CN102512712B - 具有梯度结构的丝素蛋白多层功能膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种梯度结构的丝素多层功能膜及其制备方法；利用具有纳米孔的丝素蛋白膜作为阻隔层，控制丝素蛋白的结晶形态和孔结构调节其对结缔组织的阻隔作用和营养物质的交换；利用高强度的丝素蛋白纺织物/磷酸钙复合材料作为中间层提供引导骨再生膜的力学强度和尺寸稳定性；利用丝素蛋白构筑多孔层，调节多孔层的降解行为、细胞亲和性、提供细胞外基质和骨再生的生长空间。采用交联处理增加不同层之间的整合性。该多层功能膜具有良好的骨再生能力，且其降解速率和力学强度与骨再生速率相匹配。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及应用于引导骨再生技术的具有梯度结构的丝素蛋白多层功能膜及其制备方法。
背景技术
组织再生技术已成为当前生物医学领域的研究前沿。细胞外基质在再生过程中起到支撑组织稳定、保护细胞和负载刺激、激发细胞功能的生物因子等作用。由此可见，细胞外基质的设计和构建是完成组织再生技术的前提和关键。不仅如此，细胞外基质与细胞的作用位点、作用形式也决定了细胞的生长行为和组织的功能。由于骨骼结构和功能相对简单，骨再生技术已成组织再生技术的先行者，获得了极大关注。引导骨再生技术(guided bone regeneration，GBR)是将再生膜覆盖在骨缺损区域，利用膜的屏障作用阻止结缔组织和上皮细胞向缺损区域内长入，同时在膜下形成一个空间，允许成骨细胞优先迁移、生长，达到骨再生、修复的目的的一种方法。通过引导骨组织再生来修复大段骨缺损已被一些研究证明是行之有效的手段。
作为引导骨再生技术的关键，引导骨再生膜(guided bone regenerationmembrane，GBRM)应具有：(1)良好的生物相容性；(2)适当的降解性能，材料被吸收后避免二次手术，减轻病患痛苦与降低治疗费用；(3)足够的力学强度稳定性，维持再生区域的尺寸稳定和保护新生的再生组织；(4)阻隔和通透性，阻止结缔组织和上皮细胞的侵入，但应允许营养物质的进入和代谢废物的排除，维持再生区域的平衡；(5)与生物因子和细胞有良好的亲和性等。均匀结构的单层膜材料无法满足上述再生技术对膜材料的要求。为此，人们将目光转向非均匀膜和多层膜。但仍然无法在GBRM发生降解的过程中实现骨再生并完成骨组织的重建。再生技术中调节材料的降解速率与力学强度的稳定已成为一个至关重要的问题。
用于构建GBRM的膜材料主要有不可降解材料和可生物降解材料。前者如聚四氟乙烯和钛金属网等，因需要二次手术、与周围组织整合性弱和细胞亲和性差等因素限制了其应用；后者如聚羟基丙酸(也称聚乳酸，PLA)、壳聚糖和胶原等，具有良好的细胞相容性和生物降解性而受到广泛地研究和关注。但是由于成膜方法简单等因素造成结构单一、力学强度不高，而且它们的降解速率较快，胶原经过交联处理虽可提高其尺寸稳定性和力学强度，但是有些交联剂具有细胞毒性或与组织的整合性差。还有学者开发了天然橡胶和聚酰胺等再生膜，但这些材料在化学组成和结构方面与天然骨组织中的胶原相差较大。
