CN102494986A - 一种测定微囊藻上浮百分比的方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定微囊藻上浮百分比的方法，配制BG11培养基，灭菌后置于超净工作台中冷却；采用无菌操作的方法对微囊藻进行接种，接种量为104～105cells/mL，然后将其置于设定温度为25℃，光照强度为100μmol/m2·s的光照培养箱中进行培养；待微囊藻生长到对数期后，实验温度范围为0～30℃，光照强度范围为0～500umol/m2·s，将其转至设定为实验所需要的温度和光照强度的光照培养箱中进行培养，隔一段时间取一次样；用移液枪吸取藻液，滴一滴在细胞计数板，计数板为细胞计数板(CELL-VU)，细胞计数板的计数室深度为0.02mm；将细胞计数板置于显微镜下，分别对上浮的微囊藻和总藻进行计数。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定微囊藻上浮百分比的方法，该方法有助于研究蓝藻水华的暴发机理，属于水环境污染防治机理研究领域。
背景技术
随着我国工农业的迅猛发展以及城市化进程的加快，大量的含N、P等营养物质的工业废水、生活污水、农业污水排入到水体中，使中国的湖泊普遍呈现富营养化状态。在过去10多年中，全国许多地区出现水体污染、富营养化等问题。2010中国环境状况公报表明，26个国控重点湖泊(水库)中，营养状态为重度富营养的1个，占3.8％；中度富营养的2个，占7.7％；轻度富营养的11个，占42.3％；其他均为中营养，占46.2％，总体形势不容乐观。湖泊富营养化严重阻碍了社会、经济的可持续发展。
富营养化是指水体接纳过量的氮、磷等营养性物质，使水体中藻类以及其他水生生物异常过度繁殖，水体透明度和溶解氧下降，造成水质恶化，使水域生态和水功能受到阻碍和破坏的现象。当水体的富营养化发展到一定程度，就会引发蓝藻水华，它是水体中浮游生物暴发性繁殖，使水面呈现蓝色、红色、棕色、乳白色等异常颜色的现象。发生蓝藻水华后，往往会带来一系列的问题，如水体散发难闻气味、影响景观、危害供水安全等，有些藻种如微囊藻还会产生藻毒素，藻毒素对人畜具有严重的危害作用。因此，控制蓝藻水华具有重要的社会、经济、生态意义，而控制蓝藻水华首先要弄清水华暴发的机理。
蓝藻水华发生的主要原因可分为化学因素、物理因素、生物因素等：
1、化学因素：包括湖泊水体富营养化阶段藻类生长所需要的主要营养元素氮、磷、微量元素等。氮是藻类自身的组成元素，磷直接参与藻类光合和呼吸作用、酶系统活化和能量转化等过程，两者都是藻类生长和水华发生不可缺少的；微量元素也是藻类生长的必要条件。
2、物理因素：适宜的温度、光照、风力、湖流。蓝藻水华一般在温度较高、风力较小、湖流较缓的夏秋季节暴发，一般认为蓝藻生长的最佳水温是28℃。研究表明，光照强度和光暗比对蓝藻的生长有很大的影响。光照时间越长，蓝藻获得能量越多，有利于合成各种细胞组成成分，促进细胞生长繁殖。
3、生物因素：蓝藻具有较强的与其它水生植物、生物竞争机制，也具有休眠机制和二氧化碳浓缩机制等。休眠机制：有的形成厚壁孢子，有的形成藻殖段，有的形成非专性结构的休眠体；环境适宜时，在底泥中生长，并由底泥上升到水体中，这些休眠体就复苏，繁殖，上浮形成水华。水华蓝藻还具有高效吸收利用外源无机碳的二氧化碳浓缩机制。在低浓度的CO2介质中，蓝藻可以通过主动吸收、高效利用外源无机碳，在细胞内积累比介质高几百到几千倍的CO2浓度。
