13正向引物来测序，然后使用与EF-2编码序列的位置349至384互补的内引物(internal prime)来测序。在5个克隆中，三个具有相同的序列，一个在两个不同的内部位置具有两个不同的核苷酸，另一个在一个不同的位置具有另一个不同的内核苷酸(internalmucleotide)。这些不同的核苷酸有可能是在克隆过程中产生的，因为这些不同的核苷酸在来自基因组DNA的克隆中均没有出现。在5′端，所有五个克隆在第一个ATG密码子之前都还有57到69个相同序列的核苷酸。5′端序列的最大的开放读码框(ORF)开始于第一个AUG，有747个核苷酸，其推得的氨基酸序列(249个氨基酸)与酿酒酵母EF-2的N末端的前249个氨基酸具有90％的相同性。所有包括EF-2序列的3′端序列的四个克隆都具有相同的675个核苷酸的序列，随后是同聚物A串(homopolymeric A track)。最大的ORF有603个核苷酸，结束于终止密码子TAA，该密码子位于poly-A串的上游72个核苷酸处。推得的氨基酸序列(201个氨基酸)与酿酒酵母EF-2的C末端的后201个氨基酸具有85％的相同性。已经获得巴斯德毕赤酵母EF-2的5′和3′端序列之后，设计两个引物用来从巴斯德毕赤酵母基因组DNA中扩增整个EF-2基因。引物5′EF-2来自5′非编码区，包括相对于ATG起始密码子的位置28至54的序列。引物3′EF-2C包括与3′端的位置2523至2549互补的27个核苷酸。使用Pfu聚合酶(Stratagene)进行PCR扩增之后，EF-2基因的PCR产物使用Taq聚合酶处理，以使其加上3′A突出端(overhanging)(Instructionmanual for original TA cloning kit，Invitogen)，然后将其插入TA克隆载体pCR2.1-TOPO。选出十个克隆，从这些克隆分离质粒DNA，对其进行限制酶分析表明它们均具有相同的插入物。首先使用M13反向引物和M13正向引物进行DNA测序，然后使用来自前一步所获序列的引物，一步步地朝相对一端进行测序。八个克隆被完全测序，结果序列相同。从基因组DNA获得的3′端序列与来自mRNA的序列相同。然而，与mRNA的5′序列相比，来自基因组DNA的序列在紧接EF-2ORF起始位点的密码子中具有77个核苷酸的插入物(图2)。该插入物具有序列GTATGT...CACTAAC...TAG(SEQ ID NO：35)，即酿酒酵母的短内含子的保守模式(Davis et al.，200；Rymond & Rosbash，1992)。尽管内含子在酿酒酵母中很常见，但在巴斯德毕赤酵母中却极少出现(Gregg，personal communication)。巴斯德毕赤酵母EF-2的编码序列显示于图3(a)(b)(c)(d)。它包括2526个核苷酸，编码842个氨基酸。巴斯德毕赤酵母EF-2与酿酒酵母和裂变酵母EF-2的长度相同，并且其氨基酸序列与酿酒酵母有88％的相同性(Perentesis et al.，1992)，与裂变酵母有78％的相同性(Mita et al.，1997)。酿酒酵母和裂变酵母在每一单倍体基因组中均有两个功能性EF-2基因(EFT1和EFT2)。这两个EF-2基因拷贝编码相同的氨基酸序列，但在编码区中有少数核苷酸不同(酿酒酵母有4个，裂变酵母有13个)，侧翼序列也不同。然而，来自mRNA和基因组DNA的独立克隆的测序数据显示，所有不同的克隆均具有相同的5′和3′端侧翼序列以及相同的编码序列。这再加上限制酶消化的基因组DNA的DNA印迹证据，说明巴斯德毕赤酵母只有一个EF-2基因拷贝。
实施例4：构建突变质粒pBLURA-Δ5’mutEF-2。
为了制备DT抗性的巴斯德毕赤酵母菌株，使EF-2基因发生突变，将711位的Gly变为Arg。将突变引入基因组中所采用的手段是根据Shortle et al.(1984)的叙述，并显示于图4中。在该方法中，使用靶基因的截短型(只在一端)，通过同源重组将突变引入基因组中的基因中。整合带有突变的截短型基因片段将导致下述情形：基因组包括一个带有突变的该基因的完整拷贝，以及一个截短型拷贝。因为靶位点位于3′端附近，所以使用5′截短型EF-2(Δ5’EF-2)作为突变序列。Δ5’EF-2包括来自EF-2的3′端的1127个核苷酸，从位置1432至2549(图3)，通过PCR使用Pfu聚合酶产生。在克隆进入pCR2.1-TOPO载体之后，通过寡核苷酸指导的诱变，使Δ5’EF-2在体外发生突变。然后通过使用限制酶Nhe1和Not 1分别切5′和3′端，使突变的Δ5’EF-2(Δ5’mutEF-2)从pCR2.1-TOPO上释放，然后克隆进入已经被Nhe1和Not 1消化的载体pBLURA-SX(由Cregg教授提供，记载于Geoffreyet al.(2001))中。该载体包括营养缺陷标记URA3。从细菌中纯化的质粒DNA pBLURA-Δ5’mutEF-2被线性化，再由电穿孔转入巴斯德毕赤酵母菌株中。该质粒DNA包括一个独特的Aat II位点，位于EF-2序列中突变位点之前大约220个核苷酸处。在该位点切割可使质粒整合靶向于EF-2基因座，并且有利于使突变的序列转移至EF-2的完整拷贝中。使用该质粒DNA转化三个巴斯德毕赤酵母尿嘧啶营养缺陷菌株。它们是JC308(ade1 arg4 his4 ura3)、JC303(arg4 his4 ura3)和JC307(his4 ura3)，全部由Cregg教授提供并记载于Geoffrey et al.(2001)。先转化JC308，然后转化JO303和JC307。
实施例5：识别含突变型EF-2的克隆。
在使用线性化的pBLURA-Δ5’mutEF-2DNA电穿孔之后，将细胞涂布在含有缺少尿嘧啶的合成完全酵母培养基的平板上(K.D Medical，Maryland)。然后通过“菌落PCR”分析Ura+克隆，以确定在完整的EF-2拷贝中是否含有正确的突变。在该方法中，使用牙签从菌落中选取酵母细胞，重新悬浮于20μl的PCR混合液(PCR mix)中。在第一个PCR步骤(94℃，5分钟)中将细胞裂解，从中释放的DNA作为PCR扩增的模板。在PCR检测程序中使用五个引物：引物5′EF-2和3′EF-2C在前面的第4部分中已经叙述；EF-2(1318)具有从位置1318至1341的EF-2序列；引物wEF-2与位置2100至2119互补，而引物mEF-2具有相同位置的互补序列，但对该突变有特异性。如图1b所示设计的核苷酸突变可产生新的Sac II限制酶位点，可用于确定基因组中含有正确的突变。
首先使用引物5′EF-2和mEF-2检测Ura+转化体中的突变。图6a显示，所选的12个JC308Ura+克隆之中，有9个(克隆1、2、3、12、13、14、33、40和41)为mEF-2引物阳性，它们具有预期大小(大约2.2kbp)的PCR产物，而克隆25、38和47为阴性。如图6b所示，当使用引物EF-2(1318)和wEF-2分析相同的克隆以确定是否存在野生型序列时，所有三个mEF-2-克隆均为wEF-2引物阳性。产生了0.8kbp的PCR片段。所有的mEF-2+克隆，除克隆33和41也为wEF-2+外，其余均为wEF-2-。最后当使用引物EF-2(1318)和3′EF-2C时，选择的所有克隆均产生如预期的约1.2kbp大小的PCR产物(图6c)。来自mEF-2+且wEF-2-克隆的PCR产物被Sac II完全消化，而来自mEF-2.但wEF-2+的克隆25、38和47的PCR产物不能被该酶切割。同时为mEF-2+且wEF-2+的情况下，克隆33和41既生成可被Sac II切割(clearable)的PCR产物，也生成不能被其切割的产物。为了研究为何克隆33和41既有突变型也有野生型EF-2，将这些克隆划线接种于新的选择板，使这些细胞生长形成菌落。从每个克隆中选取十个完全分离的菌落，使用引物EF-2(1318)加引物3′EF-2C进行PCR，并进行Sac II消化步骤。所有克隆均未得到与原来相同的混合PCR产物。来自克隆33的4个菌落、来自克隆41的7个菌落的PCR产物可被SacII完全消化，而来自克隆33和41的其他菌落完全不能被切割。该实验说明，克隆33和44最初每一个都是由两个不同的细胞形成的，一个具有带突变的完整EF-2，另一个具有完整野生型EF-2。然后重复该实验，检测一些具有只能被Sac II裂解的EF-2的克隆(克隆1、2、3、12、13、14和40)，证明它们只含有突变型完整EF-2。成功获得JC308的EF-2突变体克隆之后，使用相同的选择步骤识别JC303和JC307的EF-2突变体克隆。在选出来要进行分析的Ura+阳性克隆中，35％只包含突变型完整EF-2。如此高的完全突变频率的原因可能是巴斯德毕赤酵母的每个单倍体基因组只有一个EF-2拷贝。如CHO细胞和酿酒酵母所表现的一样，巴斯德毕赤酵母中Arg置换EF-2的Gly711在正常条件下不会影响细胞生长。
实施例6：在EF-2突变体中表达DT A链。
