CN102492707A - β-1,4-内切木聚糖酶催化域(Aor Xyn10BC)基因的克隆及表达 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186的新型10家族木聚糖酶催化域基因cDNA序列的克隆及分析、质粒构建及表达方法，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。生物信息学分析表明该木聚糖酶催化域属于糖苷水解酶第10家族，命名为Aor Xyn10BC，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2，相应的基因命名为Aor xyn10BC。这为该基因的异源表达和工业化生产奠定了理论基础。本发明还公开了木聚糖酶工程菌的构建以及重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法。作为一种新型酶制剂，该木聚糖酶具有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值，也为其它木聚糖酶的研究奠定了理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的一种新型10家族木聚糖酶催化域(Aor Xyn10BC)基因完整cDNA序列的克隆及分析，木聚糖酶催化域基因工程菌的构建及重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
在自然界中植物细胞壁是一个巨大的碳水化合物仓库，半纤维素约占植物干重的33％，是除纤维素之外最为丰富的多糖。木聚糖是半纤维素最主要的成分之一，广泛存在于植物细胞的细胞壁和胞间层中。木聚糖结构复杂，其主链由以β-1，4-糖苷键相连的木糖残基构成，当主链被取代后可形成包含阿拉伯糖、葡糖醛酸、甲基葡糖醛酸、乙酰基、阿魏酰基及p-香豆素等取代基的侧链。木聚糖的这种复杂的结构导致其完全降解需要众多酶的共同参与才能完成，其中能够水解木聚糖主链的木聚糖酶在整个水解过程中起最重要的作用。
内切β-1，4-D-木聚糖酶(β-1，4-D-endoxylanase，EC 3.2.1.8)是木聚糖酶的主要组分之一，它能够从木聚糖主链的内部切割β-1，4糖苷键形成寡聚木糖和少量木糖。木聚糖酶在自然界分布很广，研究较多的是微生物产生的木聚糖酶，已报道能合成木聚糖酶的微生物有细菌、放线菌、真菌和酵母菌等。根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。
目前木聚糖酶已在造纸、食品、能源、饲料以及环境等领域体现出了重要的应用价值，虽然每年都有数目庞大的新的木聚糖酶被发现，但实际上大多数微生物中木聚糖酶的酶学性质和产量都不能满足工业生产的要求。而随着基因工程的发展，运用分子生物学方法对木聚糖酶进行改造将加速木聚糖酶在各领域中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型10家族木聚糖酶催化域cDNA序列的克隆和分析，木聚糖酶催化域基因工程菌的构建及重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法，为该基因的异源高效表达和产业化生产奠定理论基础，也为其他木聚糖酶研究奠定基础。根据Bernard Henrissat等提出的糖苷水解酶分类法，绝大多数木聚糖酶属于糖苷水解酶第10和11家族。生物信息学分析表明该基因所编码的木聚糖酶属于A.oryzae CICC 40186中发现的一种10家族木聚糖酶的催化域，命名为Aor Xyn10BC，其相应的基因命名为Aor xyn10BC。
本发明的技术方案：一种来源于A.oryzae CICC 40186的新型10家族木聚糖酶催化域基因(Aor xyn10BC)，其cDNA序列为SEQ ID NO：1。
所述的由cDNA推导的Aor Xyn10BC氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
所述的重组木聚糖酶的活性测定方法：
于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4.6、柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制的质量浓度为0.5％的桦木木聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应15min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个木聚糖酶活性单位(IU)。
所述的Aor xyn10BC cDNA序列的克隆和表达方法：
(1)Aor xyn10BC cDNA序列的克隆：基于我们申请的《β-1，4-内切木聚糖酶(Aor Xyn10B)基因的克隆及序列分析》及预测的催化域，设计两条引物Xyn10BC-F1和Xyn10BC-R1：
Xyn 10BC-F1：5′-GAGCTGGTCTGCATGACGC-3′
Xyn 10BC-R1：5′-CAAAACCTCCAAAATGCC-3′
提取A.oryzae CICC 40186的总RNA，按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)说明书进行RT-PCR扩增。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-xyn10BC)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aor xyn10BC cDNA序列。
(2)含编码Aor Xyn10BC成熟肽基因的表达质粒的构建：基于上述得到的Aor xyn10BCcDNA序列以及预测的催化域，设计一对引物Xyn10BC-Fo和Xyn10BC-Ro，扩增成熟肽基因：
Xyn10BC-Fo：5′-CTCGAGAAAAGAGCTGGTCTGCATGACGC-3′， 含Xho I酶切位点
Xyn10BC-Ro：5′-GCGGCCGCCTTACAAAACCTCCAAAATGCC-3′，含Not I酶切位点
按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)说明书进行RT-PCR。以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Xyn10BC-Fo为引物进行第一轮PCR；以Xyn10BC-Fo和Xyn10BC-Ro为引物进行第二轮PCR。将两轮PCR产物用1％琼脂糖 凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn10BC)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
将测序结果正确的pUCm-T-xyn10BC与一种改造的pPIC9KM质粒均用Xho I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9KM-xyn10BC(图1)，并对重组表达质粒进行序列测定。
(9)GS115/xyn10BC重组子的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9KM-xyn10BC进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/xyn10BC；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定重组木聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，获得了电泳纯的重组木聚糖酶。
