CN102533736A - 提取堆肥宏基因组dna的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取堆肥宏基因组DNA的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用。本发明的方法包括如下步骤：(1)将堆肥样品在DNA提取液中进行物理裂解；(2)加入溶菌酶；(3)加入蛋白酶K；(4)加入SDS水溶液；(5)离心收集上清液；(6)在步骤(5)的沉淀中加入DNA提取液和SDS水溶液，离心收集上清液；(7)将步骤(5)和步骤(6)的上清液合并；(8)酚-氯仿-异戊醇抽提；(9)将步骤(8)的上清液和异丙醇混匀，收集沉淀，即为堆肥宏基因组DNA。本发明对于研究不同发酵时间的堆肥样本中的细菌种类(特别是反硝化细菌种类)具有很高的应用价值。本发明为堆肥的研究和应用，以及微生物分子生态学研究提供了有效的技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取堆肥宏基因组DNA的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用。
背景技术
堆肥本身含有较多的抑制因子，且堆肥过程中产生大量腐植酸，这些物质会对总DNA(宏基因组DNA)的提取产生强烈的影响，很难提取到可以作为PCR扩增模板的总DNA。
反硝化细菌(denitrifying bacteria)，是硝化和反硝化研究中非常重要的一种细菌。传统的反硝化细菌筛选方法是使用培养基进行培养接种，单培养周期就要14天，整个筛选过程一般需要两周以上，耗时太长，且准确性很差。而且环境中的微生物99％是不可培养的，传统的筛选方法大大限制了人们对土壤微生物资源及其基因资源的研究与利用。
对反硝化细菌的研究可有助于堆肥过程中反硝化菌的衍替情况进行研究，进一步了解堆肥过程中硝化和反硝化的过程，有助于更深入地了解堆肥发生的机理，从而更好地实现对其技术的控制和优化。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取堆肥宏基因组DNA的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用。
本发明提供的提取堆肥宏基因组DNA的方法，包括如下步骤：
(1)将堆肥样品和DNA提取液置于离心管中进行物理裂解；所述物理裂解包括2-4次如下步骤：液氮处理10-20min(如10-15min或15-20min)，然后63-67℃(如63-65℃或65-67℃)水浴融化；
(2)在完成步骤(1)的离心管中加入溶菌酶，36-38℃(如36-37℃或37-38℃)水浴25-35min(如25-30min或30-35min)；
(3)在完成步骤(2)的离心管中加入蛋白酶K，36-38℃(如36-37℃或37-38℃)水浴25-35min(如25-30min或30-35min)；
(4)在完成步骤(3)的离心管中加入18-22g/100ml(如18-20g/100ml或20-22g/100ml)的SDS水溶液，63-67℃(如63-65℃或65-67℃)水浴100-140min(如100-120min或120-140min)；
(5)将完成步骤(4)的离心管18-22℃(如18-20℃或20-22℃)、12000-14000g(如12000-13000g或13000-14000g)离心13-17min(如13-15min或15-17min)，收集上清液；
(6)在完成步骤(5)的离心管中加入DNA提取液和18-22g/100ml(如18-20g/100ml或20-22g/100ml)的SDS水溶液，63-67℃(如63-65℃或65-67℃)水浴8-12min(如8-10min或10-12min)，然后18-22℃(如18-20℃或20-22℃)、12000-14000g(如12000-13000g或13000-14000g)离心13-17min(如13-15min或15-17min)，收集上清液；
(7)将步骤(5)的上清液和步骤(6)的上清液合并；
(8)将步骤(7)的上清液和酚-氯仿-异戊醇混合液等体积混合，混匀后18-22℃(如18-20℃或20-22℃)、12000-14000g(如12000-13000g或13000-14000g)离心8-12min(如8-10min或10-12min)，收集上清液；所述酚-氯仿-异戊醇混合液是将25体积份苯酚、24体积份氯仿和1体积份异戊醇混合得到的；
(9)将步骤(8)的上清液和异丙醇混匀，18-22℃(如18-20℃或20-22℃)沉淀50-70min(如50-60min或60-70min)，收集沉淀，即为堆肥宏基因组DNA；步骤(8)的上清液和异丙醇的体积比为1∶0.5-0.7(1∶0.5-0.6或1∶0.6-0.7)。
所述步骤(1)中，所述物理裂解可包括3次如下步骤：液氮处理15min，然后65℃水浴融化。