为了验证所获得的EF-2突变体是否对DT表达具有抗性，使用质粒DNA pPIC3-DtA转化mutEF2JC307-8，即JC307的一个EF-2突变体克隆(克隆8)。构建pPIC3-DtA的方法已有记载(Woo et al.，2002)。简单地说，在5′端使用BamH I，在3′端使用Not I，通过PCR扩增DTA链基因，将其插入巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC 3(Invitrogen)中，并使用这两种酶消化。整合pPIC3-DtA能够使其一经甲醇诱导即可在胞质溶胶中表达DT。该质粒DNA先前已经用于转化巴斯德毕赤酵母GS200菌株(Invitrogen)，所得的两个克隆(C3和C4)已用于研究巴斯德毕赤酵母对DT的耐受性(Woo at al.，2002)。C3已被鉴定为不表达DT A的克隆，而C4为表达DT A的克隆。在使用pPIC3-DtA转化之后，随机挑选六种mutEF2JC307-8克隆，即mutEF2JC307-8-DtA(1)至(6)，用于分析其在胞质溶胶中表达DT A链的情况，以及甲醇诱导后的存活能力。来自单一菌落mutEF2JC307-8-DtA(1)至(6)、C3和C4的细胞，在2ml YPD(酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖)培养基中30℃过夜培养，然后离心沉淀。来自各培养物的细胞重新悬浮于YP培养基，使密度达到OD600nm±0.5。通过加入甲醇至1％来诱导细胞悬液(2ml)，并在剧烈摇动中30℃下培养。甲醇诱导24小时后，各培养物均取100μl，使其细胞沉淀，并用PBS缓冲液冲洗。然后，细胞重新悬浮于PBS中，并混以蛋白样本缓冲液。最后，样本经过两个煮沸和干冰冷却循环，使用DT特异性抗体通过SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析。mutEF2JC307-8-DtA(3)和(5)、C3和C4的培养物也用于生存力测试。这通过下述步骤进行：使用PBS缓冲液将各培养物稀释104至107倍，将100μl的等分铺于YPD板上，30℃下培育3天，统计出现于板上的菌落数。SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析结果显示，除了mutEF2JC307-8-DtA(5)，所有的mutEF2JC307-8-DtA克隆均表达DT A链(图7a)。mutEF2JC307-8-DtA(3)的表达水平粗略估计为20μg/ml细胞培养物。跟预期一样，C3不表达DT A。尽管C4不表达DT A，蛋白质谱带却隐约可见(图7b)。甲醇诱导前，mutEF2JC307-8-DtA(3)和(5)、C3和C4每毫升细胞的菌落形成单位(CFU)数量几乎相同。甲醇诱导24小时后，mutEF2JC307-8-DtA(3)和(5)以及C3的CFU数量都增长了大约103倍，而C4的CFU数量下降了大约102(图8)。该结果说明，带有突变型EF-2的细胞在胞质溶胶中表达DT A链不会对细胞造成毒害。
实施例7：摇瓶培养小规模表达
首先使用mutEF2JC307-8表达二价免疫毒素。由于该EF-2突变体为组氨酸营养缺陷型，使用含有二价免疫毒素——Woo et al.(2002)中记载的A-dmDT390-bisFv的修饰基因最终版本的质粒pPIC9K转化。二价指两个重复的sFv抗体片段。用于转化、转化体选择以及蛋白表达和分析的方法均已有记载(Woo et al.，2002，其中教导的方法通过引用全部纳入本说明书)。转化后，随机选取12个菌落分析其蛋白表达。SDS-PAGE电泳分析显示，所选克隆全部表达二价免疫毒素，但是有些克隆，如克隆编号2[mutEF2JC307-8(2)]，其表达水平比其他略高。当它们在相同条件下培养和表达相同时间时，mutEF2JC307-8(2)表达二价免疫毒素的水平与pJHW#2相同，后者为已使用pPIC9K-A-dmDT390-bisFv转化的GS115克隆(带有野生型EF-2)。在摇瓶培养中，mutEF2JC307-8(2)和pJHW#2的表达水平约为5至10μg/ml培养上清液。mutEF2JC307-8(2)的表达水平并非相对较高的事实说明，除了EF-2ADP核糖基化，还有其他因素限制二价免疫毒素的产生。
再次尝试在突变型巴斯德毕赤酵母中表达二价免疫毒素，将A-dmDT390-bisFv基因的两个拷贝引入mutEF2JC303-5，即JC303的EF-2突变克隆(克隆5)，其为组氨酸和精氨酸营养缺陷型。为了构建带有ARG4选择标记的表达载体，将A-dmDT390-bisFv基因(见图20)克隆进入表达载体pBLARG-SX3中，该表达载体由Cregg教授提供，并记载于Geoffrey et al.(2001)。这通过以下步骤完成：将A-dmDT390-bisFv基因最终版，加上经由Hind III和Not I消化从pPICZα(Woo et al.，2002)释放的α-因子信号序列，插入已经使用这两种限制酶切割的pBLARG-SX3中。产生的构建体pBLARG-A-dmDT390-bisFv(图9a)，与pPIC9K-A-dmDT390-bisFv一起经电穿孔同时引入mutEF2JC303(5)中。在含有缺少精氨酸和组氨酸的合成完全培养基的平板上(K.D Medical，Maryland)，筛选表达这两种标记基因的转化体。从筛选板上挑选18个菌落，分析其免疫毒素蛋白的表达情况。SDS-PAGE电泳显示，它们分泌进入诱导培养基中的完整免疫毒素蛋白的量大致相等。这个量与单一拷贝克隆mutEF2JC307-8(2)和pJHW#2分泌的量接近。如图10a所示，所选的三个克隆(克隆3、6、8)还表达一种更小的、但量非常多的可与抗DT抗体反应的蛋白，它与单价免疫毒素的大小相同(Liu et al.，2000)。较小的蛋白比完整蛋白更加稳定，而不管该蛋白是由A-dmDT390-bisFv基因的截短型拷贝产生，还是完整蛋白的蛋白酶解切割产物。该图还显示在培养上清液中有许多其他更小的蛋白可与抗DT抗体反应。它们最有可能是完整蛋白的蛋白酶解切割产物。最小且量最多的一种被鉴定为DT的A链，它非常稳定(Collier 1975)，可看作完整蛋白的蛋白酶解降解的最终产物。该降解也发生于细胞内部(图10b)。因为A链只有完整蛋白的约1/4大小，蛋白质印迹显示的A链数量表明，其实际表达水平可能要高出存在于诱导培养基中的完整蛋白水平的数倍。合成的多数蛋白可能在分泌进入培养基之前或之后降解。尽管双拷贝克隆与单拷贝克隆在培养基中积累等量的完整蛋白，但双拷贝克隆产生更多的降解产物，说明已经合成更多的基因产物。已经采用多种措施控制蛋白降解，但完整蛋白的产量并没有提高。因此，细胞内或细胞外的蛋白降解是提高二价免疫毒素产量的限制因素。实施例8：使用PMSF发酵培养的另一种大规模表达方法
为了进行大规模培养，使用BioFlo 4500发酵罐(New BrunswickScientific Company)，它安装有甲醇传感器(Raven BiotechnologyCompany)，以便精确控制培养物中的甲醇浓度。起始发酵培养基(10L)包含1％酵母提取物，2％蛋白胨或2％大豆胨，4％甘油，1％酪蛋白氨基酸，1.34％含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮碱基，0.43％PTM1盐溶液，以及0.01％消泡剂289(Sigma Co.)或消泡剂204的混合物，0.01％以及Stuktol 0.01％。根据培养条件，甲醇诱导前使用含1.8％PTM1盐溶液的75％(v/v)甘油溶液以获得所需细胞密度，和/或补充另外的碳源或能源以利于甲醇诱导。诱导采用含20mM PMSF和/或1.2％PTM1盐溶液的100％甲醇溶液。或者，诱导通过持续添加含73mMPMSF的4∶1的甲醇/甘油进行，并且诱导前加入PMSF至终浓度为1mM。为了制备发酵罐所用的种子培养物(seed culture)，使用1mlYYL#8-2的冷冻原液接种50ml YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖)，然后在剧烈摇动中30℃下培养2天。50ml培养物中的30ml用作第一种子培养物，用以接种大约600ml第二种子培养物。在整个发酵过程中，发酵罐中的DO水平维持在25％以上。发酵罐中的pH值在生长阶段控制在3.5，甲醇诱导阶段控制在7.0。温度在生长阶段设置为28℃，在甲醇诱导阶段设置为15～25℃。在甲醇诱导过程中，酪蛋白氨基酸溶液(20％)以20ml/h的流速持续添加，或者在甲醇诱导的前2个小时内，以泵的最大流速添加。在甲醇诱导温度为23℃时，二价免疫毒素的表达水平高于其他4批发酵。然而，其表达水平与当前表达菌株pJHW#2相近。表1总结了5批发酵的结果。
表1：各批发酵结果
1：甲醇诱导开始时，根据培养物中的甲醇浓度，添加50ml PMSF溶液(每50ml甲醇3.484g)。添加PMSF溶液结束后，每1升甲醇含12ml PTM1盐溶液的甲醇溶液被替换。
2：甲醇诱导开始时，注入15ml PMSF溶液(每15ml甲醇1.742g)。根据甲醇浓度添加甲醇溶液(20mM PMSF和12ml PTM1盐溶液/升甲醇)。
3：甲醇诱导开始时，以泵的最大流速添加10％酪蛋白氨基酸溶液。
4：以20ml/小时的泵流速持续添加20％酪蛋白氨基酸溶液。
5：以20ml/小时的泵流速持续添加15％酪蛋白氨基酸溶液。
6：未测量
在这些条件下，在42小时的甲醇诱导中，二价免疫毒素的野生型表达菌株pJHW#2的最大产量为27.5mg/L，总产量为286.0mg。诱导时间在42小时以上，该水平也不会随之提高。然而，在pJHW#2所采用的条件下，甲醇诱导后EF-2突变菌株YYL8-2的产量持续增长达94小时，尽管最初的10L培养基被甲醇和10％酪蛋白氨基酸溶液逐渐稀释成13.4L(见第5批)。第5批二价免疫毒素总量为435.5mg(32mg/L)。这要高出pJHW#2的最大产量的1.46倍。这两个菌株二价免疫毒素产量的差异反映在如图11所示的甲醇消耗率上。
实施例9：现有的二价免疫毒素的纯化方法。
