CN102482649A - 立体专一性羰基还原酶 - Google Patents

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Abstract

立体专一性羰基还原酶SCR1，SCR2，SCR3是本文中所述的编码这些还原酶的核苷酸序列。这些立体专一性羰基还原酶具有anti-Prelog选择性以及可用于精细生物化学合成的特异性。

Description

立体专一性羰基还原酶
相关申请的交叉引用
该专利申请声明美国申请号61/219,610，于2009年6月23日提交的专利的优先权利，在该申请中以供参考。
 政府支持声明
该发明获得美国国家医学科学研究院蛋白质结构启动项目#U54GM074958的政府资助，政府对该发明具有保留权利。
背景
NAD(P)H依赖型的羰基还原酶能催化还原大量内源性和异源性的羰基化合物，包括生物学和药物学活性底物（Forrest et al., Chem. Biol. Interact., 129, 21-40(2000)）。在药物学和精细化工业使用羰基还原酶生产手性醇已引起很大的兴趣，手性醇是合成手性纯化合物的重要模块，例如药物试剂（Panke et al., Curr. Opin. Biotechnol., 15, 272–279 (2004); Schmid et al., Nature, 409, 258–268 (2001); and Schoemaker et al., Science, 299, 1694–1697 (2003)）。在手性助剂方面，手性醇由其对应的潜手性酮转化而来，羰基还原酶的使用与化学催化剂相比具有高化学选择性、对映选择性、区域选择性的优势。这些特征使得立体专一性羰基还原酶从科学和工业角度都非常有价值（Kroutil et al. , Curr. Opin. Chem. Biol., 8, 120–126 (2004)）。然而，立体专一性羰基还原酶目前应用范围仍受到限制。这些都可以归因于几个限制因素，包括酶的立体特异性和应用性。此外，对于氧化还原酶分子机理的研究尚处于初期。大多数能催化不对称还原反应的酶在立体化学性产物上都遵循Prelog规则（Bradshaw et al., J. Org. Chem., 57, 1526–1532 (1992); Ernst et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 66, 629–634 (2005); Niefind et al., J. Mol. Biol., 327, 317–328 (2003); Prelog et al., Pure Appl. Chem., 9, 119–130 (1964)）。遵循anti-Prelog规则的酶是相当稀少的，只有很少一部分分离得到纯酶，并对其定性(DeWildeman et al., Acc. Chem. Res., 40, 1260–1266 (2007))。因此，立体专一性羰基还原酶是现在急需的一种酶，特别是具有anti-Prelog立体特异性的羰基还原酶。
  本发明特定实施方案概述
如本文所描述，在近平滑假丝酵母Candida parapsilosis中发现了3个立体专一性羰基还原酶基因（scr1, scr2, scr3）。这些基因已被克隆和表达，编码蛋白被纯化为同质体，经证实具有立体专一性羰基还原酶功能（SCR1，SCR2，SCR3）。这些立体专一性羰基还原酶有anti-Prelog选择性，能将2-羟基苯乙酮转化为（S）-苯基乙二醇（PED）。这些氧化还原酶具有高效的催化特异性，可用于精细生物化学合成。
生物催化在手性分子合成上的应用是一种绿色技术，可代替化学途径。这是由于生物催化的反应条件温和，环保以及其不可比拟的化学选择性、区域选择性和立体选择性。经鉴定的新的立体专一性羰基还原酶（SCRs）表现出高的催化活性，在以NADPH为辅酶时，可将2-羟基苯乙酮转化为PED。该酶簇是羰基还原酶，拥有anti-Prelog立体选择性，在基因簇编码的酶中，SCR1和SCR3对苯乙酮衍生物和氯代的2-羟基苯乙酮有独特的特异性，特别是对4-氯-3-羟基丁酸乙酯有很高的活性，可产生4-氯-3-羟基丁酸乙酯，该化合物是合成阿伐他汀（立普妥）和罗苏伐他汀例如瑞舒伐他汀钙（可定）的手性侧链前体。
 图表简述
图.1 近平滑假丝酵母Candida parapsilosis基因组中重叠序列群005802的组成图，包括四个开放阅读框，scr1、scr2、scr3和cpadh。
 图.2 近平滑假丝酵母Candida parapsilosis来源的CPADH（基因库登录号DQ675534；SEQ ID NO:1）、SCR1（基因库登录号FJ939565；SEQ ID NO:4）、SCR2（基因库登录号FJ939563；SEQ ID NO:3）、SCR3（基因库登录号FJ939564；SEQ ID NO:2）的氨基酸序列比对。比对序列的间隙已用破折号标出，相同的氨基酸残基用方框圈出，在SDRs中的辅酶结合部分的保守序列Gly-XXX-Gly-X-Gly（SEQ ID NO:9）和催化四联体Asn-Ser-Tyr-Lys（SEQ ID NO:10）已用箭头标出。
 图.3 SCR1，SCR2，SCR3过量表达分析。蛋白在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离，并用考马斯亮蓝G-250染色。条带1，SCR1总蛋白；条带2，SCR1可溶性组分；条带3，SCR2总蛋白；条带4，SCR2可溶性组分；条带5，SCR3总蛋白；条带6，SCR3可溶性组分；条带7，标准分子量。
 图.4 纯酶的SDS-PAGE分析，纯化的蛋白通过SDS-PAGE在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离，并用考马斯亮蓝G-250染色。条带1，标准分子量；条带2，纯化后的SCR1；条带3，纯化后的SCR2；条带4，纯化后的SCR3。
 图.5 SCR1，SCR2，SCR3催化2-羟基苯乙酮还原反应的pH依赖性。在0.1M醋酸缓冲液（pH4.0到6.0）或0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0到8.0）或0.1MTris-HCl缓冲液（pH8.0到8.5）中，以2-羟基苯乙酮为底物，NADPH为辅酶的条件下测定的酶活，每种酶测定的最大酶活设定为100%相对活性。
 图.6A-6E. 分别通过SCR1，SCR2，SCR1不对称还原2-HAP得到PED的对映（异构体），（6A）（R）-PED的标准品（6B）（S）-PED的标准品（6C）SCR1催化不对称还原2-HAP（6D）SCR2催化不对称还原2-HAP（6E）SCR3催化不对称还原2-HAP。 
