CN102533590A - 低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌及分离培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌及分离培养方法，一种低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)浅黄聚磷CGMCC No.5280，其具有在低温好氧条件下去除污水中磷的能力。实验结果表明：尽管受到低温环境的明显抑制，投加本发明的一种低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)浅黄聚磷CGMCCNo.5280在低温下，特别是在8-12℃的条件下，对磷去除有明显的强化作用，磷去除率提高了10％，优于一级A的出水标准(水温≤12℃时，一级A标准的控制指标为0.5mg/L)。

Description

低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌及分离培养方法
技术领域
本发明属于污水处理领域，涉及一株具有低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌及分离培养方法。
背景技术
低温对生物处理能力产生重大影响的原因是由于温度的降低影响了微生物的生长及代谢。聚磷菌虽是低温耐冷菌，但在温度下降过程中，聚磷菌的释磷和吸磷速率也受到影响，，从而导致污水处理厂冬季出水水质下降。因此亟需一种在低温条件下能强化去除污水中磷的菌株。
发明内容
本发明的目的是克服现有菌株低温脱磷效果不佳的不足，提供一种去除污水中磷的枯草芽孢杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种去除污水中磷的枯草芽孢杆菌的分离培养方法。
本发明的第三个目的是提供一种去除污水中磷的枯草芽孢杆菌的用途。
一种低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)浅黄聚磷CGMCCNo.5280，其具有在低温好氧条件下去除污水中磷的能力。
一种去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)浅黄聚磷CGMCC No.5280在低温好氧条件下去除污水中磷的用途。
低温优选为8-12℃。
低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌的的分离培养方法，包括如下步骤：
(1)将富磷培养液放入小试SBR反应器中，将污水处理厂污泥接种所述富磷培养液中，在8～12℃，连续培养20天，运行周期为6小时，其中包括厌氧搅拌2.5小时，好氧2.5小时，静置0.5小时，排上清液及补充新的富磷培养液共0.5小时；运行期间保持污泥浓度为3000mg/L；
(2)取10mL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和20～30粒灭菌玻璃珠的250mL锥形瓶中，振荡10～30min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置20～40min，取1mL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10-2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10-8为止；
(3)选取梯度为10-5～10-8的菌悬液，分别取1mL接种于富磷固体培养基，每个稀释度做3个平行样，编号；10℃在有氧的条件下保湿培养2～3周；
(4)从步骤(3)中的富磷固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在富磷固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3-4次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，单一，大小相似即为单菌落，命名为浅黄聚磷，经鉴定为低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
所述富磷培养液为由下述组分组成：CH3COONa·3H2O 3.32g、KH2PO4 43.75mg、CaCl2·2H2O 25.68mg、KNO3 485.94mg、MgSO4·7H2O 91.26mg、5mL Tris缓冲液和2mL微量元素；加蒸馏水至1000mL，调节pH为7.2；
所述微量元素溶液的组成为：EDTA 5g、FeSO4·7H2O 5g、CuSO4·5H2O 1.6g、MnCl2·4H2O 5g、(NH4)6Mo7O2·4H2O 50mg、H3BO3 50mg、KI 10mg和CoCl2·6H2O 50mg加蒸馏水至1000mL。
所述富磷固体培养基为由下述组分组成：CH3COONa·3H2O 3.32g、KH2PO4 43.75mg、CaCl2·2H2O 25.68mg、KNO3 485.94mg、MgSO4·7H2O 91.26mg、5mL Tris缓冲液和2mL微量元素，琼脂20g，加蒸馏水至1000mL，调节pH为7.2；
所述微量元素溶液的组成为：EDTA 5g、FeSO4·7H2O 5g、CuSO4·5H2O 1.6g、MnCl2·4H2O 5g、(NH4)6Mo7O2·4H2O 50mg、H3BO3 50mg、KI 10mg和CoCl2·6H2O 50mg加蒸馏水至1000mL。
实验结果表明：尽管受到低温环境的明显抑制，投加本发明的一种低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)浅黄聚磷CGMCC No.5280在低温下，特别是在8-12℃的条件下，对磷去除有明显的强化作用，磷去除率提高了10％，优于一级A的出水标准(水温≤12℃时，一级A标准的控制指标为0.5mg/L)。
附图说明
图1为低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)浅黄聚磷CGMCCNo.5280的驯化分离培养流程图。
图2为浅黄聚磷去除磷的试验。
图3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)浅黄聚磷细菌鉴定方法流程。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌的分离培养方法，包括如下步骤：
(1)将富磷培养液放入小试SBR反应器中，将天津纪庄子污水处理厂曝气池的污泥接种所述富磷培养液中，在10℃，连续培养20天，运行周期为6小时，其中包括厌氧搅拌2.5小时，好氧2.5小时，静置0.5小时，排上清液及补充新的富磷培养液共0.5小时；运行期间保持污泥浓度为3000mg/L；
(2)取10mL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和30粒灭菌玻璃珠的250mL锥形瓶中，振荡20min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置30min，取1mL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10-2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10-8为止；