所述步骤(2)中，所述36-38℃水浴25-35min具体可为37℃水浴30min。
所述步骤(3)中，所述36-38℃水浴25-35min具体可为37℃水浴30min。
所述步骤(4)中，所述SDS水溶液的浓度具体可为20g/100ml，所述63-67℃水浴100-140min具体可为65℃水浴120min。
所述步骤(5)中，所述18-22℃、12000-14000g离心13-17min具体可为20℃、13000g离心15min。
所述步骤(6)中，所述SDS水溶液的浓度具体可为20g/100ml，所述63-67℃水浴8-12min具体可为65℃水浴10min，所述18-22℃、12000-14000g离心13-17min具体可为20℃、13000g离心15min。
所述步骤(8)中，所述18-22℃、12000-14000g离心8-12min具体可为20℃、13000g离心10min。
所述步骤(9)中，所述18-22℃沉淀50-70min具体可为20℃沉淀60min，步骤(8)的上清液和异丙醇的体积比具体可为1∶0.6。
所述步骤(1)中，所述堆肥样品的质量具体可为4g，所述DNA提取液的体积为10-15ml。
所述步骤(2)中，所述溶菌酶的加入量为1.6-2.4mg(如1.6-2mg或2-2.4mg)。
所述步骤(3)中，所述蛋白酶K的加入量为0.8-1.2mg(如0.8-1mg或1-1.2mg)。
所述步骤(4)中，所述SDS水溶液的加入量为2-3ml(如2-2.5ml或2.5-3ml)。
所述步骤(6)中，所述DNA提取液的加入量为4-5ml(如4-4.5ml或4.5-5ml)，所述SDS水溶液的加入量为0.3-0.7ml(如0.3-0.5ml或0.5-0.7ml)。
所述步骤(1)中，所述堆肥样品的质量具体可为4g，所述DNA提取液的体积具体可为13.5ml。
所述步骤(2)中，所述溶菌酶的加入量具体可为2mg。
所述步骤(3)中，所述蛋白酶K的加入量具体可为1mg。
所述步骤(4)中，所述SDS水溶液的加入量具体可为2.5ml。
所述步骤(6)中，所述DNA提取液的加入量具体可为4.5ml，所述SDS水溶液的加入量具体可为0.5ml。
所述DNA提取液的具体配方如下：含0.1M Tris-HCl、0.1M EDTA、1.64g/100ml的Na3PO4、8.775g/100ml的NaCl和1g/100ml的CTAB，其余为水。所述DNA提取液的pH具体可为8.0。
本发明提供的方法可以高效提取堆肥样本的宏基因组DNA，且用时较短(4小时内)。采用本发明的方法从堆肥样本中提取得到的宏基因组DNA可以作为PCR扩增的模板进行有效扩增。
本发明还保护所述方法在鉴定堆肥样本中的反硝化细菌中的应用。
本发明同时保护一种鉴定堆肥样本中的反硝化细菌的方法，包括如下步骤：
以堆肥样本的宏基因组DNA为模板，用序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物并测序，根据测序结果鉴定堆肥样本中的反硝化细菌；所述堆肥样本的宏基因组DNA是采用上述任一方法提取得到的。
每50μL所述PCR扩增的反应体系中含有10-100pmol(10-50pmol或50-100pmol)序列表的序列1所示的DNA片段、10-100pmol(10-50pmol或50-100pmol)序列表的序列2所示的DNA片段。
每50μL所述PCR扩增的反应体系具体包括2μL所述模板、10-100pmol(10-50pmol或50-100pmol)序列表的序列1所示的DNA片段、10-100pmol(10-50pmol或50-100pmol)序列表的序列2所示的DNA片段、4μL dNTP、2.5U Taq酶、5μg BSA，其余为1×PCR buffer。
所述PCR扩增的程序具体可为：94℃预变性4min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。
以上任一所述堆肥可为畜禽粪便堆肥，具体可为鸡粪、猪粪等畜禽粪便与锯末混合发酵得到的堆肥。
本发明对于研究不同发酵时间的堆肥样本中的细菌种类(特别是反硝化细菌种类)具有很高的应用价值。本发明为堆肥的研究和应用，以及微生物分子生态学研究提供了有效的技术支撑。
附图说明
图1为鸡粪堆肥提取的宏基因组DNA的电泳照片。
图2为鸡粪堆肥提取的宏基因组DNA纯化回收后的电泳照片。
图3为以鸡粪堆肥提取的宏基因组DNA为模板的PCR扩增产物的电泳照片。
图4为猪粪堆肥提取的宏基因组DNA的电泳照片。
图5为猪粪堆肥提取的宏基因组DNA纯化回收后的电泳照片。
图6为以猪粪堆肥提取的宏基因组DNA为模板的PCR扩增产物的电泳照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。蛋白酶K：Sigma公司，产品号为P6556。溶菌酶：Sigma公司，产品号为L6875。