图.7A-7D. SCR1 和SCR3的底物特异性。正如本文中所描述的，SCR1 （open bar）和SCR3（shaded bar）(7A)对各种底物（7B-7D）的酶活已测定。酶对不同底物测得的最大酶活设定为100%相对活性。
 详细描述
本发明具体实施方案提出了一个纯化后的多肽，它的序列包含一段与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶有至少70%相似性的氨基酸序列，它有羰基还原酶的活性，但并不包含SEQ ID NO:1。
在具体实施方案中，氨基酸序列与其中至少一个由SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或NO:4代表的Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶有大于70%的相似性。
在具体实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NO:2有大于70%的相似性。
在具体实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NO:3有大于70%的相似性。
在具体实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NO:4有大于70%的相似性。
在具体实施方案中，氨基酸序列与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶（例如至少SEQ ID NO:2, NO:3或NO:4其中的一个）有大于75%的相似性。
在具体实施方案中，氨基酸序列与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶（例如至少SEQ ID NO:2, NO:3或NO:4其中的一个）有大于80%的相似性。
在具体实施方案中，氨基酸序列与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶（例如至少SEQ ID NO:2, NO:3或NO:4其中的一个）有大于85%的相似性。
在具体实施方案中，氨基酸序列与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶（例如至少SEQ ID NO:2, NO:3或NO:4其中的一个）有大于90%的相似性。
在具体实施方案中，氨基酸序列与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶（例如至少SEQ ID NO:2, NO:3或NO:4其中的一个）有大于95%的相似性。
在具体实施方案中，氨基酸序列与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶（例如至少SEQ ID NO:2, NO:3或NO:4其中的一个）有大于99%的相似性。
在具体实施方案中，氨基酸序列包含了SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。
在具体实施方案中，氨基酸序列包含了SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。
在具体实施方案中，氨基酸序列包含了SEQ ID NO:2。
在具体实施方案中，氨基酸序列包含了SEQ ID NO:3。
在具体实施方案中，氨基酸序列包含了SEQ ID NO:4。
在具体实施方案中，多肽序列基本上或是由SEQ ID NO:2，SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4构成。
在具体实施方案中，多肽的羰基还原酶活性是NADPH依赖型的。
在具体实施方案中，多肽是anti-Prelog类型的立体专一性羰基还原酶。
如本文中所描述的，本发明的具体实施方案提出了构成多肽的组分。
本发明的具体实施方案提供了一个经分离的包含有编码本文所描述的多肽序列的核酸序列。
在具体实施方案中，核酸序列包含了SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:6的简并变异。
在具体实施方案中，核酸序列包含了SEQ ID NO:7或者SEQ ID NO:7的简并变异。
在具体实施方案中，核酸序列包含了SEQ ID NO:8或者SEQ ID NO:8的简并变异。
在具体实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:2的蛋白。
在具体实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:3的蛋白。
在具体实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:4的蛋白。
本发明的具体实施方案提供了一个表达载体，包含一个表达DNA序列组件，可操作性地连接到本文所描述的核酸分子上。
本发明的具体实施方案提供了一个宿主细胞，包含了本文所描述的载体。
本发明的具体实施方案提供了还原羰基底物的方法，包含了在适合催化羰基底物还原反应的条件下，本文中描述的多肽或组分与底物的的相互作用。本文中用到的“羰基底物”指包含至少一个羰基基团的底物，例如包含了α-酮酯，β-酮酯，芳香酮，或脂肪酮（见图.7）的化合物。具有羰基还原酶活性的多肽能还原羰基底物中一个羰基基团。
在具体实施方案中，还原反应需要辅酶的参与。
在具体实施方案中，辅酶是NADPH。
在具体实施方案中，羰基底物包含了α-酮酯，β-酮酯，芳香酮或脂肪酮。
在具体实施方案中，羰基底物包含了α-酮酯。
在具体实施方案中，α-酮酯是丙酮酸甲酯，苯甲酰甲酸甲酯，丙酮酸乙酯或苯甲酰甲酸乙酯。
在具体实施方案中，羰基底物包含了β-酮酯。
在具体实施方案中，β-酮酯是三氟乙酰乙酸乙酯，乙酰乙酸甲酯，3-氧代戊酸甲酯，4-氟苯甲酰乙酸甲酯，乙酰乙酸乙酯，3-氧代戊酸乙酯，4-氯乙酰乙酸乙酯，苯甲酰乙酸乙酯或3,4-二甲氧基苯甲酰乙酸乙酯。
在具体实施方案中，羰基底物包含了芳香酮。
在具体实施方案中，芳香酮是2-羟基苯乙酮或它的衍生物。
在具体实施方案中，芳香酮是2-氯-2-羟基苯乙酮，3-氯-2-羟基苯乙酮，4-氯-2-羟基苯乙酮或4-甲氧基-2-羟基苯乙酮。
在具体实施方案中，羰基底物包含了脂肪酮。
在具体实施方案中，脂肪酮是2-丁酮，2-戊酮，2-己酮，2-庚酮，2-辛酮或2-甲基-3-戊酮。