(3)选取梯度为10-5～10-8的菌悬液，分别取1mL接种于富磷固体培养基，每个稀释度做3个平行样，编号；10℃在有氧的条件下保湿培养3周；
(4)从步骤(3)中的富磷固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在富磷固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离4次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，单一，大小相似即为单菌落，命名为浅黄聚磷，经鉴定为低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
实施例2
富磷培养液为由下述组分组成：
CH3COONa·3H2O 3.32g、KH2PO4 43.75mg、CaCl2·2H2O 25.68mg、KNO3 485.94mg、MgSO4·7H2O 91.26mg、5mL Tris缓冲液和2mL微量元素；加蒸馏水至1000mL，调节pH为7.2；
所述微量元素溶液的组成为：EDTA 5g、FeSO4·7H2O 5g、CuSO4·5H2O 1.6g、MnCl2·4H2O 5g、(NH4)6Mo7O2·4H2O 50mg、H3BO3 50mg、KI 10mg和CoCl2·6H2O 50mg加蒸馏水至1000mL。
实施例3
富磷固体培养基为由下述组分组成：
CH3COONa·3H2O 3.32g、KH2PO4 43.75mg、CaCl2·2H2O 25.68mg、KNO3 485.94mg、MgSO4·7H2O 91.26mg、5mL Tris缓冲液和2mL微量元素，琼脂20g，加蒸馏水至1000mL，调节pH为7.2；
所述微量元素溶液的组成为：EDTA 5g、FeSO4·7H2O 5g、CuSO4·5H2O 1.6g、MnCl2·4H2O 5g、(NH4)6Mo7O2·4H2O 50mg、H3BO3 50mg、KI 10mg和CoCl2·6H2O 50mg加蒸馏水至1000mL。
实施例4
本发明的去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，具有以下微生物学特性：
1.形态学特性
在显微镜下观察，为杆状，长1.6μm，宽0.35μm；在富磷固体培养基上形成透明菌落。
2.培养学特性
在10℃下，在富磷固体培养基中培养时，本发明的去除污水中磷的枯草芽孢杆菌具有以下特性。
表面干燥，边缘整齐，个体微小扁平，菌体透明。
3.生理特性
好氧条件下去除污水中磷的革兰氏阴性细菌，接触酶阴性、甲基红试验阴性、水解淀粉、液化明胶、不产生吲哚、生长pH值为6～8，生长温度5～30℃。
  革兰氏   接触酶   甲基红   淀粉水解   明胶试验   吲哚试验   pH   温度
  G-   -   -   +   +   -   6～8   5～30
本发明细菌的16s序列鉴定
16SrDNA是细菌类原核生物在漫长的进化过程中十分保守的序列，在现代微生物的分类学中扮演着重要的角色，作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子，用16S rDNA进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
用16s序列进行细菌鉴定按图3进行。
图3中的牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加蒸馏水至1000mL，pH 7.0～7.2
LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL。
本发明测得的16s序列如下所示：
ACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGACGAGGAGCTTGCTCCTCTGATTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCCTGCAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATCCATTTTACTTCATGGTGAAATGTTGAAAGGCGCTTTCGCGCCACTGCAGGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTACGTTAGGAAATGAACGTACCTTGACGGTACCTTATTAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAATCTCGCGGCTCAACCGCGAGCGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGATAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTGTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCAGTGACCGCTCTAGAGATAGAGTTTTCCCTTCGGGGACATTGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGTCGCAAACTCGCGAGAGCAAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACTGTTTTGGGGCAAGCCGCCGAAGGTGGGATATTAAGATTGGG
根据上述微生物学特性，本发明的菌株命名为浅黄聚磷，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已于2011年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5280，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，并已存活。
实施例5
浅黄聚磷对污水中磷的降解效果
在1L的烧杯中，加入500mL培养液(初始磷浓度为10mg/L)，加入适量的浅黄除磷菌，保持pH为7.2，测定6小时其对磷的降解情况，结果如图2所示。
由图2可以看出，经6小时的降解，溶液中磷浓度为0.4mg/L，磷基本去除，去除率为96.0％，证明本发明中的浅黄除磷对磷有良好的去除能力。
实施例6
低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌的分离培养方法，包括如下步骤：
(1)将富磷培养液放入小试SBR反应器中，将天津纪庄子污水处理厂曝气池的污泥接种所述富磷培养液中，在8℃，连续培养20天，运行周期为6小时，其中包括厌氧搅拌2.5小时，好氧2.5小时，静置0.5小时，排上清液及补充新的富磷培养液共0.5小时；运行期间保持污泥浓度为3000mg/L；
(2)取10mL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和30粒灭菌玻璃珠的250mL锥形瓶中，振荡30min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置40min，取1mL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10-2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10-8为止；