巴斯德毕赤酵母上清液中含有与A-dmDT390-bisFv竞争结合阴离子交换树脂的物质。另外，若将毒素部分暴露于6.5以下的pH值环境，疏水残基一定会展开。因而采用使用Butyl-650M(TosoHaas)的疏水作用色谱步骤。该树脂优先结合单聚体A-dmDT390-bisFv而非二聚体形式，后者的生物活性大大降低。该捕捉步骤同时浓缩了巴斯德毕赤酵母糖蛋白，这些糖蛋白在SDS凝胶上显示为～40kD的扩散带，但在分子排阻色谱条件下与A-dmDT390-bisFv具有相同的流动性。该物质可通过优先结合Con A琼脂糖(Pharmacia)而除去。Superdex(Pharmacia)分子排阻步骤可除去前面捕捉步骤中未滤掉的任何A-dmDT390-bisFv二聚体。当发酵条件使得A-dmDT390-bisFv单体含量为85％时，总产率为45％。纯化A-dmDT390-bisFv的过程如下所述：
1.Butyl-650M疏水作用色谱
●柱床体积：600ml(柱直径10cm)
●流速：50～70cm/小时
●样本制备：加入固体硫酸钠和1M的Tris缓冲液(pH8.0)，至终浓度分别为0.5M和20mM。
●样本体积：通常10L
●结合缓冲液：500mM Na2SO4，1mM EDTA，20mM Tris缓冲液(pH8.0)
●洗脱缓冲液：5％甘油，1mM EDTA，20mM Tris缓冲液(pH8.0)
●过程：
○使用结合缓冲液平衡柱
○将样本加于柱上
○使用5倍柱床体积的结合缓冲液洗涤
○使用6倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱
○根据厂商说明书使柱再生
●洗脱组分体积：3600ml
2.渗滤
●膜：超过滤螺旋缠绕(Amicon spiral-wound)膜(30Kd)型号(model)：S3Y30(0.23m2)
●样本：从捕捉步骤中洗脱的组分
●渗滤缓冲液：5％甘油，1mM EDTA，20mM Tris缓冲液(pH8.0)
●用于渗滤的缓冲液体积：6倍样本体积
●压力：7psi
●终体积：大约2L
3.Poros 50HQ离子交换色谱
●柱床体积：40ml(柱直径2.6cm)
●流速：1ml/min
●样本：经渗滤的样本(通常为2L)
●结合缓冲液：5％甘油，20mM Tris缓冲液(pH8.0)
●洗脱：结合缓冲液中的0～500mM NaCl梯度(10倍的柱床体积)
●过程：
○使用结合缓冲液平衡柱
○将样本加于柱上
○使用3倍柱床体积的结合缓冲液洗涤，并开始收集每个组分20ml
○使用10倍柱床体积的0～500mM NaCl梯度洗脱
○根据厂商说明书使柱再生
●组分大小：20ml
4.Con A亲和色谱
●样本：来自Poros IEX的、含有A-dmDT390-bisFv的洗脱组分90～120ml
●柱床体积：装于2.5cm×20cm柱中的60ml树脂
●结合缓冲液：5％甘油，20mM Tris缓冲液(pH8.0)
●流速：重力作用下
●过程：
○使用结合缓冲液平衡柱
○将样本加于柱上，并开始收集每个组分10ml
○每个组分中加入0.5M EDTA至终浓度为1mM
○使用5倍柱床体积结合缓冲液洗柱
○根据厂商说明书使柱再生
5.Superdex 200prep分级凝胶过滤
●样本：来自Con A亲和步骤的、含A-dmDT390-bisFv的50ml汇集的组分
●样本制备：加入5M NaCl至终浓度为200mM
●柱床体积：970ml Superdex 200树脂，装于5cm×60cm柱中
●缓冲液：200mM NaCl，1mM EDTA，20mM Tris-Cl(pH8.0)以及5％甘油
●流速：1ml/min
●过程：
○使用结合缓冲液平衡柱
○将样本加于柱上，并开始收集每个组分20ml
○使用1倍柱床体积的缓冲液洗脱柱
○根据厂商说明书使柱再生
该方法从调节观点来看很困难，因为Con A有毒，可从柱基质中浸出。与之相比，本发明方法(见实施例16和实施例38〔Gibson：重新编号？〕)使用硼酸盐除去糖蛋白。硼酸盐与糖蛋白的vicyl羟基结合，使之带有负电荷，因而使糖蛋白与阴离子交换柱紧密结合。然而，由于rIT没有糖类基团，可被硼酸盐洗脱。
实施例10：构建表达载体pPGAP-Arg和pPGAP-His。
已经鉴别出巴斯德毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子(PGAP)，并用于在巴斯德毕赤酵母中进行异源蛋白的表达(Waterhamet al.，1997)。PGAP是强组成型启动子。据报道，葡萄糖培养的巴斯德毕赤酵母在PGAP调控下的蛋白表达水平比通常的甲醇培养的细胞利用PAOX1调控下的要高(Waterham et al.，1997；et al.，1998)。在异源蛋白表达中使用组成型启动子的缺点是它们不适于对表达宿主有毒的蛋白。既然巴斯德毕赤酵母EF-2突变体具有胞质溶胶表达DT A的抗性，这些突变体应该可以在其细胞中组成型表达基于DT或PE的免疫毒素。因而，使用PGAP在巴斯德毕赤酵母中驱动A-dmDT390-bisFv的表达，以期PGAP可提高蛋白的表达水平。
通过使用PGAP替换pBLARG-A-dmDT390-bisFv中的AOX1启动子来制备pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv构建体(图9b)。首先，使用含PGAP 5′和3′端序列的引物，通过PCR从表达载体pGAPZ A(Invitrogen)中扩增PGAP。5′和3′端引物分别加上Nhe I和Hind III。使用Nhe I和Hind III消化后，将PGAP的PCR产物插入pBLARG-A-dmDT390-bisFv中，该载体已经使用这两种限制酶切割除去了AOX1启动子。通过将来自质粒pPIC9K(Invitrogen)和pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv的DNA片段连接，制备出构建体pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv(图9c)。质粒pPIC9K通过Not I使用Klenow片段填充后，首先使用Sfu I切割，然后使用琼脂糖凝胶电泳分离这些DNA片段。分离出含卡那霉素抗性基因、HIS4基因和3′AOX1转录终止(TT)的5.1kbp的片段，并将其与质粒DNApPGAPArg-A-dmDT390-bisFv连接，后者已经使用Not 1和Sca I消化除去了3′AOX1TT和ARG4基因。
实施例11：在PGAP的调控下表达二价免疫毒素。
如同在AOX1启动子调控下表达进行的操作一样，通过使用构建体pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv转化mutEF2JC307-8来获得单拷贝克隆；通过使用pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv和pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv转化mutEF2JC303-5来获得双拷贝克隆。这次双拷贝克隆通过两步构建。首先，在筛选和蛋白表达分析之后，使用pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv转化mutEF2JC303-5。然后使用pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv转化表达完整免疫毒素水平最高的克隆。
小规模蛋白表达通过以下步骤进行：将单一菌落接种至2ml YPD，过夜生长后，细胞接种于2ml表达培养基，并使其OD600nm＝0.5，然后在28℃下培育24小时，取培养上清液分析表达免疫毒素的情况。该表达培养基与在PAOX1调控下表达免疫毒素所用的BMMYC相似，只是它不含0.5％甲醇，而是含有2％葡萄糖。SDS-PAGE电泳分析表明，在2拷贝克隆培养上清液中，所积累的完整蛋白略高于1拷贝克隆。2拷贝克隆之一(Pgap2-9)始终可产生每ml培养基10至15μg的完整蛋白。对培养上清液和提取细胞沉淀(extract cell pellet)的蛋白质印迹分析的结果，与PAOX1调控下的表达一致。
在摇瓶培养中，PGAP调控下的二价免疫毒素的产量略高于PAOX1调控下的产量。由于发酵可使细胞生长至极高密度，所以当使用发酵罐生产时，PGAP调控下的产量提高可能会更加显著。PGAP调控表达的另一个优点是生产过程简化，时间缩短。它无需在表达培养基中添加和保持一定水平的甲醇。整个生产过程大约40小时，而PAOX1调控下的表达需要72小时以上。
实施例12：酵母菌株和菌株保持
为了优化发酵条件，使用基因工程改造的巴斯德毕赤酵母菌株JW102(原名为pJHW#2)，它是为了生产二价免疫毒素而产生于宿主菌株GS115(Invitrogen，Carlsbad，CA)(Woo et al.，2002)。AOX1(醇氧化酶1)启动子在甲醇诱导过程中调控免疫毒素的表达。该基因产物由α-前原前导序列分泌。为了比较发酵罐中的生长曲线和发酵参数，使用X-33和JW103(MutS)或mutEF2JC307-8(2)，以及其他地方。
表2：本研究中所用巴斯德毕赤酵母菌株
 名称  所研究蛋白   表型
 JW102＊  分泌二价免疫毒素   His+Mut+
 JW103＊  分泌二价免疫毒素   His+MutS
 C-4  胞质溶胶表达DT的A链   His+Mut+
 X-33  宿主菌株   His+Mut+
＊JW102和JW103分别重命名自pJHW#2和pJHW#3(Woo et al.，2002)