DNA提取液(100ml体系)：含0.1M Tris-HCl(pH8.0)、0.1M EDTA(pH8.0)、1.64g/100ml的Na3PO4、8.775g/100ml的NaCl和1g/100ml的CTAB，其余为水。
实施例1、堆肥宏基因组DNA的提取及其在鉴定反硝化细菌中的应用
一、鸡粪堆肥的制作
将25kg鸡粪、12.3kg锯末与13kg水混合，该混合物的C/N为25-30、水分含量为55-60％，将该混合物室温(23℃左右)发酵20天。
鸡粪取自中国农业大学鸡场，锯末取自北京市海淀区永丰木器厂，物料性质见表1。
表1 堆肥原料的基本性质
分别于发酵第1、4、7、11、16、20天取样，进行后续试验。
二、堆肥宏基因组DNA的提取
1、称取步骤一制备的鸡粪堆肥约4g，置于50ml离心管内。
2、在步骤1的离心管中加入13.5ml DNA提取液，混合均匀后进行物理裂解(重复三次如下操作：液氮处理15min，65℃水浴融化)。
3、待步骤2的离心管内液体稍冷后加入20μl溶菌酶(100mg/ml)，37℃水浴30min，每隔一段时间(5min左右)上下颠倒使其混合。
4、在步骤3的离心管中加入100μl蛋白酶K(10mg/ml)，37℃水浴30min，每隔一段时间(5min左右)上下颠倒使其混合。
5、在步骤4的离心管中加入2.5ml 20g/100ml的SDS水溶液，65℃水浴120min，期间每隔15分钟颠倒数次。
6、将步骤5的离心管离心(20℃、13000g、15min)并收集上清液。
7、向步骤5的离心管(剩余沉淀)中加入4.5ml DNA提取液和0.5ml 20g/100ml的SDS水溶液，用玻璃棒搅匀，65℃水浴10min，离心(20℃、13000g、15min)并收集上清液。
8、将步骤6的上清液和步骤7的上清液合并。
9、将步骤8的上清液与等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液(苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1)混合，上下颠倒以保证抽提完全，离心(20℃、13000g、10min)并收集上清液。
10、向步骤9的上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，20℃沉淀60min，吸弃上清。
11、用70％(体积比)乙醇水溶液洗涤步骤10的沉淀，然后超净工作台上吹干，然后用200μl TE缓冲液溶解沉淀，即为含鸡粪堆肥宏基因组DNA的溶液。
含鸡粪堆肥宏基因组DNA的溶液的0.8％琼脂糖凝胶电泳图见图1(泳道1至6依次为发酵第1、4、7、11、16、20天的样本)。
三、堆肥宏基因组DNA的回收
将步骤二得到的含鸡粪堆肥宏基因组DNA的溶液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，回收18-23kb的DNA片段。
回收的DNA片段的0.8％琼脂糖凝胶电泳图见图2(泳道1至6依次为发酵第1、4、7、11、16、20天的样本)。步骤二提取的鸡粪堆肥宏基因组DNA在电泳图上显示清晰集中的条带。
四、PCR鉴定反硝化细菌
以步骤三回收的DNA片段为模板，用nosZ-F和nosZ1622R组成的引物对(针对反硝化细菌的兼并引物对)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
nosZ-F(序列1)：5’-CG(C/T)TGT TC(A/C)TCG ACA GCC AG-3’；
nosZ1622R(序列2)：5’-CGC(G/A)A(C/G)GGC AA(G/C)AAG GT(G/C)CG-3’。
50μL PCR扩增体系中含有2μL模板、50pmol nosZ-F1(各条引物均50pmol)、50pmol nosZ1622R(各条引物均50pmol)、4μL dNTP、2.5U Taq酶、5μg BSA，其余为1×PCR buffer。
PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。
部分PCR扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳图见图3。结果表明，步骤二提取的鸡粪堆肥宏基因组DNA可以作为PCR扩增的模板，进行有效的扩增。
依次进行步骤一至步骤四，即可用于堆肥样本中反硝化细菌的鉴定。
部分PCR扩增产物的测序结果见序列表的序列3(与GENBANK ACCESSIONNO.AB089829的部分片段相同)和序列4(与GENBANK ACCESSION NO.AB089832的部分片段相同)，均为反硝化细菌的特异序列。
实施例2、堆肥宏基因组DNA的提取及其在鉴定反硝化细菌中的应用
一、鸡粪堆肥的制作
同实施例一的步骤1。
二、堆肥宏基因组DNA的提取
