CN102495015A - 一种间接测定Fenton反应产生的羟基自由基的方法 - Google Patents
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Abstract
以Fe(II)为催化剂、双氧水为氧化剂，在酸性介质中将无色的邻苯二胺溶液迅速氧化成橙红色溶液，该产物于450nm波长处有最大吸收。抗氧化剂能清除Fenton反应产生的羟基自由基，对该反应有显著抑制作用。当抗氧化剂加入到反应体系中时，产物的吸光度明显下降，产物的吸光度随着加入到体系中的抗氧化剂浓度的增加而线性降低，通过对比加入抗氧化剂前后产物的吸光度可计算抗氧化剂对自由基的清除率。方法操作简单，实验成本低，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及Vc等抗氧化剂对羟基自由基清除率的检测分析。在技术上涉及光分析化学等领域。
背景技术
机体代谢过程中活性氧物种(ROS)不断通过非酶促反应和酶促反应产生，在正常生理情况下，ROS的生成与清除处于动态平衡，可维持有利无害的极低水平。由于内源性或外源性刺激使机体代谢异常而产生大量ROS，或机体抗氧化剂不足，则使机体处于氧化应急状态，导致细胞和组织损伤，引起各种疾病。羟基自由基(·OH)是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基。羟基自由基参与的各种反应已成为生物学、生物化学和生物医学等领域中的重要研究课题。
动物体在生命活动过程中，伴随着活性氧自由基的生成与存在，生物体在进化过程中也逐渐形成了“抗活性氧的防御系统”。动物体内自由基清除剂是抗自由基防御系统清除自由基作用的物质基础，它在体内组织和细胞中的含量决定着抗自由基系统的清除自由基能力。人体内的水溶性小分子抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、尿酸、色氨酸和半胱氨酸等。除抗坏血酸主要通过食物摄入外，其它几种都是体内的代谢产物。准确检测体内各种抗氧化剂对羟基自由基的清除能力，对相关疾病的诊断和药物的开发具有重要的意义。
目前，离体检测这些抗氧化剂对羟基自由基清除率的方法主要有电子共振自旋捕集法、化学发光法、高效液相色谱法、气相色谱法、荧光法等。电子自旋共振法和色谱法操作复杂，需要先采用特殊的捕捉试剂对产生的羟基自由基进行捕捉，且这两种方法仪器昂贵；化学发光法虽然操作简便，测定快速，但其仪器普及不广。分光光度法因具有仪器简单廉价、操作方便、分析速度快、灵敏度较高的特点，在自由基清除率的测定中发挥了极大的作用。
本发明通过Fenton反应产生羟基自由基，催化邻苯二胺的显色反应。Vc等抗氧化剂对羟基自由基有显著的清除作用，并且抗氧化剂的浓度与吸光度的降低成正比，建立了一种间接测定羟基自由基的可见光分光光度法。
发明内容
本发明的目的是提供一种分析成本低、操作方便、灵敏度高、重现性好的分光光度法间接检测抗氧化剂对羟基自由基的清除率。
为此，我们以过氧化氢和亚铁离子构建Fenton体系，产生羟基自由基。在酸性介质中，在具有强氧化性的羟基自由基的作用下，无色的邻苯二胺迅速被氧化为橙红色产物，该产物于450nm处有最大吸收。抗氧化剂对该反应有显著的抑制效应。通过对比加入抗氧化剂前后产物的吸光度变化，可间接求出抗氧化剂对羟基自由基的清除率。
本发明的技术方案如下：
1.邻苯二胺的氧化
于容量瓶中依次加入一定浓度的HCl、邻苯二胺、FeSO4和双氧水溶液各若干毫升，加水定容。将混合液置于一定温度的恒温水浴中反应一定时间，邻苯二胺被氧化为稳定的橙红色产物。
2.产物吸收光谱的测量
反应结束后，以去离子水为参比，用1cm比色皿，用紫外可见分光光度计测量产物的吸收光谱(见附图1)，获得最大吸收波长为450nm。
3.产物吸光度的测量
以去离子水为参比，用1cm比色皿，以450nm为分析波长，用紫外可见分光光度计测量产物的吸光度A0。
4.抗氧化剂对邻苯二胺氧化反应的抑制
于容量瓶中依次加入一定浓度的HCl、邻苯二胺、FeSO4、抗氧化剂、双氧水溶液各若干毫升后，加水定容。将混合液置于一定温度的恒温水浴中反应一定时间后，测量产物的吸光度A1。由于抗氧化剂对氧化反应的抑制效应，在其余实验条件相同的情况下，无抗氧化剂存在的产物的吸光度A0大于抗氧化剂存在的产物的吸光度A1。