可表达二价免疫毒素的菌株JW102遗传上非常稳定。在YPD板(1％酵母提取物，2％细菌用蛋白胨，2％葡萄糖和2％琼脂)上传代培养该菌株60代以上，该菌株仍然可以表达二价免疫毒素。将极早期分离的菌落分散于YPD液体培养基(1％酵母提取物，2％细菌用蛋白胨，2％葡萄糖)中，然后在-80℃下保存为冷冻原液。冷冻原液通过将培育2天的培养物与等体积的25％(v/v)甘油混合来制备，并将1ml这种混合物装入2ml的冷冻瓶(Cryo vial)中。
实施例13：发酵。
使用带有甲醇传感器和控制器(Raven Biotechnology Company，Canada)的BioFlo 4500发酵罐(New Brunswick Scientific Company，Esison，NJ)，其中传感器和控制器可在诱导过程中维持甲醇含量在0.15％(v/v)。该发酵罐连接有运行基于AFS-BioCommand Windows的软件(New Brunswick Scientific Company)的计算机，它可使所有参数均由程序化过程控制。基础起始发酵培养基(10升)包括2％(20g/L)酵母提取物，2％(20g/L)大豆蛋白胨(Difco)，4％(40g/L)甘油，1.34％(13.4g/L)含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮碱基，0.43％(4.3ml/L)PTM1盐溶液以及0.02％(v/v)消泡剂289(Sigma Co.)。PTM1盐溶液(Invitrogen)包括24.0mM(6g/L)蓝矾(CuSO4·5H2O)、0.534mM(80mg/L)碘化钠(NaI)、17.8mM(338.6mg/L)硫酸锰(MnSO4·5H2O)、0.827mM(200mg/L)钼酸钠(NaMoO4·2H2O)、0.323mM(20mg/L)硼酸(H3BO3)、2.1mM(500mg/L)氯化钴(CoCl2·6H2O)、147.0mM(20g/L)氯化锌(ZnCl2)、234.0mM(65.1g/L)硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、1.64mM(400mg/L)生物素、188.0mM(18.4g/L)硫酸(H2SO4)。
甘油投料阶段在接种的18h内完成，通过监测DO峰形来检测培养物中甘油被完全消耗。随后进入甘油投料阶段，期间添加75％(v/v)甘油，在7小时内添加速率从0.1g/min斜线上升至3.0g/min。甲醇诱导前添加含18ml/L(1.8％)PTM1盐溶液的75％(v/v)甘油溶液7小时，以获得所需细胞密度。持续添加含有或不含10mM PMSF(苯甲基磺酰氟)的甲醇或4∶1甲醇∶甘油(体积比)来进行诱导。通过甲醇传感器和控制器自动控制甲醇或4∶1甲醇∶甘油的添加速率，使其保持在设定点(培养物中含0.15％(v/v)甲醇)。通过每分钟在计算机接口天平(computer interfaced balance)(PG5002S，Mettler Toledo，Switzerland)上对甲醇溶液或甲醇/甘油混合溶液称重，来测量甲醇消耗速率。当在甲醇诱导过程中要添加PMSF时，就在诱导之前，添加PMSF至终浓度为1mM。在甲醇诱导过程中，以10ml/h/10L初始体积的速率持续添加酪蛋白氨基酸或酵母提取物溶液(10％，w/v)。
或者，对于EF-2突变体，诱导过程中碳源可限制为甲醇，甲醇添加速率可限制为大约0.5～0.75ml/min或者更低，并由精确泵调节(表3)。在第#53批中，甲醇通过受甲醇传感器控制的泵完全添加，保持培养物中甲醇含量在0.15％的设定点。在第#56批中，甲醇诱导过程中添加的甲醇限制在0.75ml/min。在不同的诱导时间点取上清液，其中的二价免疫毒素浓度通过考马斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶检测。为了进一步对这两批进行比较，测定从1升各上清液中经Butyl 650M HIC捕捉步骤的蛋白产量。在甲醇诱导过程中限制添加甲醇可将二价免疫毒素的分泌水平提高到50mg/L。
表3：在甲醇诱导过程中将甲醇添加速率限制为0.75ml/min可提高EF-2突变体菌株的二价免疫毒素的分泌水平。
为了制备发酵罐所用的种子培养物，使用1ml冷冻原液(-80℃，溶于25％(v/v)甘油)接种50ml YSG液体培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)大豆蛋白胨，1％(w/v)甘油)，然后于250RPM(轨道直径1.9cm)、28℃下培养2天。从50ml培养物中取30ml用作第一种子培养物，接种两个1L培养瓶中的600ml YSG液体培养基。于250rpm(轨道直径1.9cm)、28℃下培养1天后，该培养物用作第二种子培养物，接种发酵罐中的10L初始天然发酵培养基。所有参数均通过运行由AFS-BioCommand软件程序化的过程自动控制。发酵罐中的DO水平在整个发酵过程中保持在＞40％，并补充所需的O2。通过添加29％(v/v)NH4OH或40％(v/v)H3PO4，发酵罐中的pH值在生长阶段保持在3.5，在甲醇诱导阶段保持在7.0。在甲醇诱导开始前的2个小时内，pH值从3.5斜线上升至7.0。pH值的变化过程可减少杂质蛋白(75kDa和35kDa谱带)分泌到上清液中。生长温度设定在28℃，甲醇诱导温度为15～25℃。在甲醇诱导的前4小时内，诱导温度从28℃斜线下降到25～15℃。减少生物反应器的搅拌可提高单体和生物活性的免疫毒素的比例。生物反应器400rpm搅拌相比生物反应器800rpm搅拌，其单体和生物活性免疫毒素比例可提高50％(图12)。在搅拌中提供洗涤剂或其他变性剂可减少免疫毒素的聚集。在搅拌免疫毒素时包括0.01％的TWEEN可进一步减少聚集，将单体和生物活性免疫毒素比例提高至90％(图13)。培养物收获后，上清液通过离心(2,800×g，4℃下30分钟)处理。在4℃下储存过程中，加入EDTA至终浓度为5mM，以防止蛋白降解。
实施例14：测定湿细胞密度(％，w/v)以监测细胞生长。
将1ml培养物样本放入配衡的(tared)1.5毫升微量离心管中，在20,800×g、25℃下离心30分钟。使用吸量管除去上清液，使用滤纸吸干管内残留液体。称量含细胞沉淀物的管，计算湿细胞密度(％，w/v)。
实施例15：纯化。
已经开发了可调整规模的3步纯化二价免疫毒素的方法，该方法利用硼酸盐阴离子交换色谱除去宿主糖蛋白杂质。纯化过程使用1L离心上清液进行。无需采用渗析或渗滤步骤。简单地说，1L上清液与28.4g固体Na2SO4混合，加于100ml butyl-650M的柱床上，在使用200ml Na2SO4洗涤之后，使用5％甘油、20mM tris和1mM EDTA，pH8.0洗脱。600ml洗脱剂使用4.2L TE缓冲液(20mM tris，1mM EDTA，pH8.0)稀释，并加于40ml Poros 50HQ的柱床上。二价免疫毒素在25～100mM的硼酸钠缓冲液步骤中洗脱，然后糖蛋白和一些高度聚集的免疫毒素使用1M NaCl洗脱。1.2L硼酸盐洗脱剂使用3.6L TE缓冲液稀释，并加于5ml预先装好的Hi-trap Q柱床上。洗涤后，二价免疫毒素使用0～400mM NaCl梯度洗脱。
Butyl-650M疏水作用色谱(HIC)：将大约100ml Butyl-650M树脂(Tosoh Biosep LLC)装于5cm×20cm的XK柱(AmershamPharmacia Biotech)中，该柱使用含200mM Na2SO4、1mM EDTA、20mM Tris-Cl缓冲液(pH8.0)的缓冲液A平衡。将固体硫酸钠和1MTris-Cl缓冲液(pH8.0)加入1升上清液中，至终浓度分别为200mM和20mM。在装载样本前，将样本使用802槽状滤纸(＞15um粒子驻留：Whatman Inc.；Clifton，NJ，USA)过滤。流速为44cm/小时(14.4ml/min)。平衡柱之后，将1L制备的样本加于柱上，然后使用6倍柱体积的结合缓冲液A洗涤。与Butyl-650M树脂相结合的蛋白使用6倍柱体积的含5％甘油、1mM EDTA、20mM Tris-Cl缓冲液(pH8.0)的缓冲液B洗脱。将洗脱的含有免疫毒素的组分汇集以备下一步使用(体积：～600ml)。每轮操作之后，根据厂商说明书使柱再生。除了第一步在室温下进行外，所有步骤均在冷室中进行。
Poros 50HQ阴离子交换色谱(AEX)，使用硼酸钠缓冲液逐步洗脱：大约40ml Poros 50HQ树脂(PerSeptive Biosystems)装于2.6cm×20cm的XK柱(Amersham Pharmacia Biotech)中，然后将柱使用缓冲液B平衡。前面步骤中汇集的样本使用4.2L TE缓冲液(20mMtris-Cl，1mM EDTA，pH8.0)洗脱。洗脱的样本以80.2cm/小时(7.08ml/min)的流速加于柱上，该柱然后使用6倍柱体积的缓冲液B洗涤。结合的蛋白使用溶于缓冲液B中的硼酸钠25mM、50mM、75mM和100mM几步洗脱(每步中使用10倍柱体积)。将这些洗脱的组分汇集以备下一步使用。与树脂相结合的残余蛋白使用6倍柱体积的溶于缓冲液B中的1M NaCl溶液除去。每轮操作之后，柱使用0.5M NaOH溶液洗涤，然后使用不含5％甘油的缓冲液B重新平衡以备下次使用。
Hi-trap Q阴离子交换色谱：从Amersham Pharmacia Biotech购得预先填充的Hi-trap Q阴离子交换柱(5ml)。上一步中汇集的样本使用3.6L TE缓冲液稀释。样本以221.5cm/小时(7.08ml/min)的流速加于用缓冲液B平衡过的柱上。该柱使用5倍柱体积的缓冲液B洗涤。结合的免疫毒素使用溶于缓冲液B的0～400mM NaCl线性梯度洗脱(20倍柱体积)。洗涤和洗脱步骤中的流速为2ml/min，组分大小为5ml。
实施例16：测定上清液中的蛋白酶活性。