本发明的有益效果：本发明提供了一种新型10家族木聚糖酶基因cDNA序列的克隆及分析，木聚糖酶工程菌GS115/xyn10BC的构建，以其重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法，为该基因的异源高效表达和产业化生产奠定了理论基础。经生物信息学分析表明来源于米曲霉CICC 40186的该木聚糖酶催化域属于糖苷水解酶第10家族，命名为Aor Xyn10BC，其相应的基因命名为Aor xyn10BC。Aor Xyn10BC具有较好的pH稳定性，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值，也为其它木聚糖酶的研究奠定了基础。
附图说明
图1：重组质粒pPIC9KM-xyn10BC的构建示意图
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1Aor xyn10BC cDNA序列的克隆
以Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Xyn10BC-F1为引物进行第一轮PCR扩增(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃90s；72℃10min)，以Xyn10BC-F1和Xyn10BC-R1为引物进行第二轮PCR扩增(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃1min；72℃10min)。将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn10BC)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
实施例2含编码木聚糖酶催化域成熟肽基因的表达质粒的构建
以Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Xyn10BC-F1为引物进行第一轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃90s；72℃10min)；以Xyn10BC-F1和Xyn10BC-R1为引物第二轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃1min；72℃10min)。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn10BC)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序正确的pUCm-T-xyn10BC与pPIC9KM质粒均用Xho I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9KM-xyn10BC，并对重组表达质粒进行序列测定。
实施例3 GS115/xyn10BC的构建、表达、产物纯化及活性测定
用Sal I对pPIC9KM-xyn10BC进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/xyn10BC。该工程菌用0.5％甲醇诱导96h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达20IU/mL。离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组木聚糖酶分子量为50kDa。该重组木聚糖酶最适作用温度60℃，在温度50℃以下稳定；最适作用pH 5.5，在pH 4.0～7.5稳定。
Claims (4)
1.一种源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186、归属于糖苷水解酶第10家族的新型木聚糖酶催化域基因，其cDNA的核苷酸序列对应于序列表中的SEQ ID NO：1。
2.如权利要求1所述的新型木聚糖酶催化域(Aor Xyn10BC)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
3.A.oryzae CICC 40186 Aor xyn10BC cDNA序列的获取方法：
基于我们申请的《β-1，4-内切木聚糖酶(Aor Xyn10B)基因的克隆及序列分析》及预测的催化域，设计两条引物Xyn10BC-F1和Xyn10BC-R1：
Xyn10BC-F1：5′-GAGCTGGTCTGCATGACGC-3′
Xyn10BC-R1：5′-CAAAACCTCCAAAATGCC-3′
以A.orvzae CICC 40186总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Xyn10BC-F1为引物进行第一轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃90s；72℃10min)；以Xyn10BC-F1和Xyn10BC-R1为引物进行第二轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃1min；72℃10min)；目的条带经克隆、测序得到Aor xyn10BC cDNA序列。
4.A.oryzae CICC 40186木聚糖酶催化域基因工程菌的构建和表达方法：
(1)构建含编码Aor Xyn10BC成熟肽基因的表达质粒：基于上述得到的木聚糖酶催化域基因cDNA序列，设计一对引物Xyn10BC-Fo和Xyn10BC-Ro，获得已去除信号肽基因序列的催化域成熟肽基因：
Xyn10BC-Fo：5′-CTCGAGAAAAGAGCTGGTCTGCATGACGC-3′，含Xho I酶切位点
Xyn10BC-Ro：5′-GCGGCCGCTTACAAAACCTCCAAAATGCC-3′，含Not I酶切位点
以合成的cDNA第一条链为模板，M13 Primer M4和Xyn10BC-Fo为引物进行第一轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃90s；72℃10min)；以Xyn10BC-Fo和Xyn10BC-Ro为引物第二轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，51℃30s，72℃1min；72℃10min)；将第二轮PCR的目的条带进行克隆、测序；测序正确的pUCm-T-xyn10BC与一种改造后的pPIC9KM质粒均用Xho I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9KM-xyn10BC，并对重组质粒进行测序鉴定；
(2)GS115/xyn10BC的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9KM-xyn10BC进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/xyn10BC；该工程菌用0.5％甲醇诱导96h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达20IU/mL；离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组木聚糖酶分子量为50kDa。
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|---|---|---|---|---|
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
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| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120613 |