在具体实施方案中，羰基底物是4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
在具体实施方案中，还原反应的pH范围从5.0到6.0（例如，在5.0,5.5或6.0）。
本文所述为Candida parapsilosis中一个新型的对映选择性氧化还原酶的基因簇，具有与众不同的立体特异性。通过对相应的基因产物的克隆，表达，纯化，以及对多种底物潜手性羰基的不对称还原的酶产物对映异构体构型的确认，确定基因编码了三种独特的立体专一性羰基还原酶。SCR1，SCR2和SCR3在还原潜手性羰基时都表现出anti-Prelog立体特异性；例如，从相应的酮底物2-羟基苯乙酮形成（S）-苯基乙二醇。然而，这些酶在它们的催化特性上是有区别的，包括pH依赖性和底物谱专一性。
根据催化特性和一级结构信息，立体特异性氧化还原酶包含醇脱氢酶和羰基还原酶，主要分为三个不同的类型，Zn离子依赖性的醇脱氢酶，锻炼脱氢/还原酶（SDR）和醛酮还原酶（AKR）（Kamitori et al., J. Mol. Biol., 352, 551–558 (2005)；Reid and Fewson et al., Crit. Rev. Microbiol., 20, 13–56 (1994)）。这些酶具有SDR总科的序列基元特性，包括辅酶结合基序Gly-X-X-X-Gly-X-Gly(X代表任意氨基酸；SEQ ID NO:9)，催化三联体Ser-Tyr-Lys（SEQ ID NO:11），同时在大多数SDRs中发现了Asn-Ser-Tyr-Lys（SEQ ID NO:10）的延伸四联体（Filling et al.,J. Biol. Chem., 277, 25677–25684 (2002)）。此外，SCRs还有二级结构元件中的保守序列基元，以及在典型SDRs的cP2亚科中决定辅酶特异性的关键位点，除了弱碱性残基H取代了负责结合NADPH中磷酸基团的保守碱性残基K/R（Kallberg et al., Eur. J. Biochem., 269, 4409–4417 (2002)）。高度保守和典型的序列基元表明SCRs属于典型SDR总科的cP2亚科，是三类NADPH依赖型亚科中的一类（Kallberg et al., Eur. J. Biochem., 269, 4409–4417 (2002)）。
氧化还原酶在不对称还原反应中有广泛的多样性，在立体特异性和底物特异性都会不同，通常被用于将各种潜手性酮、酮酸、酮酯生产有光学活性的醇。SCRs能催化2-羟基苯乙酮的（S）-特异性的还原反应，是anti-Prelog类型的反应（Manzocchi et al., J. Org. Chem., 53, 4405–4407 (1988); Prelog., Pure Appl. Chem., 9, 119–130 (1964)）。因此，这些新酶补充了所述的立体特异性氧化还原酶，是由于在催化潜手性羰基化合物生成相应的光学纯的醇的还原反应时具有anti-Prelog偏向性。此外，在Candida parapsilosis全细胞介导的立体转化的反应机制中，包含了由（R）-PED到中间体（2-羟基苯乙酮）的氧化步骤和由中间体到（S）-PED的还原步骤（Gruber et al., Adv. Synth. Catal., 348, 1789–1805 (2006)；Nie et al., Org. Process Res. Dev., 8, 246–251 (2004)；Nie et al., Appl. Environ. Microbiol., 73, 3759–3764 (2007) ；Voss et al., Angew. Chem.Int. Ed., 47, 741–745 (2008)；Voss et al., J. Am. Chem. Soc., 130, 13969–13972 (2008)），同一宿主中立体专一性羰基还原酶的发现对这一反应机制提供了意义深远的认识。值得一提的是SCR1能催化广泛酮的还原反应，包括芳香酮、脂肪酮、α-酮酯、β-酮酯、对4-氯-3-氧代丁酸乙酯有特别高的底物特异性，它是合成重要药物中间体的前体。因此，该新发现的立体专一性羰基还原酶将会是具有应用前景的有价值的酶。
具有anti-Prelog选择性的新型立体专一性羰基还原酶的发现进一步说明了微生物中立体特异性氧化还原酶的多样性。该酶在阐明酶介导的不对称反应的分子机制中蛋白和手性分子之间立体识别以及手性分子的功能基团和酶关键氨基酸残基之间电子的传递机制提供了一个基础。除了他们在立体特异性氧化还原反应机制的研究中的独特的价值以外，这些具有anti-Prelog偏向性的新型羰基还原酶在工业应用生产手性醇中有许多的潜在价值，这些手性醇可以作为精细化学合成的中间体。
在本发明的一些实施方案中，羰基还原酶能够催化2-羟基苯乙酮的不对称还原反应得到（S）-1-苯基-1,2-乙二醇（PED） （Nie et al., Appl. Environ. Microbiol., 73, 3759–3764 (2007)），它是一种药物分子，也是农用化学品和液晶材料合成中的通用的手性模块。PED也是生产手性大环聚醚二酯配体和立体选择性的高分子聚合作用的手性起始物的前体（Iwasaki et al., Org. Lett., 1, 969–972 (1999)；Liese et al.,Biotechnol. Bioeng., 51, 544–550 (1996)）。
在一些实施方案中，羰基还原酶能催化包括芳香酮、脂肪酮、α-酮酯、β-酮酯化合物在内的还原反应。在一些实施方案中，羰基还原酶能催化脂肪酮的还原反应。在一些实施方案中，羰基还原酶能催化α-酮酯的还原反应。在一些实施方案中，羰基还原酶能催化β-酮酯的还原反应。
术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及呈单链或双链形式的聚合物，由糖、磷酸和嘌呤或嘧啶碱基的单体（核苷酸）构成。除非特别限制，术语包含已知的天然核苷酸类似物，这些类似物具有与参考核酸相似的连结特性，以及与自然生成核苷酸相似的代谢方式。除非另有注明，一个特定的核酸序列也包含经保守性改造的突变体序列（例如简并密码子替换）和互补序列以及明确说明的序列。具体地，简并密码子替换可以通过生成序列来实现，在该序列上，一个或多个选择的（或全部）密码子的第三位被混合碱基和（或）脱氧肌苷残基替换。
术语“核苷酸”指DNA或RNA的聚合物，可以是单链或双链，也可以包含合成的，非天然的或改造的核苷酸碱基，能够并入到DNA或RNA聚合物中。术语“核苷酸”、“核苷酸分子”和“聚核苷酸”可以交换使用。