将无切口的(unnicked)CRM9(白喉毒素(7)的识别结构域中有单点突变)用作测量丝氨酸蛋白酶活性的底物，其在上清液中的终浓度为225μg/ml。上清液在28℃、250rpm(轨道直径1.9cm)的摇动下培育20h，然后在还原剂(100mM二硫苏糖醇)的存在下加于4-20％tris-甘氨酸预制的SDS-PAGE凝胶中。CRM9包含完全暴露的furin/Kex-2切割位点，该位点位于由二硫键连接的A片段(22kDa)和B片段(40kDa)之间。培养基中的蛋白酶活性通过在还原条件下无切口的CRM9的减少来测定，无切口的CRM9的谱带强度通过在考马斯染色的凝胶上进行密度测定(densitometry)来定量测定。
实施例17：SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析。
培养上清液中的蛋白在非还原性和/或还原性条件下，使用tris-甘氨酸4～20％预制凝胶(Invitrogen)进行SDS-PAGE电泳。为进行蛋白质印迹分析，将分离的蛋白通过电印迹转移至硝酸纤维素膜上。使用溶于TBST缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl和0.1％TWEEN)的5％脱脂牛奶阻断非特异性结合。针对白喉毒素的羊多克隆抗体(Thompson et al.，1995)以1∶2000稀释后用作一次抗体，碱性磷酸酶缀合的兔抗羊IgG(Roche Molecular Biochemicals)以1∶5000稀释后用作二次抗体。使用一步NBT/BCIP底物(PierceChemical Company)使免疫毒素完全可见。或者，由于二价免疫毒素包含三个(G4S)3接头，将针对(G4S)3接头的兔多克隆抗体用作一次抗体，检测完整免疫毒素及降解产物。该抗体针对氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：17)的合成肽制备。
实施例18：细胞毒性测试。
按所述方法(Neville et al.，1992)对巴斯德毕赤酵母表达的抗人抗CD3免疫毒素进行特异性细胞毒性测量实验。简单地说，将免疫毒素加于位于96孔板上不含亮氨酸的RPMI 1640培养基中的Jurkat细胞中，即人CD3∈+T细胞白血病株(5×104细胞/孔)。20小时后，供给1小时脉冲(pulse)[3H]亮氨酸。然后使用细胞采集器将细胞收集到过滤器上。加入闪烁体后，在Beckman闪烁计数器中使用标准的液体闪烁计数技术对样本进行计数。
实施例19：测定细胞存活力。
为了测定采自发酵不同时间点的培养物的细胞存活力，对Ormerod的方法进行修改(Ormerod，2000)。使用醋酸荧光素(FDA)和碘化丙啶(PI)作为细胞存活力的活体染料。巴斯德毕赤酵母吸收的FDA被细胞内酯酶转化成荧光素。如果细胞具有完整的质膜，就会保留荧光素而将PI排斥在外。简单地说，溶于PBS缓冲液的106细胞/ml的巴斯德毕赤酵母细胞悬液500μl，与50μl FDA溶液(10μg/ml)和50μl PI溶液(100μg/ml)混合。室温下培育10分钟，通过流式细胞仪分析样本的存活力。活细胞的门电极(gate)包括绿色荧光而没有红色荧光。
实施例20：二价免疫毒素浓度的定量测定。
从Amersham Pharmacia Biotech购得Superdex 20010/300GL预填充柱(尺寸1.0cm×30cm)。将该柱连接HPLC系统(GBC ScientificEquipement；Arlington Heights，IL，USA)。凝胶过滤缓冲液由90mM硫酸钠(Na2SO4)、10mM磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)和1mM EDTA(pH8.0)组成。流速为0.5ml/min，注入体积为500μl。已知浓度的纯化免疫毒素基于UV吸光度(25)用作标准样本。
对上清液或液体样本中的二价免疫毒素的定量测定，通过将考马斯染色的4-20％预制SDS凝胶的强度与已知浓度的免疫毒素标准样本的强度比较而确定。
实施例21：通过AOX1活性降低来证实巴斯德毕赤酵母表达过程中的免疫毒素毒性。
二价免疫毒素在巴斯德毕赤酵母中通过分泌途径表达。巴斯德毕赤酵母中这种分泌二价免疫毒素可显著减弱免疫毒素的毒性(Woo etal.，2002)，但是在发酵培养的甲醇诱导过程中，二价免疫毒素的表达降低了甲醇利用的代谢能力，并导致生长减缓。
在巴斯德毕赤酵母的甲醇代谢中，醇氧化酶(AOX1)催化的甲醇氧化是限速反应步骤(Veenhuis et al.，1983)，AOX1基因产物的量决定了甲醇代谢的速率。AOX1可占到利用甲醇的巴斯德毕赤酵母细胞中蛋白总量的30％。因而，甲醇诱导过程中甲醇消耗速率的量值反映出AOX1水平，并可显示出二价免疫毒素的表达如何影响巴斯德毕赤酵母中AOX1的蛋白合成和降解。为此，比较野生型宿主菌株X-33和JW102菌株在发酵罐培养中的甲醇消耗速率曲线，其中JW102菌株通过分泌途径表达二价免疫毒素。在甲醇诱导过程中使用酪蛋白氨基酸添加物的发酵条件下，X-33在25℃下甲醇消耗的最大值为1.95ml/min，并在整个甲醇诱导阶段，消耗速率一直保持在最大速率的70％以上(图11)。对于免疫毒素表达菌株JW102(Mut+)，在23℃时的甲醇最大消耗速率大约为1.10ml/min。甲醇诱导开始后7～8小时达到峰值，随后消耗速率逐渐降到最大速率的20％。甲醇诱导的前18小时内，甲醇消耗速率降至甲醇最大消耗速率的50％以下(图11)。这种低水平的甲醇消耗是与低水平的湿细胞密度增长(44小时时，JW102为2％，X-33为10.5％)相关联的(图14)。
实施例22：在甲醇诱导阶段使用PMSF和酪蛋白氨基酸或酵母提取物
发酵优化的第一步中，在甲醇诱导过程中补充PMSF和酪蛋白氨基酸对于提高发酵罐中的表达水平极为重要。甲醇诱导过程中如果缺少这两种组分，二价免疫毒素的表达水平在甲醇诱导开始后7小时达到最大值，然后开始下降。然而，如果在甲醇诱导过程中补充这两种组分，可将最佳诱导时间从甲醇诱导开始后的7～8小时延长至24～48小时。另外，表达水平提高至2倍。
为了避免使用动物来源的材料，使用酵母提取物代替酪蛋白氨基酸。这种替换导致表达水平和湿细胞密度分别有30％和45％的较大增长。在甲醇诱导过程中，通过持续添加酵母提取物，所得JW102的湿细胞密度与X-33接近(图14)。这些提高是由于甲醇消耗速率稳定保持在最大速率的80％以上(图11)。
本文所公开的最终表达方法的一个实例(见实施例41)，使用毒素抗性EF-2突变体，诱导过程中甲醇添加量限制为0.5至0.75ml/min(每10L初始培养基)而不另加碳源，诱导时间延长至163h，温度15℃，持续注入酵母提取物，搅拌速度限制为400RPM，添加消泡剂至0.07％，以及DO水平降至40％以下时补充氧气。在此条件下无需PMSF和酪蛋白氨基酸。酪蛋白氨基酸为动物产物，会影响FDA的效果。PMSF是有助于防止产物降解的蛋白酶抑制剂，它有毒，需要提供另外的证明文件以证明它不存在于最终产品中，因而这些变换有助于获得管理部门的批准。使用该方法的产量是120mg/L(见实施例41)。
实施例23：在甲醇诱导过程中使用甲醇/甘油混合添加物。
二价免疫毒素的表达水平与甲醇诱导前44小时内获得的湿细胞密度呈正相关。在低产量培养物中，所获得的湿细胞密度小于6.0％。然而，在二价免疫毒素的产量高于25mg/L的发酵批次中，在甲醇诱导前44小时内所获得的湿细胞密度(％)平均为9.26％(图14)。如果不持续添加甘油作为另外的碳源，则在甲醇诱导过程中很难获得较高的湿细胞密度。因而在甲醇诱导过程中，使用甲醇/甘油(4∶1)混合添加物支持细胞生长。
野生型菌株X-33不产生免疫毒素(图21A)，用作监控甲醇消耗和细胞生长的对照。该菌株在25℃时具有1.95ml/min的最大甲醇消耗量。在整个甲醇诱导阶段，消耗速率保持在最大速率的＞70％(图21A)。在44h的甲醇诱导过程中，湿细胞密度持续增长。DT抗性、产生免疫毒素的EF-2突变型菌株mutEF2JC307-8(2)用作另一个对照，以比较分泌免疫毒素时的甲醇消耗和细胞生长。在诱导过程中，该EF-2突变型菌株具有与野生型菌株X-33相似的甲醇消耗和湿细胞生长曲线(图21A)。在44h的甲醇诱导过程中，甲醇最大消耗速率和湿细胞收获物分别为2.2ml/min和9.17％。然而，在JW102菌株可产生免疫毒素的发酵条件下，使用EF-2突变体不会提高免疫毒素的分泌量。对于菌株JW102来说，25℃时的甲醇最大消耗速率为1.30ml/min。甲醇诱导开始后7～8小时达到高峰，此后在甲醇诱导44h时消耗速率降到最大速率的15％。在甲醇诱导的前22h内，甲醇消耗速率降至甲醇最大消耗速率的＜50％(图21B)。这种低水平的甲醇消耗量导致JW012的湿细胞密度(2.0％)比X-33(10.5％)增长缓慢(图21A和21B)。在甲醇诱导的前22h后湿细胞密度增长很少或没有增长，免疫毒素的分泌水平从15mg/L降至10mg/L。免疫毒素分解产物在用于监测产物稳定性的SDS凝胶上检测不到。
实施例24：添加酵母提取物，甲醇消耗和免疫毒素生产。
与免疫毒素的产生相关的甲醇消耗量减少和细胞生长速率变慢，可能是由于免疫毒素对巴斯德毕赤酵母的毒性作用。如果持续添加酵母提取物至生物反应器中，并且使用甲醇作为唯一碳源(图21C)，则甲醇消耗峰值低于野生型菌株和EF-2突变型菌株(图21A)，但在10h后停止下降，细胞生长在整个诱导阶段保持增长。这种增长反应与8h后培养基中缺少免疫毒素相耦合，显示了蛋白酶活性。诱导后4h即存在免疫毒素片段，一直到诱导后19h均检测不到完整免疫毒素(图22A)。如果从不同时间点收集培养基，并与纯化的免疫毒素一起培育，那么形成的免疫毒素片段的量要取决于培养基的时间长短(图22B)。例如，在诱导后49h，与较早时间点的样本相比，完整免疫毒素谱带大大减小，代表降解片段的36.5kDa的谱带显著增加。