蓝藻具有的浮力调控机制让它们能够打破光和营养在位置上的分离，在竞争中处于有利地位，因此蓝藻的浮力调控被认为是蓝藻水华暴发的重要生物因素之一，研究蓝藻水华的暴发机理就必然不能缺少浮力调控方面的研究。研究浮力调控时一般需要测定蓝藻的上浮百分比这一指标。唐忠波等人(环境科学，2008，孟氏浮游蓝丝藻在模拟水体中的垂直分布与浮力规律)采用Sedgwick-Rafer沉积腔测定了这一指标，但Sedgwick-Rafer沉积腔计数室深度达1mm，只能测定群体生长的蓝藻的上浮百分比，对于单细胞蓝藻，由于其细胞直径极小，沉降与上浮速度缓慢，需要很长的时间才能沉降和上浮1mm的距离，给测定带来很大的误差；吴凯等人(生态环境学报，2011，水华蓝藻上浮特征与机理的试验研究)采用通过测定上层水体中叶绿素a含量和总叶绿素a含量来计算出上浮百分比，该种方法也只适宜群体生长的蓝藻的上浮百分比的测定。因此目前还缺少一种准确测定室内生长的单细胞藻的上浮百分比的方法，这一点限制了蓝藻水华爆发机理的研究。微囊藻是很多蓝藻水华的优势藻种，一种有效的测定微囊藻的上浮百分比的方法对于蓝藻水华的暴发机理的研究具有重要意义。
发明内容
本发明目的是：针对现今缺少测定微囊藻上浮百分比的方法的现状，本发明提供一种测定该指标的方法，可以有效的测定微囊藻上浮百分比，从而促进微囊藻水华发生的浮力调控机制研究。
本发明技术方案是，一种测定微囊藻上浮百分比的方法，采用如下步骤：
①配制BG11培养基，倒入锥形瓶中，灭菌后置于超净工作台中冷却；
②采用无菌操作的方法对微囊藻进行接种，接种量为104～105cells/mL，然后将其置于设定温度为25℃，光照强度为100μmol/m2·s的光照培养箱中进行培养，每天用血球计数板进行计数，观察其生长情况；
③待微囊藻生长到对数期后，实验温度范围为0～30℃，光照强度范围为0～500umol/m2·s，取样时采用无菌手法；将其转至设定为实验所需要的温度和光照强度的光照培养箱中进行培养，隔一段时间取一次样。取样所用的移液枪在超净工作台中用紫外灭菌，移液枪头在高压灭菌锅中于120℃灭菌30min，取样在超净工作台中采用无菌操作方法进行。
④取样前将微囊藻摇匀，然后用移液枪吸取藻液，滴一滴在细胞计数板，计数板为细胞计数板(CELL-VU)，细胞计数板的计数室深度为0.02mm；滴在细胞计数板(CELL-VU)的盖玻片边缘，使藻液缓缓渗入，多余的藻液用吸水纸吸去；
⑤将细胞计数板置于冰箱中于4～6℃静置，30-40min后取出；
⑥将细胞计数板置于显微镜下，分别对上浮的微囊藻和总藻进行计数；
⑦
其中，m上浮和m总分别代表上浮和总共的藻数目。
⑤中静置时的温度为4～6℃，静置时间为30～40min；
步骤⑥中的计数方法为对所有格子中的藻进行计数。
本发明原理，室内微囊藻在水中的沉降和上浮速度符合斯托克斯方程：
其中ρs为藻密度，ρ为水密度，d为藻的公称直径，μ为水的粘度，
为藻的形状阻力系数，当藻密度大于水时表示下沉速率，小于水时表示下沉速率。从该式可以看出，藻的沉降或上浮速率主要取决于藻与水的密度差和其直径，而具有伪空胞的微囊藻的密度只与水相差几至十几kg/m3，且微囊藻的直径只有几微米，因此其沉降以及上浮速率非常缓慢。要测定上浮百分比这一指标，需要在较短的时间内把上浮与下沉的微囊藻区分开来，通过减少沉降与上浮距离可以达到这一目的。本发明所采用的CELL-VU细胞计数板的计数室深度只有0.02mm，微囊藻在几十分钟内可以完成上浮和下沉过程，并应用显微镜分别对上浮的藻与总藻进行计数可计算出微囊藻的上浮百分比，进而促进微囊藻上浮机理的研究。
本发明有益效果，本发明提供了一种测定单细胞微囊藻的上浮百分比的方法，通过此方法可以准确测定微囊藻上浮百分比这一指标。本方法测定微囊藻的下沉与上浮时间短，减少了时间过长所带来的误差，并且操作简便，准确度高，是一种测定微囊藻上浮百分率的有效方法，可促进微囊藻上浮机理的研究。
附图说明
图1.温度为10℃，光照强度为0umol/m2·s时微囊藻上浮百分比随时间的变化曲线
图2.温度为20℃，光照强度为100umol/m2·s时微囊藻上浮百分比随时间的变化曲线