丝素蛋白具有高力学强度、良好的生物相容性、抗原反应低、来源丰富、价格低廉等优点而广泛应用于生物医学领域。通过控制结晶形态、微结构甚至制备工艺等措施都可以调节丝素蛋白的降解速率，使其在超过1年的时间内不丧失力学强度(与实现完全骨再生修复需要1年左右的时间相匹配)，2年内被完全吸收，也保证了GBR的尺寸和形状稳定，有利于组织再生。由此可见，丝素蛋白是非常适合用作引导骨再生膜材料。此外，丝素蛋白具有良好的磷灰石沉积能力。在引导骨再生膜中加入磷酸钙不仅提供骨矿化时需要的磷和钙元素，还可能会诱导成骨，增加与成骨细胞的亲和性。邵正中等人(一种全丝素蛋白复合材料及其制备方法，中国发明专利，申请号：200710171825)采用定向排列的脱胶蚕茧丝以作为增强层，再用高浓度丝素蛋白水溶液进行浇铸成膜的方法，获得了一种高性能的全丝素蛋白复合材料，但仍然是单层致密膜。
因此，引导骨再生膜若满足引导骨再生技术的要求，必须在力学强度、降解速率和再生速率之间达到一个理想的平衡，并为细胞的生长提供一个适当的细胞外微环境。采用具有不同微结构和功能的多层结构的薄膜可以满足上述要求，实现引导骨再生。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服上述存在的不足而提出了一种具有梯度结构的丝素蛋白多层功能膜及其制备方法，该方法制备工艺条件简单，所制备的多层功能膜具有良好的力学性能，并为细胞的生长提供一个适当的细胞外微环境。
本发明的技术方案为：一种具有梯度结构的丝素蛋白多层功能膜，其特征在于该多层功能膜由阻隔层、中间层和多孔层组成；其中，阻隔层为含有纳米孔的丝素薄膜，中间层为表面涂有磷酸钙的丝素蛋白纺织物，多孔层为可降解多孔丝素蛋白支架。
所述的磷酸钙为磷灰石、磷酸八钙、磷酸氢钙或无定形磷酸钙中的一种或它们的组合。
本发明还提供了上述具有梯度结构的丝素蛋白多层功能膜的制备方法，其具体步骤如下：
A)采用交替浸渍法在丝素纺织物表面涂覆磷酸钙涂层：将丝素纺织物浸入浓度为0.01mol·L-1～1.00mol·L-1的钙源溶液中浸泡0.5h～3h后取出，用蒸馏水浸洗后，再将其浸入浓度为0.01mol·L-1～1mol·L-1的磷源溶液中浸泡0.5h～3h后取出；如此重复交替浸渍5～60次，清洗干燥后形成磷酸钙-丝素蛋白纺织物复合膜即中间层，其中控制钙源和磷源溶液的温度均为5℃～60℃；
B)将可溶性聚合物-丝素蛋白混合溶液浇铸在磷酸钙-丝素蛋白纺织物复合膜表面上，在5℃～60℃干燥成膜后，再放入真空干燥箱干燥24h～72h，然后再放入醇中浸泡处理后，最后溶解去除可溶性聚合物即可获得含有中间层和阻隔层的双层膜；
C)在双层膜的中间层上浇铸丝素蛋白溶液，用冷冻干燥后在阻隔层-中间层双层膜上构建多孔膜；再将膜置于京尼平(Genipin)交联反应，洗涤干燥后得具有梯度结构的丝素蛋白多层功能膜。
优选步骤A)所述的钙源溶液为乙酸钙、硝酸钙或氯化钙溶液；所述的磷源溶液为磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸铵、磷酸氢铵或磷酸二氢铵溶液。
优选步骤B)中所述的可溶性聚合物-丝素蛋白混合溶液中可溶性聚合物占丝素蛋白质量的百分含量为1％～30％，丝素蛋白溶液的浓度为10g/L～100g/L；所述的醇是甲醇或乙醇；膜放入醇中浸泡处理温度在10℃～60℃，处理时间为0.5h～3h；溶解去除可溶性聚合物的溶液优选为5℃～90℃的水；优选所述的可溶性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)或聚乙二醇(PEG)。
优选步骤C)中丝素蛋白溶液的浓度为10g/L～100g/L；再将膜置于京尼平(Genipin)交联反应时为了提高各层间的结合强度，京尼平交联反应是将多层膜浸泡在10℃～80℃下的京尼平溶液中处理3h～48h；其中京尼平溶液的浓度为1g/L～50g/L。