通过添加酵母提取物所改善的甲醇利用量的减少(图21C)，其效果显然次于随着EF-2的ADP核糖基化由免疫毒素导致的蛋白合成抑制。这可由以下事实说明：可产生免疫毒素且其EF-2基因(13)被改造成毒素抗性的巴斯德毕赤酵母菌株，与野生型菌株消耗甲醇的速率相等(图21和图21图例)。在毒素敏感型菌株中，如果免疫毒素能够进入EF-2所在的胞质溶胶区室，就会发生蛋白合成抑制。两种不同的机制可产生这种效果。一种机制是翻译后易位，这种情况下，整个免疫毒素在翻译后进入Sec61易位子(16)。这将为EF-2的ADP核糖基化提供短暂的时机。当信号肽为α-交配因子时，通常会发生翻译后易位，这里正是这种情况(24)。另一机制为资料较多的质子介导的催化结构域跨内膜区室(2)易位。这在轻度酸性的高尔基区室或较强酸性的液泡中均可发生。无论哪种免疫毒素易位机制占主导，酵母提取物添加物要么干扰此步骤，要么干扰随后的EF-2ADP核糖基化，后者直接进行或者通过减弱易位的毒素A链的催化活性进行。
实施例25：向带有酵母提取物添加物的甲醇添加物中加入甘油。
当甲醇为唯一碳源时所观察到的蛋白酶活性可能是从死亡或受伤细胞中泄漏所致。当使用4∶1甲醇∶甘油添加物(图21D)代替纯甲醇(图21C)时，培养基中的免疫毒素水平在44h时上升至20mg/L。此时在SDS凝胶中只检测到微量的培养基中的蛋白的降解产物(图23，最右侧一组)。没有酵母提取物的甲醇-甘油混合添加物不能维持甲醇消耗或细胞质量的持续增长，最终免疫毒素产量达15mg/L(图21E)。
尽管持续添加酵母提取物可较好地改善甲醇代谢降低的情况，但免疫毒素产量较低，出现较多的蛋白酶解(图21C和22)。这种较多的蛋白酶解可通过补充4∶1甲醇∶甘油混合添加物形式的碳来逆转(图21D和图23，23℃组)，这样可提高免疫毒素产量至20mg/L。据报道，在巴斯德毕赤酵母甲醇投料培养过程中，有最理想的最大特定生长速率，当超过此速率时反而会抑制异源蛋白的产生(27)。以最适速率添加甲醇，并且以最大甘油生长速率的20％的速率添加甘油，可使异源蛋白的产量提高50％(27)。这种增长可能由甲醛和H2O2的代谢增加，以及过氧化氢酶和AOX的活性提高所致。在分泌型蛋白的情况下，这些代谢变化还可减少分泌的蛋白酶的量，以及减少泄漏蛋白酶解酶的死亡或受伤细胞的数量。
实施例26：低温与二价免疫毒素的分泌。
通过增强在ER中的蛋白折叠和/或通过减弱培养基蛋白酶活性，低温可提高巴斯德毕赤酵母中异源蛋白表达的产量(9)。在15℃下44h时，甲醛消耗减少25％，然而细胞生长保持不变(图15C)。免疫毒素产量在44h时提高50％(30±0mg/L，n＝3)在67h时提高几乎100％(37±2.9mg/L，n＝3)。免疫毒素分泌量提高多数发生于20～15℃之间。
在17.5℃观察到最高表达水平(图15A)，但经过免疫毒素的3步纯化步骤所获得的最终产量在15℃时最高(图15B)，在44和67h时分别为平均13.8±1mg/L(n＝3)和16.0±1mg/L(n＝3)。在15℃时产生的纯化免疫毒素具有完全功能，这通过在蛋白合成分析中测定特异性T细胞的细胞毒性来确定，该实验中三个单独的生产批次的IC50值为1.2(±0.1)×10-13M，与之相比，摇瓶培养的三个批次平均为2×10-13M。
从生物反应器上清液(全部持续加入10mM PMSF添加物)中在SDS凝胶上观察到的降解的免疫毒素谱带的量，从23℃时的中等水平减少到15℃时的不可检测水平(图23)。采用突变型白喉毒素(CRM9)底物对丝氨酸Kex-2样蛋白酶进行敏感性测试，蛋白酶活性在15℃下67h时不可检测，但是当不加入PMSF时在67h时可检测到活性(图24)。在15℃下不论是否加入PMSF，凝胶谱带和免疫毒素产量均相同。
来自甲醇-甘油混合添加物加上酵母提取物培养基的15℃生物反应器样本使用流式细胞仪分析细胞存活力，具有低水平的死亡细胞：甘油投料阶段0.7±0.22％(置信限99％)；甘油-甲醇混合添加物，在22h时为1.2±0.58％(置信限99％)，在44h时为1.7±0.61％(置信限99％)，在67h时为1.1±0.51％(置信限99％)(死亡细胞比例从一个发酵批次中测定)。在甲醇诱导的所有时间点，显示细胞内酯酶活性的活细胞占细胞总数的96％以上。
使诱导温度从23～25℃降低到15℃，可将免疫毒素水平进一步提高到44h时的30mg/L和67h时的37mg/L(图21F)。低诱导温度与诱导过程中低且恒定的死亡细胞水平(＜2.0％)相联系，并且减弱了蛋白酶对生物反应器内免疫毒素的活性，尽管通过灵敏的实验可检测到少量蛋白酶活性(图23和24)。这些结果与利用限制温度(12℃)投料技术的研究相一致(9)。在限制温度投料技术中，与30℃下限制甲醇投料工艺相比，44h时死亡细胞从9％减少到＜1％。死亡细胞的减少与降解产物(脂肪酶)的显著减少和最后时间点完整产物的2倍增加相联系。这些变化有助于避免在高细胞密度下缺乏氧气。在限制温度投料技术中，在67h时AOX活性提高2倍以上。
低诱导温度下，通过减慢总蛋白合成速率，平衡通过分泌途径的免疫毒素输入和输出，还可导致免疫毒素分泌增加。在异源蛋白的表达和分泌中，每种蛋白似乎都有最佳分泌水平。超过最佳水平的表达(过表达)可减少分泌蛋白的产量(1，11，13，15)。二价免疫毒素因为其多结构域的结构，还需要更长的正确折叠处理时间，它在大肠杆菌中表达后经过体外重新折叠具有低活性(25)。在从23℃变为15℃时，甲醇消耗速率只减少了25％，在44h时细胞生长速率保持不变。实施例27：巴斯德毕赤酵母生产二价免疫毒素的天然培养基。
为了在发酵罐中获得合理范围的二价免疫毒素表达水平，需要在初始发酵培养基中使用天然培养基。在初始发酵批次中，当使用标准合成培养基时，观察到发酵罐中二价免疫毒素的产量极低。因此开发了基于大豆蛋白胨和酵母提取物的培养基，包括4％甘油，2％酵母提取物，2％大豆蛋白胨，1.34％含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮碱基，0.43％PTM1溶液，以及0.01％消泡剂289。
实施例28：Mut+与MutS表型
测试来自于巴斯德毕赤酵母GS115(Mut+)和KM71(MutS)的不同Mut(甲醇利用)表型菌株，比较它们在发酵罐中的二价免疫毒素表达水平。在发酵罐中，MutS表型菌株具有优势，如易于控制诱导温度，无需供给纯氧，以及对高浓度甲醇的抗性。尽管这两种不同表型菌株在试管培养时表达水平没有差异，但在发酵罐中Mut+菌株的表达水平要高出MutS菌株的5～7倍。
实施例29：pH变换工艺减少了上清液中的污染蛋白。
摇瓶培养和发酵罐培养在表达二价免疫毒素方面有较大差别。在摇瓶培养中，可使用新鲜诱导培养基替换原培养基，可除去在生长阶段细胞裂解产生的细胞膜片段、DNA和蛋白酶，以及巴斯德毕赤酵母分泌的蛋白。然而，这些分子在发酵的整个过程中不断积累，在纯化步骤中常会出现问题。
为了在发酵罐中减少此类问题，采用pH变换工艺。巴斯德毕赤酵母可在pH3～7的范围内正常生长。在甘油分批阶段和甘油补料分批阶段，巴斯德毕赤酵母在低pH值(如pH3.5)下培养，并且在pH7.0下诱导以产生二价免疫毒素。pH变换工艺使上清液中充满大量二价免疫毒素，因为在低pH值下巴斯德毕赤酵母分泌蛋白的量显著减少，而二价免疫毒素的表达水平却不受影响。
实施例30：使用葡萄糖严格控制AOX1启动子。
一般来说，为了在宿主细胞中获得毒素蛋白，需要严格的基因控制。表达二价免疫毒素对巴斯德毕赤酵母产生毒害。由于在使用甘油作为碳源的情况下AOX1启动子不能严格控制基因表达，所以在甲醇诱导之前即可在考马斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶上观察到二价免疫毒素。为进行严格的基因控制，将甘油补料分批阶段替换为葡萄糖补料分批阶段，因为葡萄糖抑制AOX1驱动的基因表达(Tschopp et al.，1987)。然而，在补料分批阶段中使用葡萄糖替换甘油不会改变二价免疫毒素的最终表达水平。在补料分批阶段使用甘油是因为葡萄糖在高浓度下溶解要花费一定时间。当与甘油补料分批阶段结合时，pH变换工艺可阻止在甘油补料分批过程中在考马斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶上出现二价免疫毒素。
实施例31：表达二价免疫毒素的最适pH值
为了测定表达二价免疫毒素的最适pH值，试管培养的表达菌株JW102在pH3.5到8.0的范围内诱导24小时，使用考马斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶和蛋白质印迹分析比较上清液中的二价免疫毒素。使用柠檬酸钠缓冲液(pH3.5～5.5)、bis-tris缓冲液(pH6.0～7.0)和tris缓冲液(pH7.5～8.0)维持培养物在设定pH值。同时，在甲醇诱导结束时用前述方法(Woo et al.，2002)测定菌落形成单位。pH6.0以下时，使用蛋白质印迹检测不到二价免疫毒素。尽管在pH6到8范围内，蛋白质印迹显示它们的表达水平相近，但使用考马斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶表明pH7.0是表达二价免疫毒素的最适pH水平。在pH3.5至7.0范围内，巴斯德毕赤酵母具有相似的菌落形成单位，但在pH7.4以上时菌落形成单位急剧下降。既然pH7.4是最适pH值范围的上限，于是又在发酵罐中测定了pH6.7时的表达水平。然而，pH6.7和7.4时的表达水平没有差异。