本发明的具体实施方案包含了由分离的或基本纯化的核苷酸组成的组分。在本发明的上下文中，“分离的”或“纯化的”DNA分子或RNA分子是从它天然的环境中分离出来的DNA分子或RNA分子，因此不是天然产物。分离的DNA分子或RNA分子可以以纯化的形式或在非天然环境中存在，例如，基因改造的宿主细胞。例如， 在通过重组技术得到“分离”或“纯化的”核苷酸分子时，基本上是不受细胞物质或培养介质的影响，在化学合成得到“分离”或“纯化的”核苷酸分子时，基本上是不受化学前体或其他化学物质的影响。在一个具体实施方案中，“分离”的核苷酸分子不会受能让微生物基因组DNA中核苷酸分子自然地形成侧翼的序列（例如，位于核酸5’和3’末端的序列）的影响，核苷酸分子也源于该微生物。
下面的术语用来描述两个或多个核苷酸分子或多聚核苷酸分子之间的序列关系：(a)“参照序列”（b）“比对窗口”，（c）“序列相似性”，（d）“序列相似百分数”，（e）“基本相似性”。
（a）本文所用的“参照序列”，是一个定义序列，被用作序列比对的基础。参照序列可以是特定序列的一个子集或者全部；例如，一个全长cDNA或基因序列的一个片段，或完全是cDNA或基因序列。
（b）本文所用的“比对窗口”涉及到一个多核苷酸的一段邻近的特定片段，其中，在比对窗口的多核苷酸序列，与参照序列（不包含添加或缺失）比对时，为了使两个序列能最佳比对，可能包含添加或缺失（例如，间隙）。一般而言，比对窗口有至少20个邻近的核苷酸，可以是30,40,50,100，或更长。相关领域的技术人员理解的是，为避免因多核苷酸序列包含的间隙导致的与参照序列高度的相似性，往往会引入空位罚分，并从匹配数中减去。
用于比较的序列比对方法在相关领域是众所周知的。因此，任意两个序列之间的相似百分数的测定是可以通过运用数学运算得到的。这种数学运算的非限制性例子是Myers和Miller（Myers and Miller, CABIOS, 4, 11 (1988)）的运算；Smith 等（Smith et al. Adv. Appl. Math., 2, 482 (1981)）及其他人的局部同源性运算；Needleman 和Wunsh（Needleman and Wunsh, JMB, 48, 443 (1970)）的同源比对运算；Pearson和Lipman（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264 (1990)）的搜索相似性方法；Karlin 和Altschul（Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)）的运算，在Karlin 和Altschul上的改造。
这些数学运算的计算机实现可以用于序列比对以测定序列相似性。实现了包括但不局限于：在PC/基因程序的CLUSTAL（从Intelligenetics, Mountaun View, Calif可得到）；wisconsin遗传学软件包（从Genetics Computer Group (GCG), 575Science Drive, Madison, Wis., USA上获得）中的ALIGN程序和GAP，BESTIFIT，BLAST，FASTA和TFASTA。运用这些程序的比对可以使用默认参数完成。Higgins et al.（Higgins et al., CABIOS, 5, 151 (1989)），Corpet et al.（Corpet et al. Nucl. Acids Res., 16, 10881 (1988)），Huang et al.（Huang et al. , CABIOS, 8, 155 (1992)）和Pearsont et al.（Pearsont et al., Meth. Mol. Biol., 24, 307 (1994)）详细描述了CLUSTAL程序。ALIGN程序是在Myer和Miller的运算基础上的。Altschul et al.的BLASTchengxu 是在Karlin和Altschul supra.（Altschul supra., JMB, 215, 403 (1990)）的运算基础上。
执行BLAST分析的软件在美国国家生物技术信息中心上是公开可用的。除了计算序列相似百分数外，BLAST运算也可以执行两个序列之间相似性的统计学分析。为得到空位比对达到比较的目的，可以使用Gapped BLAST。另外，PSI-BLAST可用于执行重叠搜索以检测分子间的距离关系。当使用BLAST，Gapped BLAST，PSI-BLAST，可使用各自程序（例如，BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质）的默认参数。
为达到本发明的目的，使用默认参数的BlastN程序（1.4.7版或更新版的）或任意相当的程序将核苷酸序列与另一个序列进行比对以检测序列相似百分数。“相当的程序”指任意序列比对程序，对于任何有疑问的两个序列，能生成具有相同的核苷酸或氨基酸残基的匹配，当比较由程序生成的相应的比对时的序列同一性的相同百分数。
（c） 正如本文中所用，上下文中的两个核苷酸或多肽序列的“序列同一性”或“同一性”涉及到一个残基的特定百分比，在通过一个特定的比对窗口为达到最大一致性进行匹配时，该残基指两个序列中相同的残基，通过序列比对运算进行测量。当序列同一性百分比涉及到蛋白质时，通常认为，不相同的残基位点与保守氨基酸替换是不同的，保守氨基酸替换是氨基酸被替换成其他具有相似的化学特性（例如，电荷或疏水性）的氨基酸，因此并没有改变分子的功能特性。当序列在保守替换不同时，序列同一性百分数会基于替换的保守特性往上调整。这种因保守性替换导致不同的序列认为具有“序列相似性”或“相似性”。做这种调整的方法对相关技术领域的技术人员是众所周知的。典型的方法包括将保守性替换作为部分错配而不是全部错配来积分，然后，再增加序列同一性的百分数。因此，例如，当时完全相同的氨基酸记作1分，非保守性替换记作0分，保守性替换就记作0到1之间的一个分数。例如，通过PC/GENE程序（Intelligenetics, Mountaun View, Calif）来实现保守替换分数的计算。
（d）本文中所用到的“序列同一性百分数”指在一个比对窗口中，通过比较两个最佳的匹配序列来测定。其中，比对窗口中的多核苷酸部分在与参照序列（不包含添加或缺失）比较时，为得到两个序列的最佳比对，可能会包含添加或缺失（也就是空位）。百分数的计算是通过测定两个序列上具有相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到位置匹配数，然后将位置匹配数除以比对窗口中的位置总数，结果乘以100得到序列同一性的百分数。