(3)选取梯度为10-5～10-8的菌悬液，分别取1mL接种于富磷固体培养基，每个稀释度做3个平行样，编号；10℃在有氧的条件下保湿培养2周；
(4)从步骤(3)中的富磷固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在富磷固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，单一，大小相似即为单菌落，命名为浅黄聚磷，经鉴定为低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
实施例7
低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌的分离培养方法，包括如下步骤：
(1)将富磷培养液放入小试SBR反应器中，将天津纪庄子污水处理厂曝气池的污泥接种所述富磷培养液中，在12℃，连续培养20天，运行周期为6小时，其中包括厌氧搅拌2.5小时，好氧2.5小时，静置0.5小时，排上清液及补充新的富磷培养液共0.5小时；运行期间保持污泥浓度为3000mg/L；
(2)取10mL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和20粒灭菌玻璃珠的250mL锥形瓶中，振荡10min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置20min，取1mL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10-2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10-8为止；
(3)选取梯度为10-5～10-8的菌悬液，分别取1mL接种于富磷固体培养基，每个稀释度做3个平行样，编号；10℃在有氧的条件下保湿培养3周；
(4)从步骤(3)中的富磷固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在富磷固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离4次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，单一，大小相似即为单菌落，命名为浅黄聚磷，经鉴定为低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
实验证明，实施例6和实施例7低温下去除污水中磷的的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的分离培养方法分离培养的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)也有很好的去除磷的效果，去除率分别为95.4％和95.3％。

Claims (6)

1.一种低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)浅黄聚磷CGMCC No.5280，其具有在低温好氧条件下去除污水中磷的能力。
2.权利要求1的一种去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)浅黄聚磷CGMCCNo.5280在低温好氧条件下去除污水中磷的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征是所述低温为8-12℃。
4.权利要求1的低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌的的分离培养方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将富磷培养液放入小试SBR反应器中，将污水处理厂污泥接种所述富磷培养液中，在8～12℃，连续培养20天，运行周期为6小时，其中包括厌氧搅拌2.5小时，好氧2.5小时，静置0.5小时，排上清液及补充新的富磷培养液共0.5小时；运行期间保持污泥浓度为3000mg/L；
(2)取10mL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和20～30粒灭菌玻璃珠的250mL锥形瓶中，振荡10～30min，使细菌细胞充分释放到上清液中；静置20～40min，取1mL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10-2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10-8为止；
(3)选取梯度为10-5～10-8的菌悬液，分别取1mL接种于富磷固体培养基，每个稀释度做3个平行样，编号；10℃在有氧的条件下保湿培养2～3周；
(4)从步骤(3)中的富磷固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在富磷固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3-4次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，单一，大小相似即为单菌落，命名为浅黄聚磷，经鉴定为低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
5.根据权利要求4所述的低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌的的分离培养方法，其特征是所述富磷培养液为由下述组分组成：CH3COONa·3H2O 3.32g、KH2PO4 43.75mg、CaCl2·2H2O25.68mg、KNO3 485.94mg、MgSO4·7H2O 91.26mg、5mL Tris缓冲液和2mL微量元素；加蒸馏水至1000mL，调节pH为7.2；
所述微量元素溶液的组成为：EDTA 5g、FeSO4·7H2O 5g、CuSO4·5H2O 1.6g、MnCl2·4H2O5g、(NH4)6Mo7O2·4H2O 50mg、H3BO3 50mg、KI 10mg和CoCl2·6H2O 50mg加蒸馏水至1000mL。
6.根据权利要求4所述的低温下去除污水中磷的枯草芽孢杆菌的的分离培养方法，其特征是所述富磷固体培养基为由下述组分组成：CH3COONa·3H2O 3.32g、KH2PO4 43.75mg、CaCl2·2H2O 25.68mg、KNO3 485.94mg、MgSO4·7H2O 91.26mg、5mL Tris缓冲液和2mL微量元素，琼脂20g，加蒸馏水至1000mL，调节pH为7.2；
所述微量元素溶液的组成为：EDTA 5g、FeSO4·7H2O 5g、CuSO4·5H2O 1.6g、MnCl2·4H2O 5g、(NH4)6Mo7O2·4H2O 50mg、H3BO3 50mg、KI 10mg和CoCl2·6H2O 50mg加蒸馏水至1000mL。 
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