实施例32：最适发酵批次的再现性和细胞存活力。
在最适发酵条件下，二价免疫毒素的表达水平在甲醇诱导67小时时增加到40mg/L(图16)。甲醇诱导44小时和67小时时上清液中的二价免疫毒素表达水平，以及经3步纯化步骤获得的最终产量均可再现。如表4所示，在最适条件下的3个独立的发酵批次中，所获二价免疫毒素水平极为相似。更重要的是，它们之间纯化二价免疫毒素的最终产量极为接近，说明产生的上清液中二价免疫毒素的品质相似。在最适发酵条件下，在甲醇诱导阶段的细胞存活力经流式细胞仪测定保持在95％以上。
表4：最适发酵条件1和纯化2的再现性
1最适条件：诱导温度15℃；以8.95ml/hr持续添加10％酵母提取物补料；甲醇诱导使用甲醇/甘油(4∶1)混合补料。
2二价免疫毒素的纯化中，使用3步的步骤(Woo and Neville，2003)。
实施例33：诱导时间和聚集体形成之间的关系。
在诱导过程中，免疫毒素聚集体在上清液中积累。为了测定诱导时间和聚集体形成之间的关系，在甲醇诱导的22、44和67小时时，通过Superdex 200凝胶过滤获取分级样本(fractionated sample)，然后在SDS-PAGE凝胶上分析分级样本。22、44和67小时的样本分别含50.0、60.0和66.7％的免疫毒素二聚体及二聚体以上的寡聚体形式。这些聚集体形式的免疫毒素对Jurkat细胞的特异性毒素只有单体免疫毒素的10％。
另外，免疫毒素聚集体的积累显著减弱上清液的生物活性。然而，通过在先前研究中开发的butyl 650M捕捉步骤可恢复其生物活性。该结果说明有可能一部分免疫毒素聚集体是可逆的。
使用浓度在0.01％以上的消泡剂可减少聚集体形成。在开发出3步纯化步骤之前用作捕捉步骤的亲硫吸附中，这些免疫毒素聚集体结合得不是很好。在发酵优化的最初阶段，所用消泡剂的浓度为能够控制发酵罐中过多泡沫的最小浓度。然而，当在初始发酵培养基中使用0.005％的消泡剂289时，在第一个捕捉步骤中就损失了超过50％的二价免疫毒素。在初始发酵培养基中使用浓度超过0.01％的消泡剂289，这对于在第一个捕捉步骤中获得超过90％的合理产量至关重要。实施例34：通过比较SDS-PAGE电泳和细胞毒性测试进行蛋白定量。
使用预先制备的已知浓度的免疫毒素标准样本，通过SDS-PAGE电泳定量测定免疫毒素浓度(Woo et al.，2002)。待测样本在非还原条件或还原条件下，进行使用tris-甘氨酸4～20％预制凝胶(Invitrogen)的SDS-PAGE电泳。
按所述方法(Neville et al.，1992)进行纯化的抗人抗CD3免疫毒素的特异性细胞毒性测试。简单地说，将免疫毒素加于位于96孔板上不含亮氨酸的PRMI 1640培养基中的Jurkat细胞中，即人CD3∈+T细胞白血病株(5×104细胞/孔)。20小时后，供给1小时脉冲[3H]亮氨酸。然后使用Skatron采集器将细胞收集到过滤器上。加入闪烁体后，在Beckman闪烁计数器中使用标准的LSC技术对样本进行计数。
实施例35：Butyl 650M疏水作用色谱(Butyl 650M HIC)。
如图17所示，对上清液中的免疫毒素来说，Butyl 650M HIC是有效的捕捉步骤。然而，在此步骤中糖蛋白与免疫毒素一起被纯化。在这些糖蛋白之中，通过过碘酸-希夫氏(periodic acid Schiff)染色，大约45kDa的糖蛋白种类(图17箭头所示)影响了纯免疫毒素的分离。通过诸如凝胶过滤和阴离子交换色谱等常规色谱法，这些糖蛋白无法与免疫毒素分离，说明这些45kDa的糖蛋白种类以二聚体形式存在，并且具有相似的等电点。因此，这些45kDa的糖蛋白与免疫毒素在大小和等电点，以及疏水性方面非常相似。
评估了各种遵循GMP(优质生产规范)的疏水性树脂。在这些树脂之中，Butyl 650M显示出具有最好的免疫毒素结合和洗脱曲线。本发明中可使用其他疏水性树脂。还发现200mM的硫酸钠是将免疫毒素结合到butyl 650M树脂的适当浓度。
在发酵批次结束时，发酵罐培养物通常具有约30％的湿细胞密度。在大规模生产中，上清液通过需要对高细胞密度培养物进行3倍稀释的持续离心获得。稀释的样本中的免疫毒素的处理过程与200mM硫酸钠下有效结合至Butyl 650M树脂的上清液中的免疫毒素相同。实施例36：使用硼酸钠缓冲液分步洗脱的Poros 50HQ阴离子交换色谱。
通过采用硼酸盐阴离子交换色谱，可成功地将免疫毒素与巴斯德毕赤酵母糖蛋白分离(图18)。通过洗脱来自前一步骤中的样本，可使免疫毒素结合至阴离子树脂上，简化了纯化过程。在使用50mM、75mM和100mM溶于缓冲液B的硼酸钠洗脱的组分中(图18中泳道9、10、11)，多数免疫毒素以单体形式存在。汇集这3个组分以备下一步使用。
为了除去来自上一步的样本中的糖蛋白种类，采用硼酸钠阴离子交换色谱，这是因为硼酸钠通过结合至糖蛋白的糖残基上而使糖蛋白的负电荷增加。免疫毒素在pH8.0下结合至阴离子交换树脂上(Woo etal.，2002)。设计预备实验以优化硼酸钠存在下的免疫毒素结合条件。使用缓冲液B进行渗析的样本等分与不同体积的200mM溶于缓冲液B的硼酸钠混合，以获得预定的硼酸钠浓度。然后将制备的样本加于Poros 50HQ阴离子柱(40ml)上，该柱使用含有相应浓度硼酸钠的缓冲液B平衡。在100mM硼酸钠浓度下，免疫毒素不与Poros 50HQ阴离子树脂结合，但是多数糖蛋白仍然结合。在50mM以下的硼酸钠浓度下，免疫毒素与Poros 50HQ阴离子树脂结合。
在将免疫毒素结合至阴离子交换柱之后，进一步使用硼酸钠分析分步洗脱条件。首先，将使用缓冲液B渗析的样本结合至阴离子柱，然后在浓度逐渐增加的硼酸钠(100、120、140、200mM)和1M NaCl的步骤中洗脱。结合的免疫毒素主要在100mM硼酸钠下洗脱，但是这些洗脱的组分还包括很多在下一步中无法分离的45kDa糖蛋白。多数糖蛋白在1M NaCl下洗脱。如第一次实验所述装入相同的样本之后，结合的免疫毒素在50、75和100mM硼酸钠和1M NaCl步骤中洗脱。多数结合的免疫毒素在75mM硼酸钠下洗脱。然而，对应于21kDa的蛋白条带包含于使用50mM硼酸钠洗脱的组分之中。结合于柱上之后，结合的免疫毒素在溶于缓冲液B的25、50、75和100mM硼酸钠和1M NaCl步骤中洗脱(图18)。通过使用25mM硼酸钠缓冲液洗涤，减少了对应于21kDa的蛋白条带的量。
实施例37：与苯硼酸亲和色谱对比。
为了比较分离曲线，采用苯硼酸亲和色谱法。来自butyl 650M HIC捕捉步骤的洗脱剂使用低离子强度缓冲液(10mM HEPES，0.25mMEDTA和20mM MgCl2，pH8.2)渗析以备苯硼酸亲和色谱使用。渗析的样本加于5ml柱床体积的苯硼酸琼脂糖柱(Sigma Co.)上，使用同一缓冲液洗涤，然后使用溶于相同缓冲液的0～100mM硼酸钠梯度或0～50mM山梨糖醇梯度(20倍柱床体积)洗脱结合的蛋白。在低离子强度的结合条件下，糖蛋白和免疫毒素均可结合。糖蛋白和免疫毒素不能通过苯硼酸亲和色谱分离。糖蛋白和免疫毒素被0～100mM硼酸钠梯度或0～50mM山梨糖醇梯度共洗脱。
实施例38：Q阴离子交换色谱。
使用Q阴离子交换色谱来浓缩从50HQ阴离子交换色谱获得的洗脱样本。在低于50mM的硼酸钠浓度下，免疫毒素结合至阴离子交换树脂上。因此，从前一步中汇集的样本使用3倍样本体积的TE缓冲液(20mM Tris-Cl和1mM EDTA，pH8.0)稀释，以使稀释的样本中的硼酸钠在20mM以下。如预期效果一样，免疫毒素有效结合至Q阴离子交换柱上。结合的免疫毒素使用0～400mM NaCl梯度(20倍柱体积)洗脱。汇集免疫毒素组分，然后通过SDS-PAGE  电泳和蛋白合成实验评价最终制备物的产量、纯度和毒性。
实施例39：纯化过程的蛋白产量、重复性，纯化免疫毒素的纯度和功能。
表4总结了从3批3步纯化批次中获得的免疫毒素产率，方法是从在较为相似的发酵条件下进行的、具有相似免疫毒素表达水平的3个发酵批次中，在甲醇诱导44小时时取上清液。这批纯化的平均产率为52.8％。通过使用3步纯化步骤，从1升上清液中获得大约16mg纯化的物质。根据发酵批次过程中诱导时间的不同，起始上清液中含有不同水平的免疫毒素聚集体和单体免疫毒素。在这些免疫毒素聚集体之中，有一部分在Butyl 650M HIC步骤中逆转化为单体形式的免疫毒素。通过凝胶过滤和随后的SDS-PAGE电泳分析对上清液进行分级表明，上清液中含有超过50％的免疫毒素聚集体。然而，经3步纯化步骤，免疫毒素的终产率为52.8％，表明在纯化过程中一部分聚集体离解为单体免疫毒素。
将纯化过程应用于上清液免疫毒素含量相近的3个独立的发酵批次中，对其进行比较后证实该过程的产率有很好的重复性(表5)。
纯化免疫毒素的纯度通过分析凝胶过滤来评估。最终制备物中的免疫毒素显示出对应于单体形式的免疫毒素的单峰(图19组A)。对最终制备物的纯度分析证实3步纯化产生的免疫毒素的纯度为～98.0％(图19组B)。
为了研究3步纯化步骤对免疫毒素生物活性的影响，对最终制备物进行特异性T细胞细胞毒性的蛋白合成实验。最终制备物中的免疫毒素估算浓度与免疫毒素标准样本浓度一致。
表5：从巴斯德毕赤酵母发酵罐培养物中纯化免疫毒素的比较＊。
＊IT，免疫毒素；acc.，累积的；HIC，疏水作用色谱；AEX，阴离子交换色谱。上清液从3个发酵批次中甲醇诱导44小时时获得。
实施例40：总结
补充甘油降低了免疫毒素的蛋白酶解，提高了免疫毒素产量，而补充酵母提取物主要促进甲醇利用和细胞生长。补充甘油和补充酵母提取物协同作用，提高了免疫毒素的产量，这种协同在15℃时增强。