1、称取步骤一制备的鸡粪堆肥约4g，置于50ml离心管内。
2、在步骤1的离心管中加入10ml DNA提取液，混合均匀后进行物理裂解(重复2次如下操作：液氮处理10min，63℃水浴融化)。
3、待步骤2的离心管内液体稍冷后加入20μl溶菌酶(80mg/ml)，36℃水浴25min，每隔一段时间(5min左右)上下颠倒使其混合。
4、在步骤3的离心管中加入100μl蛋白酶K(8mg/ml)，36℃水浴25min，每隔一段时间(5min左右)上下颠倒使其混合。
5、在步骤4的离心管中加入2ml 18g/100ml的SDS水溶液，63℃水浴100min，期间每隔15分钟颠倒数次。
6、将步骤5的离心管离心(18℃、12000g、13min)并收集上清液。
7、向步骤5的离心管(剩余沉淀)中加入4ml DNA提取液和0.3ml 18g/100ml的SDS水溶液，用玻璃棒搅匀，63℃水浴8min，离心(18℃、12000g、13min)并收集上清液。
8、将步骤6的上清液和步骤7的上清液合并。
9、将步骤8的上清液与等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液(苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1)混合，上下颠倒以保证抽提完全，离心(18℃、12000g、8min)并收集上清液。
10、向步骤9的上清液中加入0.5倍体积的异丙醇，18℃沉淀50min，吸弃上清。
11、用70％(体积比)乙醇水溶液洗涤步骤10的沉淀，然后超净工作台上吹干，然后用200μl TE缓冲液溶解沉淀，即为含鸡粪堆肥宏基因组DNA的溶液。
三、堆肥宏基因组DNA的回收
同实施例1的步骤三。步骤二提取的鸡粪堆肥宏基因组DNA在电泳图上显示清晰集中的条带。
四、PCR鉴定反硝化细菌
50μL PCR扩增体系中含有2μL模板、10pmol nosZ-F1(各条引物均10pmol)、10pmol nosZ1622R(各条引物均10pmol)、4μL dNTP、2.5U Taq酶、5μg BSA，其余为1×PCR buffer。
其它均同实施例1的步骤四。
结果表明，步骤二提取的鸡粪堆肥宏基因组DNA可以作为PCR扩增的模板，进行有效的扩增。
实施例3、堆肥宏基因组DNA的提取及其在鉴定反硝化细菌中的应用
一、猪粪堆肥的制作
将25kg猪粪和3.1kg锯末混合，该混合物的C/N为25-30、水分含量为55-60％，将该混合物室温(23℃左右)发酵20天。
新鲜猪粪取自北京市上庄养猪场，锯末取自北京市海淀区永丰木器厂，物料性质见表2。
表2 堆肥原料的基本性质
分别于发酵第1、4、7、11、16、20天取样，进行后续试验。
二、堆肥宏基因组DNA的提取
1、称取步骤一制备的猪粪堆肥约4g，置于50ml离心管内。
2、在步骤1的离心管中加入15ml DNA提取液，混合均匀后进行物理裂解(重复4次如下操作：液氮处理20min，67℃水浴融化)。
3、待步骤2的离心管内液体稍冷后加入20μl溶菌酶(120mg/ml)，38℃水浴35min，每隔一段时间(5min左右)上下颠倒使其混合。
4、在步骤3的离心管中加入100μl蛋白酶K(12mg/ml)，38℃水浴35min，每隔一段时间(5min左右)上下颠倒使其混合。
5、在步骤4的离心管中加入3ml 22g/100ml的SDS水溶液，67℃水浴140min，期间每隔15分钟颠倒数次。
6、将步骤5的离心管离心(22℃、14000g、17min)并收集上清液。
7、向步骤5的离心管(剩余沉淀)中加入5ml DNA提取液和0.7ml 22g/100ml的SDS水溶液，用玻璃棒搅匀，67℃水浴12min，离心(22℃、14000g、17min)并收集上清液。
8、将步骤6的上清液和步骤7的上清液合并。
9、将步骤8的上清液与等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液(苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1)混合，上下颠倒以保证抽提完全，离心(22℃、14000g、12min)并收集上清液。
10、向步骤9的上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，22℃沉淀70min，吸弃上清。
11、用70％(体积比)乙醇水溶液洗涤步骤10的沉淀，然后超净工作台上吹干，然后用200μl TE缓冲液溶解沉淀，即为含猪粪堆肥宏基因组DNA的溶液。
含猪粪堆肥宏基因组DNA的溶液的0.8％琼脂糖凝胶电泳图见图4(泳道1至6依次为发酵第1、4、7、11、16、20天的样本)。
三、堆肥宏基因组DNA的回收
同实施例1的步骤三。回收的DNA片段的0.8％琼脂糖凝胶电泳图见图5(泳道1至6依次为发酵第1、4、7、11、16、20天的样本)。步骤二提取的猪粪堆肥宏基因组DNA在电泳图上显示清晰集中的条带。