本发明的原理是：
酸性条件下，过氧化氢单独存在时，氧化邻苯二胺的速度非常缓慢，而在反应介质中加入亚铁离子，亚铁离子与过氧化氢构成Fenton体系，产生强氧化性的羟基自由基，使邻苯二胺迅速发生氧化反应，并生成稳定的橙红色产物。当在体系中加入抗氧化剂时，具有还原性的抗氧化剂能清除体系中的羟基自由基，抑制了邻苯二胺的氧化，导致产物的吸光度降低。通过计算羟基自由基清除率。
本发明的优点：
1.仪器简单，只需要可见光分光光度计即可完成。
2.操作简便，试剂易得，反应快速，成本低廉。
附图说明
图1为无抗坏血酸(a)及加入抗坏血酸(b)时邻苯二胺氧化产物的吸收曲线；
具体实施方式
用本发明测定抗氧化剂VC、苯甲酸和硫脲对羟基自由基的清除率。
1.溶液的配制
0.100mol/L邻苯二胺溶液：准确称取0.5407g邻苯二胺固体于小烧杯中，加水，在热水浴中溶解后立即冷却，转移入50mL容量瓶中，用去离水稀释至刻度，摇匀。邻苯二胺为白色晶体，能溶于热水，易被氧化，故每次实验都使用新配邻苯二胺水溶液，以减少误差。
双氧水标准溶液：于500mL容量瓶中加入6mL30％双氧水，稀释定容，得到0.1mol/L母液.用高锰酸钾氧化还原滴定法测定过氧化氢的准确浓度。溶液于棕色瓶中避光保存，每次使用时吸取2.5mL母液至25mL容量瓶，稀释定容(用时现配)。
0.10mol/LFeSO4溶液：称量0.139g硫酸亚铁固体，溶解，滴入1～3滴盐酸，定容至50mL，配置好的溶液于棕色瓶中避光保存.
1.0mol/L HCl溶液：量取41.7mL浓盐酸，移入500mL容量瓶，稀释定容。
2.邻苯二胺的氧化
于25mL容量瓶中依次准确加入一定浓度的HCl、邻苯二胺、FeSO4、一定浓度的抗氧化剂标准溶液、双氧水溶液各若干毫升，加水稀释、定容。定容后HCl浓度为1.0×10-2mol/L，邻苯二胺浓度为0.02mol/L，FeSO4浓度为3.0×10-4mol/L，双氧水浓度为6.0×10-4mol/L。将混合液置于20℃水浴中反应20min，邻苯二胺被氧化为稳定的橙红色产物。
3.产物吸光度的测定
用1cm比色皿，以去离子水为参比，以450nm为分析波长，测出加入不同抗氧化剂时产物的吸光度A。
4.清除率的计算
根据公式计算出不同抗氧化剂时的清除率。结果表明0.10mmol/L的三种抗氧化剂均有较高的羟基自由基清除率：Vc的抗氧化性最佳，清除率为59.6％；硫脲的清除率为52.4％；苯甲酸的清除率为51.0％。
Claims (2)
1.一种间接测定Fenton反应产生的羟基自由基的方法。其特征在于测定过程包括以下步骤：
(1)邻苯二胺的氧化
于容量瓶中依次加入一定浓度的HCl、邻苯二胺、FeSO4和双氧水溶液各若干毫升后，加水定容。将混合液置于一定温度的恒温水浴中反应一定时间，邻苯二胺被氧化为稳定的橙红色产物。
(2)产物吸收光谱的测量
反应结束后，以去离子水为参比，用1cm比色皿，用紫外可见分光光度计测量产物的吸收光谱(见附图1)，获得最大吸收波长为450nm。
(3)产物吸光度的测量
以去离子水为参比，用1cm比色皿，以450nm为分析波长，用紫外可见分光光度计测量产物的吸光度A0。
(4抗氧化剂对邻苯二胺氧化反应的抑制
于容量瓶中依次加入一定浓度的HCl、邻苯二胺、FeSO4、抗氧化剂、双氧水溶液各若干毫升后，加水定容。将混合液置于一定温度的恒温水浴中反应一定时间后，测量产物的吸光度A1。由于抗氧化剂对氧化反应的抑制效应，在其余实验条件相同的情况下，无抗氧化剂存在的产物的吸光度A0大于抗氧化剂存在的产物的吸光度A1。
(3)羟基自由基清除率的计算
按照公式
计算抗氧化剂对羟基自由基的清除率。
2.据权利要求1所述的间接测定Fenton反应产生的羟基自由基的方法，其特征在于对于0.10mmol/L的三种抗氧化剂：Vc的抗氧化性最佳，清除率为59.6％；硫脲的清除率为52.4％；苯甲酸的清除率为51.0％。
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