本研究证实在使用甘油补充碳源和持续补充酵母提取物之间存在协同作用，该协同作用减弱了免疫毒素的毒性效果，提高了产量，特别是在15℃时。该项可靠的工艺具有37mg/L的产量，比先前报导的毒素抗性CHO细胞表达系统高出7倍(25)。
实施例41
最终方法使用毒素抗性EF-2突变体，诱导过程中甲醇添加量限制为0.5至0.75ml/min(每10L初始培养基)而不另加碳源，诱导时间延长至163h，温度15℃，持续注入酵母提取物，搅拌速度限制为400RPM，添加消泡剂至0.07％，以及DO水平降至40％以下时补充氧气。在此条件下无需PMSF和酪蛋白氨基酸。另外，通过降低搅拌速度减小剪切力，以及添加消泡剂可显著减少免疫毒素聚集体。结果，纯化产率从64％提高至76％。通过该优化的方法，在甲醇诱导163小时时的免疫毒素分泌水平为120mg/L。表6总结了通过解决这些主要问题，提高了多少免疫毒素分泌和纯化产量。基因优化使IT分泌从不可检测水平提高到10mg/L。通过使用DT抗性菌株和采用低温，我们将免疫毒素分泌量提高到35mg/L。而且，采用甲醇限量添加提高了免疫毒素分泌量以及纯化产率。最后，延长诱导时间以及添加消泡剂显著提高了免疫毒素分泌量和纯化产率。消泡剂是购自Kabo Chemical公司(Cheyennne，WY 82007，USA)的KFOTM 673。该方法可用于在毒素敏感的巴斯德毕赤酵母中生产其他重组免疫毒素和其他有毒蛋白。
表6：通过解决主要问题，免疫毒素分泌量和纯化产率的提高
在本申请中，引用了多种出版物。这些出版物按如下方式全文引用。所提及的出版物通过引用的方式全文纳入本说明书中，以更加详细地叙述本发明所属技术领域的状况。
对于本领域技术人员显而易见的是，只要不背离本发明的范围和精神，可对本发明进行各种修改和变动。通过考虑本发明所公开的说明书和实施情况，本发明的其他实施方案对本领域技术人员来说是显而易见的。本说明书和实施例应仅看作示例性用途，本发明真正的范围和精神在所附的权利要求书中说明。
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Claims (28)

1.一种在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达免疫毒素的方法，包括：
a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养可表达所述免疫毒素的巴斯德毕赤酵母，其中所述免疫毒素包含白喉毒素部分；
b)对所述巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中所述甲醇诱导的温度在17.5℃以下，但不低于12.5℃，
其中所述甲醇诱导是每10L初始培养基添加0.5至0.75ml/min的限量甲醇。
2.一种在巴斯德毕赤酵母中表达免疫毒素融合蛋白的方法，包括：
a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养可表达所述免疫毒素融合蛋白的巴斯德毕赤酵母，其中所述免疫毒素包含白喉毒素部分；
b)对所述巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中所述甲醇诱导的温度在17.5℃以下，但不低于12℃，
其中所述甲醇诱导是每10L初始培养基添加0.5至0.75ml/min的限量甲醇。
3.一种在巴斯德毕赤酵母中表达包括白喉毒素部分的免疫毒素的方法，包括：
a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养可表达所述免疫毒素的巴斯德毕赤酵母；
b)对所述巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中所述甲醇诱导的温度在16.0℃以下，但不低于14.0℃，
其中所述甲醇诱导是每10L初始培养基添加0.5至0.75ml/min的限量甲醇。
4.一种在巴斯德毕赤酵母中表达包括截短型白喉毒素部分的免疫毒素的方法，包括：
a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养可表达所述免疫毒素的巴斯德毕赤酵母；
b)对所述巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中所述甲醇诱导的温度在17.5℃以下，但不低于12℃，
其中所述甲醇诱导是每10L初始培养基添加0.5至0.75ml/min的限量甲醇。
5.根据权利要求4的方法，其中所述免疫毒素进一步包括CD3抗体部分。
6.根据权利要求5的方法，其中所述免疫毒素包括A-dmDT390-bisFv(G4S)。
7.一种在巴斯德毕赤酵母中表达包括白喉毒素部分的免疫毒素的方法，包括：
a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养可表达所述免疫毒素的巴斯德毕赤酵母，其中所述巴斯德毕赤酵母包括在编码EF-2的氨基酸序列中具有突变，所述突变是Arg置换EF-2的Gly711；
b)对所述巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中所述甲醇诱导的温度在17.5℃以下，但不低于12℃，
其中所述甲醇诱导是每10L初始培养基添加0.5至0.75ml/min的限量甲醇。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其中所述甲醇诱导是含甲醇和甘油的补料。
9.根据权利要求8的方法，其中在所述含甲醇和甘油的补料中，甲醇和甘油体积比为4:1。
10.根据权利要求1-7任一项的方法，其中所述蛋白的酶消化产物是大豆蛋白的酶消化产物。
11.根据权利要求1-7任一项的方法，进一步包括将巴斯德毕赤酵母与苯甲烷磺酰氟和氨基酸源相接触。
12.根据权利要求11的方法，其中将巴斯德毕赤酵母与苯甲烷磺酰氟和氨基酸源相接触至少2小时。
13.根据权利要求11的方法，其中苯甲烷磺酰氟溶于体积比4:1甲醇甘油诱导补料中，浓度不超过10mM。
14.根据权利要求11的方法，其中所述氨基酸源为酵母提取物。
15.根据权利要求1的方法，其中所述温度选自：17.5、17.0、16.5、16.0、15.5、15.0、14.5、14.0、13.5、13.0和12.5℃。
16.根据权利要求2和4-7任一项的方法，其中所述温度选自：17.5、17.0、16.5、16.0、15.5、15.0、14.5、14.0、13.5、13.0、12.5和12.0℃。
17.根据权利要求3的方法，其中所述温度选自：16.0、15.5、15.0、14.5和14.0℃。
18.根据权利要求15或17的方法，其中所述温度为15℃。
19.根据权利要求16的方法，其中所述温度为15℃。
20.根据权利要求1-7任一项的方法，其中所述生长培养基的组成为4％甘油，2％酵母提取物，2％大豆蛋白的酶消化产物，1.34％含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮源，以及0.43％PTM1溶液。
21.根据权利要求10的方法，其中所述生长培养基进一步包括消泡剂。
22.根据权利要求21的方法，其中所述消泡剂的浓度为0.01％至0.07％。
23.根据权利要求22的方法，其中所述生长培养基的组成为4％甘油，2％酵母提取物，2％大豆蛋白的酶消化产物，1.34％含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮源，0.43％PTM1溶液以及0.02％消泡剂。
24.根据权利要求1-7任一项的方法，其中在生长培养基中溶解氧的浓度保持在40％至65％的数值。
25.根据权利要求1-7任一项的方法，其中生长步骤的pH值为3.5，甲醇诱导步骤的pH值为7.0。
26.根据权利要求1-7任一项的方法，其中甲醇诱导步骤进行22至288小时之间。
27.一种在巴斯德毕赤酵母中表达免疫毒素的方法，包括：
a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养可表达免疫毒素的巴斯德毕赤酵母；
b)对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中所述甲醇诱导包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始体积的限量甲醇，其中诱导进行的温度在17.5℃以下，但不低于12℃，补充消泡剂至0.07％，搅拌速度保持在400RPM，且其中诱导步骤进行22至288小时之间。
28.一种在巴斯德毕赤酵母中表达免疫毒素的方法，包括：
a)在生长培养基中培养可表达免疫毒素的巴斯德毕赤酵母，所述生长培养基包括4％甘油，2％酵母提取物，2％大豆蛋白的酶消化产物，1.34％含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮源，以及0.43％PTM1溶液，其中生长期间pH值为3.5，且生长培养基中溶解氧浓度保持在40％至65％的数值；
b)对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中所述甲醇诱导包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始体积的限量甲醇，其中诱导进行的温度为15℃，pH值7.0，补充消泡剂0.02％，搅拌速度保持在400RPM，且诱导步骤进行163小时。
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