（e）（i）术语多核苷酸序列的“基本同一性”指，多核苷酸序列包含的序列，通过使用所描述的比对程序中的一种并且使用标准参数，和参照序列比对有至少70%，71%，72%，73%，74%，75%，76%，77%，78%，79%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%或94%甚至至少95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性。相关领域的技术人员将会确认，这些数值会做适当的调整以测定两个核苷酸序列编码的蛋白相应的同一性，通过考虑密码子简并性，氨基酸相似性，开放阅读框架位置等类似的东西。一般目的性的氨基酸序列基本同一性指至少70%，80%，90%或甚至至少95%的序列同一性。
另外，还指明，如果在严格条件下，两个分子能彼此杂交，就说明核苷酸序列是基本上相同的。一般而言，严格条件指，在确定的离子强度和pH下，较特定序列的热解链温度低约5℃的条件。然而，严格条件包括的温度是在1℃到20℃范围内，主要是依据需求的严格性等级而定，在本文中有另外的限定。在严格条件下不能彼此杂交的核酸仍然是基本同一的，只要它们编码的多肽是基本同一的。这也会发生，例如，使用经遗传密码允许的最大密码子简并程度而形成的一个核酸的拷贝的情况。另外还表明，当第一个核酸编码的多肽能与第二个核酸编码的多肽发生免疫性的交叉反应时，那么这两个核酸序列是基本同一的。
（e）（ii）上下文中术语一个肽的“基本同一性”指，一个肽包含的氨基酸序列，在特定的比对窗口，与对照序列有至少70%，71%，72%，73%，74%，75%，76%，77%，78%，79%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%或94%甚至至少95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性。在具体实施方案中，最佳比对是通过Needle和Wunsch（Needle and Wunsch,JMB,48,443(1970)）的同源比对运算执行的。一个肽能和抗体，对第二个肽而言，发生免疫性交叉反应，就说明两个肽序列是基本同一的。因此，第一个肽与第二个肽是基本同一的，例如，仅由保守性替换引起的两个肽的不同。因此，本发明的具体实施方案提出了与本文所述的氨基酸序列基本同一的氨基酸序列。
用于序列比较时，典型的是，一个序列是作为参照序列，检测序列是要与其比较的。
当用序列比对运算时，检测序列和参照序列要输入电脑，如果需要的话设计亚序列同等序列，序列运算程序的参数是指定的。基于指定的程序参数，序列比对运算计算出检测序列，相对于参照序列的序列同一性百分数。
上述提到的另外能表明两个核苷酸序列是基本同一的是两个分子能在严格条件下彼此杂交。术语“特异杂交”指当序列处在DNA或RNA的混合物（例如，全细胞）中，并在严格条件下，一个分子与另一个特定的核苷酸序列的结合，双螺旋或杂交。“基本结合”指探针核苷酸与靶核苷酸之间的互补杂交，包含较小的错配，可通过降低杂交介质的严格性调解，完成对靶核苷酸序列所需的检测。
核苷酸杂交实验上下文中的术语“严格的杂交条件”和“严格的杂交漂洗条件”例如Southern和Northern杂交是序列依赖性的，在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。热解链温度（Tm）指在此温度（并处于确定的离子强度和pH）下，50%的靶核苷酸序列与完全匹配的探针杂交。特异性是杂交后漂洗的典型功能，关键因素是最后漂洗溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，Tm可以根据Meinkoth和Wahl(1984)等式粗略估计；Tm81.5℃+16.6（logM）+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L;其中，M是一价阳离子的摩尔浓度，%GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶的百分数，%form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，L是碱基对杂交的长度。每有1%的错配，Tm就下降1℃，因此，Tm，杂交和(或)漂洗条件可以调整到与所需同一性的序列杂交。例如，如果寻找>90%同一性的序列，Tm可以降低10℃。一般而言，在确定的离子强度和pH,严格条件选择较特异性序列和其互补物低约5℃。然而，极其严格条件是将杂交和（或）漂洗较Tm，低1,2,3或4℃。中等严格条件是将杂交和（或）漂洗较Tm，低6,7,8,9或10℃。低等严格条件是将杂交和（或）漂洗较Tm，低11,12,13,14,15或20℃。在使用等式时，杂交和漂洗组分，所需的文帝，普通的技术人员都会懂得，杂交和（或）漂洗溶剂严格性的多样性是有固有描述的。如果错配结果所需的等级是低于45℃（溶剂）或32℃(甲酰胺复合增塑剂溶液)的温度条件,就要增加SSC的浓度，才能得到较高的温度。一般而言，在确定的离子强度和pH条件下，高度的严格杂交和漂洗条件选择较特异性序列的Tm低约5℃。
一个高度严格漂洗的例子，条件是0.15M NaCl，并在72℃下约15分钟。一个严格漂洗的例子，条件是0.2 x SSC，在65℃下漂洗约15分钟。通常，高度严格漂洗之前先进行低度严格漂洗以去除背景探针信号。一个双螺旋中度严格漂洗的例子，例如，双螺旋有超过100个核苷酸，条件是1x SSC，在45℃下漂洗约15分钟。对短核苷酸序列（例如，约10-50个核苷酸），典型的严格条件包括低于1.5M的盐浓度，约低0.01-1.0M，Na离子浓度（或其他盐）在pH7.0到8.3，典型的温度至少30℃，长探针（例如，>50核苷酸）至少60℃。可通过加去稳剂，例如甲酰胺，达到严格条件。一般而言，在特定的杂交检测中，2 x （或更高）的噪声比信号而非无关探针检测的信号能说明一个特异性杂交的检测。不能彼此杂交的核苷酸，如果它们编码的担保具有基本同一性，在严格条件下仍然是基本同一的。这种情况也会发生，例如，使用经遗传密码允许的最大程度简并密码子生成一个核苷酸的拷贝的情况。
对一个特定的探针，非常严格的条件选择与Tm相当的条件。一个例子，多于100互补残基的互补核苷酸在Southern 或Northern blot过滤器上的杂交严格条件是，50%甲酰胺，例如，杂交是在50%甲酰胺，1M NaCl,1 %的SDS，37℃。漂洗是在0.1 x SSC 60-65℃。典型的低严格条件包括，在包含了30-35%甲酰胺，1M NaCl, 1 %的SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲液及37℃下杂交，漂洗是在1 x- 2 x SSC（20x SSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠） 50-55℃。典型的中等严格条件包括，在40-45%甲酰胺，1.0M NaCl, 1 %的SDS及37℃下杂交，漂洗是在0.5x- 1x SSC，55-60℃。