图3.温度为20℃，光照强度为500umol/m2·s时微囊藻上浮百分比随时间的变化曲线
图4.温度为25℃，光照强度为20umol/m2·s时微囊藻上浮百分比随时间的变化曲线
图5.温度为25℃，光照强度为100umol/m2·s时微囊藻上浮百分比随时间的变化曲线
图6.温度为30℃，光照强度为100umol/m2·s时微囊藻上浮百分比随时间的变化曲线
具体实施方式
①配制BG11培养基，倒入锥形瓶中，每个锥形瓶装600mL培养基，用封口膜封好，然后置于高压灭菌锅中，在120℃下灭菌30min，灭菌后置于超净工作台中冷却。微囊藻在1L锥形瓶中进行纯培养，所用培养基为BG11(是现有的蓝绿藻培养的液体培养基)，配制方法如下：
(1)改进的BG11配方如表1，配成5个母液：表1BG11配方母液
(2)配制：按下列比例分别取上述母液①～⑤(③除外)，然后加入已溶解1.5g NaNO3的溶液中，定容到1000mL，调节其pH值为7.1。灭菌后在超净台里再按比例加入试剂③。
Stock1取用2mL；
Stock2取用10mL；
Stock3取用1mL；
Stock4取用10mL；
Stock5取用1mL；
总定容：1000mL。
其中，将氯化钙的母液单独灭菌，在配制好BG11的工作液并灭菌之后，按无菌操作法将氯化钙加入灭过菌的工作液中。
将培养的微囊藻置于光照培养箱(赛福PGX-450D)中，光暗比为12h∶12h，在温度为25℃，光照强度为100umol/m2·s下进行培养。
②待培养基冷却后，采用无菌操作的方法对微囊藻进行接种，接种量为104～105cells/mL，然后将其置于设定温度为25℃，光照强度为100umol/m2·s的光照培养箱中进行培养，每天用血球计数板进行计数，观察其生长情况。
③待微囊藻生长到对数期后，将其转至设定为实验所需要的温度和光照强度的光照培养箱中进行培养，隔一段时间取一次样。取样所用的移液枪在超净工作台中用紫外灭菌，移液枪头在高压灭菌锅中于120℃灭菌30min，取样在超净工作台中采用无菌操作方法进行。
④取样前将微囊藻摇匀，然后用移液枪吸取少量藻液，滴一滴在细胞计数板(CELL-VU)的盖玻片边缘，使藻液缓缓渗入，多余的藻液用吸水纸吸去。
⑤将细胞计数板置于冰箱中于4～6℃静置，30-40min后取出。
⑥将细胞计数板置于显微镜下，分别对上浮的微囊藻和总藻进行计数
⑦
其中，m上浮和m总分别代表上浮和总共的藻数目；
步骤②中所采用的藻种为微囊藻接种量为104～105cells/mL，培养条件为温度25℃，光照强度100umol/m2·s，培养藻所用的仪器为光照培养箱；步骤③中实验时藻的生长时期为对数期，实验温度范围为0～30℃，光照强度范围为0～500umol/m2·s，取样时采用无菌手法；步骤④中测定上浮百分比所采用的实验器材为细胞计数板(CELL-VU)，计数室深度为0.02mm；步骤⑤中静置时的温度为4～6℃，静置时间为30～40min；步骤⑥中的计数方法为对所有格子中的藻进行计数。
实施例1
将培养自温度为25℃，光照强度为100umol/m2·s条件下的微囊藻转至设定温度为10℃、光照强度为0umol/m2·s的光照培养箱中进行培养，隔两个小时取一次样，测定微囊藻上浮百分比随时间的变化。具体操作如下：将移液枪头置于高压灭菌锅中，于120℃灭菌30min，然后将其放在超净工作台中，移液枪置于超净工作台中用紫外灭菌30min，待移液枪头冷却后，在超净工作台中按无菌操作的方法进行取样，取样前将藻摇匀，然后用移液枪吸取少量藻液，滴一滴在细胞计数板(CELL-VU)的盖玻片边缘，使藻液缓缓渗入，多余的藻液用吸水纸吸去，置于冰箱中于4-6℃静置，目的有二：1.减弱藻在静置过程中的生理活动2.减少藻液的蒸发，30-40min(根据藻细胞的大小适当进行调整)后置于显微镜下，分别对上浮的微囊藻细胞与总的藻细胞进行计数，最后计算出