本发明所述的具有梯度结构的多层膜海可以利用RGD或BMP功能分子对多层膜中的多孔层进行生物功能修饰，改善多孔层的生物性能。
有益效果：
与现有的引导骨再生膜相比，本发明制得的多层膜含有三层：①阻隔层含有纳米孔，主要是起到阻隔和通透的作用；②中间层为力学强度层，提供骨再生过程需要的力学强度和膜材料在降解过程中的尺寸稳定；③多孔层为生物功能层，作为细胞外基质提供细胞外微环境，引导甚至诱导骨细胞和/或干细胞在多孔支架内的粘附、增殖和分化。多层功能膜在再生过程中的降解速率和力学强度下降速率与骨再生的速率相匹配；在多孔层构筑微纳结构和引入BMP、RGD等生物分子实现高生物学响应的多孔微环境，提高骨再生过程中的骨引导和骨诱导能力，加速骨再生速率。
附图说明
图1为具有的梯度结构多层功能膜的结构示意图：其中，1-多孔层，2-中间层和3-阻隔层；
图2为化学沉积法在丝素蛋白纺织物表面沉积取向磷酸钙的SEM照片；
图3为丝素蛋白纺织物/丝素蛋白多孔支架复合膜的横断面SEM照片。
具体实施方式
以下利用实施例进一步详细说明本发明，但不能认为限制发明的范围。
实施例1
取0.05g的丝素蛋白纺织物，浸入浓度为0.167mol·L-1、温度为37℃的钙源溶液中浸泡0.5h后取出，用蒸馏水浸洗2遍，再将其浸入浓度为0.100mol·L-1的磷源溶液中0.5h。如此重复交替浸渍6次后用蒸馏水和乙醇分别清洗3遍后，室温干燥即获得磷酸钙-丝素蛋白纺织物复合膜(中间层)。从图2所示的中间层的SEM照片，可以看出丝素蛋白上沉积了磷酸钙。
将0.3gPVP加入到20ml浓度为50g/L的丝素蛋白溶液中形成PVP-丝素蛋白混合溶液(其中PVP与丝素蛋白的质量百分比为30％)，将该混合溶液浇铸在中间层表面上在10℃干燥成膜后，再放入真空干燥箱干燥24h得到含有中间层和阻隔层的双层膜。双层膜用40℃甲醇处理30min后放入大量去离子水中在50℃下溶去PVP后形成由中间层和阻隔层组成的双层膜。从图3所示的多孔层层的SEM照片，可以看出多孔层含有大量的连续孔。
将双层膜铺平整，倒入浓度为50g/L的丝素蛋白溶液，冷冻干燥后，得到由阻隔层、中间层和多孔层组成的多层膜。
将上述多层膜置于浓度为5g/L的京尼平水溶液中，于37℃下交联反应24h后，洗涤干燥后即得多层膜(结构示意图如图1所示)。
实施例2
取0.10g的丝素蛋白纺织物，浸入浓度为0.100mol·L-1、温度为50℃的钙源溶液中浸泡2h后，取出，用蒸馏水浸洗3遍，再将其浸入浓度为0.150mol·L-1、温度为50℃的磷源溶液中2h。如此重复交替浸渍15次后用蒸馏水和乙醇分别清洗3遍后，室温干燥即获得磷酸钙-丝素蛋白纺织物复合膜(中间层)。
将0.5g PEG加入到20ml浓度为100g/L的丝素蛋白溶液中形成PEG-丝素蛋白混合溶液(PEG与丝素蛋白的质量百分比为25％)，将该混合溶液浇铸在中间层表面上在50℃干燥成膜后，再放入真空干燥箱干燥48h得到含有中间层和阻隔层的双层膜。双层膜用60℃乙醇处理1h后放入大量去离子水中在80℃下溶去PEG后形成由中间层和阻隔层组成的双层膜。
将双层膜铺平整，倒入浓度为100g/L的丝素蛋白溶液，冷冻干燥后，得到由阻隔层、中间层和多孔层组成的多层膜。
将上述多层膜置于浓度为10g/L的京尼平水溶液中，于60℃下交联反应48h后，洗涤干燥后即得多层膜。
实施例3