除了严格条件的化学优化外，分析模型和运算可应用于杂交数据的设定（例如，微阵列数据）以提高严格性。
将通过下面非限制性的具体实施方案对本发明进行阐述
具体实施方案1 Anti-Prelog立体专一性羰基还原酶
已发现了近平滑假丝酵母Candida parapsilosis 中960kb大小的重叠序列群005802上的三个开放阅读框架（ORFs）。这些ORFs编码了立体专一性羰基还原酶基因（scr1，scr2，scr3）。这些ORFs已被克隆和表达，编码蛋白被纯化为同质体，并被证实具有立体专一性羰基还原酶的功能（SCR1，SCR2，SCR3）。
假定立体专一性羰基还原酶编码基因的鉴定。编码推测立体专一性羰基还原酶（SCRs）的三个ORFs，就是scr1、scr2、scr3已经过鉴定。图.1所示，三个ORFs和cpadh基因，位于Candida parapsilosis基因组的960kb大小的邻近片段005802上。scr1,scr2,scr3基因包含了846,840，840bp，编码了281,279，279，个氨基酸残基的多肽，经计算后的分子量分别为30061,29993,30097Da。这四个ORFs的多序列比对（图.2），即使了CPADH和SCR1之间高序列同一性（68%），SCR2（88%），SCR3（84%）。在SCR1，SCR2，SCR3中同样发现了短链脱氢/还原酶（SDR）总可催化结构域的关键活性位点残基，包括了辅酶结合片段Gly-X-X-X-Gly-X-Gly（X代表任意氨基酸；SEQ ID NO:9），催化三联体Ser-Tyr-Lys（SEQ ID NO:11）。
立体专一性羰基还原酶（SCRs）的克隆，表达，纯化。 scr1、scr2和scr3，来自ORFs的核苷酸序列，通过对Candida parapsilosisCCTCCM203011基因组DNA PCR扩增，PCR产物通过不使用连接酶克隆方式插入到pET21c载体中，构建重组质粒。这三个质粒pET21-SCR1，pET21-SCR2，pET21-SCR3，转化到表达宿主E.coliBL21(DE3)pMgK细胞中，重组体SCR1，SCR2，SCR3，包含有C端His6标签，作为融合蛋白在E.coli中表达。三个重组酶都高水平表达。其中，SCR1，SCR3是可溶性表达，产量分别为50mg/l发酵液，46 mg/l发酵液，SCR2是相对较低的可溶性表达，产量为5mg/l发酵液（图.3）。
通过SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色的判断，三个重组酶经凝胶过滤层析和Ni亲和层析纯化后呈均一性（图.4）。通过分析凝胶过滤和静态光散射，使用相同的低盐缓冲液，测定SCR1，SCR3的相对分子量为124.6KDa，123.4KDa，但是，SCR2检测到的是聚合体形式。基于它们氨基酸序列组成，重组酶单体的相对分子量应该是在30 KDa左右，这些结果表明，SCR1，SCR3都有四聚体结构。
重组体SCRs的催化特性。SCR1，SCR2，SCR3的酶活性是通过检测2-羟基苯乙酮的还原反应。在检测条件下，SCR1有最高的特异性活性，5.16μmol/min mg蛋白，SCR2催化活性4.23μmol/min mg蛋白，SCR2的特异性活性较低，1.55μmol/min mg蛋白。此外，SCRs都在以NADPH为辅酶时有催化活性，以NADPH为辅酶时催化活性较低，说明这三个酶都是NADPH依赖型的氧化还原酶。
因为环境pH值对酶反应的立体化学性有影响，因此，也检测了反应pH对SCRs催化2-羟基苯乙酮还原反应活性的影响。三个酶在pH5.0到6.0范围内都表现出最高活性。随后，在各自最佳pH条件下鉴定了酶，通过作双倒数作图法测定了表观动力学参数，固定NADPH浓度，2-羟基苯乙酮浓度不同。如表1所示，2-羟基苯乙酮的还原反应，三个酶的动力学参数不同。数值是三个独立实验的平均值。
 表1. SCR1，SCR2，SCR3，CPADH在以NADPH为辅酶时，还原2-羟基苯乙酮的活性和动力学参数
                                                 
Figure 159004DEST_PATH_IMAGE001
。  
a 活性的检测是在每个酶的最佳pH测定。
 潜手性羰基的立体选择性。2-羟基苯乙酮为底物时，SCR1，SCR2，SCR3各自生成（S）-对映体（>99%e.e.）光学纯的苯基乙二醇(图.6)。这三个酶能催化不对称还原潜手性羰基化合物，对2-羟基苯乙酮时都是（S）-特异性羰基还原酶。其中，然而，SCR2的效率不如其他两个酶，对应于较低的活性。
这些数据表明SCR1，SCR2，SCR3是anti-Prelog型立体专一性羰基还原酶（Manzocchi et al., J. Org. Chem., 53, 4405–4407 (1988)；Nie et al., Appl. Environ. Microbiol., 73, 3759–3764 (2007) ；Prelog, Pure Appl. Chem., 9, 119–130 (1964)）。
底物专一性。因为SCR1，SCR3有与众不同的（S）-特异性羰基还原活性，进一步测定了这两个酶对多种羰基化合物的底物特异性，包括了芳香酮，脂肪酮，α-酮酯，β-酮酯。如图.7所示，一方面，两个酶对酮酯的活性要高于烷基酮和芳香酮；另一方面，酶对烷基酮和芳香酮的特异性具有各自的多样性。对取代的苯乙酮衍生物和2-羟基苯乙酮衍生物，在苯环不同的位置有氯，甲基，邻位取代的底物，对酶来说是活性差的底物，表明邻位取代可能对从电子供体NADPH到羰基的H攻击有空间影响，显著的影响了酶的活性。然而，SCR3对p-Cl-2-羟基苯乙酮特异性更高，而SCR1对m-Cl-2-羟基苯乙酮特异性更高。就酮酯类而言，酶对校基团的底物都有高的活性，相比SCR3，SCR1对大部分有苯环的酮酯活性较高，一般，对β-酮酯活性更高。值得提出的是，在所有检测的β-酮酯中，SCR1还原4-氯-3-氧代丁酸乙酯的活性最高，生成4-氯-3-羟基丁酸乙酯，是重要的药物中间体（Thayer, Chem. Eng. News, 84, 26–27 (2006)）。
材料和方法