其中，m上浮和m总分别代表上浮和总共的藻数目。实验结果见表2，可以看出，微囊藻的上浮百分比在此条件下基本保持不变。
表2微囊藻上浮百分比变化
实施例2
将培养自温度为25℃，光照强度为100umol/m2·s条件下的微囊藻转至设定温度为20℃、光照强度为100umol/m2·s的光照培养箱中进行培养，隔两个小时取一次样，测定微囊藻上浮百分比随时间的变化，测定上浮百分比的方法同上，实验结果见表3，可以看出，在此条件下，微囊藻的上浮百分比逐渐降低。
表3微囊藻上浮百分比变化
实施例3
将培养自温度为25℃，光照强度为100umol/m2·s条件下的微囊藻转至设定温度为20℃、光照强度为500umol/m2·s的光照培养箱中进行培养，隔两个小时取一次样，测定微囊藻上浮百分比随时间的变化，测定上浮百分比的方法同上，实验结果见表4，可以看出，在此条件下，微囊藻的上浮百分比快速下降。
表4微囊藻上浮百分比变化
实施例4
将培养自温度为25℃，光照强度为100umol/m2·s条件下的微囊藻转至设定温度为25℃、光照强度为20umol/m2·s的光照培养箱中进行培养，隔两个小时取一次样，测定微囊藻上浮百分比随时间的变化，测定上浮百分比的方法同上，实验结果见表5，可以看出，在此条件下，微囊藻的上浮百分比有一定下降，但下降幅度很小。
表5微囊藻上浮百分比变化
实施例5
将培养自温度为25℃，光照强度为100umol/m2·s条件下的微囊藻转至设定温度为25℃、光照强度为100umol/m2·s的光照培养箱中进行培养，隔两个小时取一次样，测定微囊藻上浮百分比随时间的变化，测定上浮百分比的方法同上，实验结果见表6，可以看出，在此条件下，微囊藻的上浮百分比逐渐下降。
表6微囊藻上浮百分比变化
实施例6
将培养自温度为25℃，光照强度为100umol/m2·s条件下的微囊藻转至设定温度为30℃、光照强度为100umol/m2·s的光照培养箱中进行培养，隔两个小时取一次样，测定微囊藻上浮百分比随时间的变化，测定上浮百分比的方法同上，实验结果见表7，可以看出，在此条件下，微囊藻的上浮百分比逐渐下降且比实施例5中的下降迅速。
表7微囊藻上浮百分比变化
Claims (3)
1.一种测定微囊藻上浮百分比的方法，其特征是采用如下步骤：
①配制BG11培养基，倒入锥形瓶中，灭菌后置于超净工作台中冷却；
②采用无菌操作的方法对微囊藻进行接种，接种量为104～105cells/mL，然后将其置于设定温度为25℃，光照强度为100μmol/m2·s的光照培养箱中进行培养，每天用血球计数板进行计数，观察其生长情况；
③待微囊藻生长到对数期后，实验温度范围为0～30℃，光照强度范围为0～500umol/m2·s，取样时采用无菌手法，将其转至设定为实验所需要的温度和光照强度的光照培养箱中进行培养，隔一段时间取一次样；取样所用的移液枪在超净工作台中用紫外灭菌，移液枪头在高压灭菌锅中于120℃灭菌30min，取样在超净工作台中采用无菌操作方法进行。
④取样前将微囊藻摇匀，然后用移液枪吸取藻液，滴一滴在细胞计数板，计数板为细胞计数板(CELL-VU)，细胞计数板的计数室深度为0.02mm；滴在细胞计数板(CELL-VU)的盖玻片边缘，使藻液缓缓渗入，多余的藻液用吸水纸吸去；
⑤将细胞计数板静置；
⑥将细胞计数板置于显微镜下，分别对上浮的微囊藻和总藻进行计数；
⑦ 
其中，m上浮和m总分别代表上浮和总共的藻数目。
2.根据权利要求1测定微囊藻上浮百分比的方法，其特征是步骤⑤静置时的温度为4～6℃，静置时间为30～40min。
3.根据权利要求1测定微囊藻上浮百分比的方法，其特征是步骤⑥中的计数方法为对所有格子中的藻进行计数。
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