取0.50g的丝素蛋白纺织物，浸入浓度为0.800mol·L-1、温度为20℃的钙源溶液中浸泡3h后，取出，用蒸馏水浸洗3遍，再将其浸入浓度为0.600mol·L-1、温度为20℃的磷源溶液中2h。如此重复交替浸渍50次后用蒸馏水和乙醇分别清洗3遍后，室温干燥即获得磷酸钙-丝素蛋白纺织物复合膜(中间层)。
将0.16g PVA加入到20ml浓度为80g/L的丝素蛋白溶液中形成PVA-丝素蛋白混合溶液(PEG与丝素蛋白的质量百分比为10％)，将该混合溶液浇铸在中间层表面上在40℃干燥成膜后，再放入真空干燥箱干燥64h得到含有中间层和阻隔层的双层膜。双层膜用10℃乙醇处理3h后放入大量去离子水中在10℃下溶去PVA后形成由中间层和阻隔层组成的双层膜。
将双层膜铺平整，倒入浓度为20g/L的丝素蛋白溶液，冷冻干燥后，得到由阻隔层、中间层和多孔层组成的多层膜。
将上述多层膜置于浓度为30g/L的京尼平水溶液中，于70℃下交联反应6h后，洗涤干燥后即得多层膜。
Claims (4)
1.一种制备具有梯度结构的丝素蛋白多层功能膜的方法，其具体步骤如下：
A)采用交替浸渍法在丝素纺织物表面涂覆磷酸钙涂层：将丝素纺织物浸入浓度为0.01mol·L-1～1.00mol·L-1的钙源溶液中浸泡0.5h～3h后取出，用蒸馏水浸洗后，再将其浸入浓度为0.01mol·L-1～1mol·L-1的磷源溶液中浸泡0.5h～3h后取出；如此重复交替浸渍5～60次，清洗干燥后形成磷酸钙-丝素蛋白纺织物复合膜即中间层，其中控制钙源和磷源溶液的温度均为5℃～60℃；
B)将可溶性聚合物-丝素蛋白混合溶液浇铸在磷酸钙-丝素蛋白纺织物复合膜表面上，在5℃～60℃干燥成膜后，再放入真空干燥箱干燥24h～72h，然后再放入醇中浸泡处理后，最后溶解去除可溶性聚合物即可获得含有中间层和阻隔层的双层膜；
C)在双层膜的中间层上浇铸丝素蛋白溶液，用冷冻干燥后在阻隔层-中间层双层膜上构建多孔膜；再将膜置于京尼平溶液中交联反应，洗涤干燥后得具有梯度结构的丝素蛋白多层功能膜；该多层功能膜由阻隔层(1)、中间层(2)和多孔层(3)组成；其中，阻隔层(1)为含有纳米孔的丝素薄膜，中间层(2)为表面涂有磷酸钙的丝素蛋白纺织物，多孔层(3)为可降解多孔丝素蛋白支架；磷酸钙为磷灰石、磷酸八钙、磷酸氢钙或无定形磷酸钙中的一种或它们的组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤A)所述的钙源溶液为乙酸钙、硝酸钙或氯化钙溶液；所述的磷源溶液为磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸铵、磷酸氢铵或磷酸二氢铵溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤B)中所述的可溶性聚合物-丝素蛋白混合溶液中可溶性聚合物占丝素蛋白质量的百分含量为1％～30％，丝素蛋白溶液的浓度为10g/L～100g/L；所述的可溶性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或聚乙二醇；所述的醇是甲醇或乙醇；溶解去除可溶性聚合物的溶液为5℃～90℃的水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C)中丝素蛋白溶液的浓度为10g/L～100g/L；京尼平交联反应是将多层膜浸泡在10℃～80℃下的京尼平溶液中处理3h～48h；其中京尼平溶液的浓度为1g/L～50g/L。
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