材料。Candida parapsilosis CCTCCM203011是从中国典型培养物保藏中心（CCTCC，中国武汉）获得。大肠杆菌X-gold细胞用于基因的克隆和质粒制备，E.coliBL21(DE3) pMgK感受态细胞，一个稀缺密码子加强型菌株，用于基因的表达。高保真PCR试剂盒包含了从FINNZUMES（芬兰）购买的DNA聚合酶。质粒pET21c是从Noagen（美国）购买的。（R）-和(S)-苯基乙二醇，所有脂肪酮和酮酯，芳香酮，包括苯乙酮及其衍生物，2-羟基苯乙酮，苯丙酮，丁酰苯，苯戊酮，正己酰苯，包括NAD(P)H和NAD(P)+的辅酶购于Sigma-Aldrich(美国)。所有其他2-羟基苯乙酮，m-Cl-2-羟基苯乙酮，p-Cl-2-羟基苯乙酮, p-CH3O-2-羟基苯乙酮通过Itsuno（Itsuno et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2039–2044 (1985)）所述的方法制备。本工作中所用的其他化学品是分析等级，商业可售。
编码立体专一性羰基还原酶基因的克隆和表达。编码SCR1，SCR2，SCR3的基因是通过聚合酶链式反应自Candida parapsilosis基因组DNA中扩增得到。PCR扩增DNA产物通过QLAquickPCR纯化试剂盒（QIAGEN，美国）纯化，使用In-Fusion PCR克隆试剂盒，并通过无连接酶克隆方式插入到表达载体pET21c上，该试剂盒用于重组质粒的构建。反应混合物用于大肠杆菌X-gold细胞的转化。从重组体分离的质粒通过DNA序列分析确定，使用BigDye末端循环测序试剂盒和ABIPRISM310Genetic 分析仪（应用生物系统，美国）。有正确插入子的质粒，pET21-SCR1，pET21-SCR2，pET21-SCR3，转化到E.coliBL21(DE3)pMgK感受态细胞中，以生产SCRs。这些能提供SCRs的质粒在C端由6个组氨酸融合标签。
E.coliBL21(DE3)pMgK转化子在37℃，含有氨苄青霉素（100μg/ml）和卡那霉素（50μg/ml）的LB培养基中培养，当培养物的光学密度在600nm下达到0.6时，温度改变为17℃，并向培养物中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，至终浓度为1mM，诱导基因表达。在17℃下另外培养20h后，离心收集的细胞通过超声波破碎，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的表达。
重组酶的纯化。细胞在结合缓冲液（20mMTris-HCl, pH7.5,0.3M NaCl,40mM咪唑，1 蛋白酶抑制剂，1 mMTris（2-羧乙基）磷化氢（TCEP））中悬浮，并通过超声波在冰上破碎。细胞裂解产物的上清液通过4℃,26000xg离心40分钟收集，并通过AKTAxpress系统纯化，使用Superdex 凝胶过滤柱（GE Healthcare,USA），HisTrap HP亲和柱,纯化组分交换到低盐缓冲液（10mMTris-HCl, pH7.5, 0.1M NaCl,0.02%NaN3，5Mm D,L-二硫苏糖醇）（Acton et al., Methods Enzymol., 394, 210–243 (2005)）。最终重组酶在12%聚丙烯酰胺凝胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳上是明显同一的。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（应用生物系统，美国）测定它们的分子量，通过分析凝胶过滤，使用静态光散射（Wyatt Thechnology, 美国），安捷伦科技公司1200 高效液相色谱检测它们的寡聚态。纯酶SCRs的制备在本研究的所有实验中都有用到。
酶活检测。羰基还原酶的活性是通过连续性的分光光度计测量的，以2-羟基苯乙酮为底物。酶活的一个单位定义为，在检测条件下，每分钟催化氧化1μmolNAD(P)H所需的酶量。酶活性的标准检测溶液为0.1M 磷酸钾缓冲液（pH6.5），0.3mM NAD(P)H，0.7mM 2-羟基苯乙酮以及适当的酶液，总体积为100μl。辅酶减少的量通过340nm下分光光度计测量的（消光系数[ε]=6.22 mM-1cm-1）。蛋白浓度通过Bradford reagent（Bio-Rad）检测, 以牛血清白蛋白作为标准。酶活性pH依赖性通过检测4.0到8.5范围的pH，使用以下缓冲液：0.1M醋酸盐（pH4.0到6.0），0.1M磷酸钠（pH6.0到8.0），0.1M Tris-HCl（pH8.0到8.5）。
SCRs的底物特异性是在上述的同样条件下检测的，各种羰基化合物包括芳香酮，脂肪酮，α-酮酯，β-酮酯都作为底物，且辅因子为NADPH。
不对称还原和立体特异性检测。纯酶对2-羟基苯乙酮的不对称还原反应在30℃，6h条件下振荡，反应液包含了0.1M 磷酸钾缓冲液（pH6.5），1g/L 2-羟基苯乙酮，NADPH（7mM），0.5mg的纯酶，总体积为0.5ml。反应产物使用乙酸乙酯提取，有机相用于检测。反应产物的光学纯度通过高效液相色谱分析，使用手性OB-H柱（4.6 mm×25 cm; 日本 Daicel Chemical 公司），对映异构体用正己烷和异丙醇（9 : 1）以0.5 mL min-1的流速洗脱。流出物在215 nm下检测，对每个峰的面积进行整（Nie et al., Org. Process Res. Dev., 8, 246–251 (2004)）。
核酸序列登录号。立体专一性羰基还原酶基因scr1,scr2,scr3已经在基因库中保存，登录号分别为FJ939565（SEQ ID NO:8）, FJ939563（SEQ ID NO:7）, FJ939564（SEQ ID NO:6）。
 本文中引用的所有出版物，专利，专利应用都包含在参考文献中。在之前的详述中，本发明对其中相关的具体实施方案进行了描述，为说明阐述了许多细节，相关领域的技术人员将会清楚本发明容易受额外的试试方案的影响，并且脱离了本发明的基本规定，在此描述的特定细节将会有很大的不同。
描述本发明上下文中的术语“一”、“一个”、“这”相似的指示对象用于概括单数或复数，除非本文中其他的指定或上下文中清楚的否定。除非有其他说明，术语“包含”、“有”、“包含”和“包括”是无限制的术语（也就是，“包括，但不限定”）。本文中数值的详述范围仅仅是想要作为一种对属于该范围的每个独立值单独的速记方法，除非本文中其他的说明，每个独立值，如果被单独的列举时是并入到详述中的。本文中描述的所有方法可以以任意的顺序实施，除非本文中有其他说明，或上下文中有其他明确的否定。任何或全部例子的使用，或典型语言的使用（举例说，“例如”）仅仅是更好的阐述本发明，并没有对本发明的范围提出限制除非有其他的要求。详述中没有语言需要翻译，也就是任何非要求因素对本发明的实施是必需的。