四、PCR鉴定反硝化细菌
50μL PCR扩增体系中含有2μL模板、100pmol nosZ-F1(各条引物均10pmol)、100pmol nosZ1622R(各条引物均10pmol)、4μL dNTP、2.5U Taq酶、5μg BSA，其余为1×PCR buffer。
其它均同实施例1的步骤四。
部分PCR扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳图见图6。结果表明，步骤二提取的猪粪堆肥宏基因组DNA可以作为PCR扩增的模板，进行有效的扩增。
Claims (6)
1.一种提取堆肥宏基因组DNA的方法，包括如下步骤：
(1)将堆肥样品和DNA提取液置于离心管中进行物理裂解；所述物理裂解包括2-4次如下步骤：液氮处理10-20min，然后63-67℃水浴融化；
(2)在完成步骤(1)的离心管中加入溶菌酶，36-38℃水浴25-35min；
(3)在完成步骤(2)的离心管中加入蛋白酶K，36-38℃水浴25-35min；
(4)在完成步骤(3)的离心管中加入18-22g/100ml的SDS水溶液，63-67℃水浴100-140min；
(5)将完成步骤(4)的离心管18-22℃、12000-14000g离心13-17min，收集上清液；
(6)在完成步骤(5)的离心管中加入DNA提取液和18-22g/100ml的SDS水溶液，63-67℃水浴8-12min，然后18-22℃、12000-14000g离心13-17min，收集上清液；
(7)将步骤(5)的上清液和步骤(6)的上清液合并；
(8)将步骤(7)的上清液和酚-氯仿-异戊醇混合液等体积混合，混匀后18-22℃、12000-14000g离心8-12min，收集上清液；所述酚-氯仿-异戊醇混合液是将25体积份苯酚、24体积份氯仿和1体积份异戊醇混合得到的；
(9)将步骤(8)的上清液和异丙醇混匀，18-22℃沉淀50-70min，收集沉淀，即为堆肥宏基因组DNA；步骤(8)的上清液和异丙醇的体积比为1∶0.5-0.7。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，所述物理裂解包括3次如下步骤：液氮处理15min，然后65℃水浴融化；
所述步骤(2)中，所述36-38℃水浴25-35min为37℃水浴30min；
所述步骤(3)中，所述36-38℃水浴25-35min为37℃水浴30min；
所述步骤(4)中，所述SDS水溶液的浓度为20g/100ml，所述63-67℃水浴100-140min为65℃水浴120min；
所述步骤(5)中，所述18-22℃、12000-14000g离心13-17min为20℃、13000g离心15min；
所述步骤(6)中，所述SDS水溶液的浓度为20g/100ml，所述63-67℃水浴8-12min为65℃水浴10min，所述18-22℃、12000-14000g离心13-17min为20℃、13000g离心15min；
所述步骤(8)中，所述18-22℃、12000-14000g离心8-12min为20℃、13000g离心10min；
所述步骤(9)中，所述18-22℃沉淀50-70min为20℃沉淀60min，步骤(8)的上清液和异丙醇的体积比为1∶0.6。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，所述堆肥样品的质量为4g，所述DNA提取液的体积为10-15ml；
所述步骤(2)中，所述溶菌酶的加入量为1.6-2.4mg；
所述步骤(3)中，所述蛋白酶K的加入量为0.8-1.2mg；
所述步骤(4)中，所述SDS水溶液的加入量为2-3ml；
所述步骤(6)中，所述DNA提取液的加入量为4-5ml，所述SDS水溶液的加入量为0.3-0.7ml。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，所述堆肥样品的质量为4g，所述DNA提取液的体积为13.5ml；
所述步骤(2)中，所述溶菌酶的加入量为2mg；
所述步骤(3)中，所述蛋白酶K的加入量为1mg；
所述步骤(4)中，所述SDS水溶液的加入量为2.5ml；
所述步骤(6)中，所述DNA提取液的加入量为4.5ml，所述SDS水溶液的加入量为0.5ml。
5.权利要求1至4中任一所述方法在鉴定堆肥样本中的反硝化细菌中的应用。
6.一种鉴定堆肥样本中的反硝化细菌的方法，包括如下步骤：以权利要求1至4中任一所述方法提取得到的堆肥样本的宏基因组DNA为模板，用序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物并测序，根据测序结果鉴定堆肥样本中的反硝化细菌。
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