文中描述了本发明的实施方案，包括了以本发明人知道的最佳方式来实施本发明。了解了之前详述的相关领域一般技术人员将会清楚这些实施方案的变化。发明人希望熟练的技术人员适当的应用这些变化，发明人希望发明能有与本文特异性描述不同的应用。此外，本发明包含了要求中列举的事物的修正和相当物，该要求经过适用法律的允许，已附上。而且，上述因素在所有可能的变化中的任意的结合都包含在本发明中，除非文中其他的说明或文中其他清楚的否定。
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Claims (43)

1.一种纯化的多肽，其序列包含了与近平滑假丝酵母Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶具有至少70%同一性的氨基酸序列，所述多肽具有羰基还原酶的活性，并且不包括SEQ ID NO:1。
2.要求1中纯化的多肽，其氨基酸序列与以SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4为代表的近平滑假丝酵母Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶中的至少一个具有至少70%同一性。
3.要求2中纯化的多肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO:2有至少70%同一性。
4.要求2中纯化的多肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO:3有至少70%同一性。
5.要求2中纯化的多肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO:4有至少70%同一性。
6.1-5任一要求中纯化的多肽，其中氨基酸序列与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶有至少75%同一性。
7.要求6中纯化的多肽，其中氨基酸序列与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶有至少80%同一性。
8.要求7中纯化的多肽，其中氨基酸序列与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶有至少85%同一性。
9.要求8中纯化的多肽，其中氨基酸序列与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶有至少90%同一性。
10.要求9中纯化的多肽，其中氨基酸序列与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶有至少95%同一性。
11.要求10中纯化的多肽，其中氨基酸序列与Candida parapsilosis立体专一性羰基还原酶有至少99%同一性。
12.1-11任一要求中纯化的多肽，其中氨基酸序列包含了SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。
13.1-11任一要求中纯化的多肽，其中氨基酸序列包含了SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。
14.1-13任一要求中纯化的多肽，其中氨基酸序列包含了SEQ ID NO:2。
15.1-13任一要求中纯化的多肽，其中氨基酸序列包含了SEQ ID NO:3。
16.1-13任一要求中纯化的多肽，其中氨基酸序列包含了SEQ ID NO:4。
17.1-16任一要求中纯化的多肽，其中多肽的羰基还原酶活性是NADPH依赖型的。
18.1-17任一要求中纯化的多肽，其中多肽是anti-Prelog-type立体专一性羰基还原酶。
19.一个包含了1-18任一要求中纯化的多肽的组分。
20.一个分离的核苷酸序列包含了编码1-18任一要求中多肽的序列。
21.要求20分离的核苷酸，其中序列包含了SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:6的简并变异。
22.要求20分离的核苷酸，其中序列包含了SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:7的简并变异。
23.要求20分离的核苷酸，其中序列包含了SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的简并变异。
24.要求20分离的核苷酸，其中序列编码了SEQ ID NO:2。
25.要求20分离的核苷酸，其中序列编码了SEQ ID NO:3。
26.要求20分离的核苷酸，其中序列编码了SEQ ID NO:4。
27.表达载体包含了一个表达序列组件，可操作性的连接到20-26任一要求的核苷酸分子上。
28.宿主细胞包含了要求27的载体。
29.还原羰基底物的方法，包括了任一要种1-18或要求19的组分的纯化多肽与底物的相互作用，在适合催化还原羰基底物的条件下。
30.要求29的方法，其中还原反应需要辅酶。
31.要求30的方法，其中辅酶是NADPH。
32.29-31任一要求的方法，其中羰基底物包括α-酮酯，β-酮酯，芳香酮或脂肪酮。
33.要求32的方法，其中羰基底物包括α-酮酯。
34.要求33的方法，其中α-酮酯是丙酮酸甲酯，苯甲酰甲酸甲酯，丙酮酸乙酯或苯甲酰甲酸乙酯。
35.要求32的方法，其中羰基底物包括β-酮酯。
36.要求35的方法，其中β-酮酯是三氟乙酰乙酸乙酯，乙酰乙酸甲酯，3-氧代戊酸甲酯，4-氟苯甲酰乙酸甲酯，乙酰乙酸乙酯，3-氧代戊酸乙酯，4-氯乙酰乙酸乙酯，苯甲酰乙酸乙酯或3,4-二甲氧基苯甲酰乙酸乙酯。
37.要求32的方法，其中羰基底物包括芳香酮。
38.要求37的方法，其中芳香酮是2-羟基苯乙酮或它的衍生物。
39.要求38的方法，其中芳香酮是2-氯-2-羟基苯乙酮，3-氯-2-羟基苯乙酮，4-氯-2-羟基苯乙酮或4-甲氧基-2-羟基苯乙酮。
40.要求32的方法，其中羰基底物包括脂肪酮。
41.要求40的方法，脂肪酮是2-丁酮，2-戊酮，2-己酮，2-庚酮，2-辛酮或2-甲基-3-戊酮。
42.要求29的方法，羰基底物为4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
43.要求29-42中任一要求的方法，还原反应的pH范围为从5.0到6.0。
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