CN102481368B - 包含电磁辐射的酵母的治疗神经变性疾病或病症的组合物、方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含酵母细胞的组合物，所述酵母细胞用30GHz-300GHz范围内的电磁波处理，或生长自用30GHz-300GHz范围内的电磁波处理的酵母细胞。所述组合物可以用于治疗神经变性疾病或病症。本发明还提供了与该组合物相关的方法。

Description

包含电磁辐射的酵母的治疗神经变性疾病或病症的组合物、方法和用途
技术领域
本发明涉及用于治疗神经变性疾病或病症(neurodegenerative diseasesor disorders)的组合物，此类组合物的用途以及用于产生此类组合物的方法。
背景
神经变性疾病或病症是其中脑和脊髓的细胞损失的状态。脑和脊髓由执行不同功能的神经元构成。此类功能可以是控制运动，处理感觉的信息或做出决定。脑和脊髓的细胞不容易再生，所以过度损伤可能是不可逆的。神经变性疾病由神经元或它们的髓鞘的恶化导致，经过一段时间，其将导致机能障碍或不同类型的疾病或病症。
凋亡是这样的现象，在神经系统发育过程中，其开始在神经组织中出现，阻止损伤组织伤害器官中的完整细胞。在凋亡过程中，细胞发生一系列的形态变化，其包括细胞皱缩、染色质凝聚、DNA片段化等。凋亡控制的机能障碍导致过度的细胞死亡，例如在帕金森病(Parkinson′s disease)和阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)中。
神经变性疾病或病症的初始治疗依赖于具体疾病或病症的诊断和进展。目前本领域已知很少用于存在的广泛范围的神经变性疾病或病症的疗法。
对于帕金森病，用L-二羟基-苯基-丙氨酸(L-多巴；左旋多巴(levodopa))治疗能够短时间抑制症状，但是然后导致症状的加速。也努力开发将认知功能稳定在初始诊断时存在的水平的用于阿尔茨海默病的疗法。其它神经变性疾病或病症，诸如肌萎缩性侧索硬化(amyotrophiclateral sclerosis，ALS)或2型糖尿病(Diabetes Mellitus type 2)相关的病况类似。然而，这些疗法常常具有有限的效果、昂贵并且可与严重的副作用相关。它们也不是预防性的。
因此，存在允许改善治疗或预防神经变性疾病或病症的新方法和组合物的需要。
概述
因此，本发明意欲缓和、减轻或消除一种或多种上述缺陷，并且提供对所提及的类型的改善的治疗，特别是其中使用的组合物。
为此目的，在第一方面，提供包含酵母细胞的组合物，所述酵母细胞用30GHz至300GHz范围内的电磁波处理，或生长自用30GHz至300GHz范围内的电磁波处理的酵母细胞，所述组合物用于治疗或预防神经变性疾病或病症。
本发明组合物的一个优点是其允许对神经变性疾病或病症的改善的和成本有效性的治疗。
在第二方面，提供用于制备根据第一方面所述的组合物的方法。所述方法包括以下步骤：制备生长培养基，灭菌或巴氏灭菌所述生长培养基，在所述生长培养基中生长酵母细胞和用电磁波处理所述酵母细胞，其中所述电磁波的范围为30GHz至300GHz。
本发明更多的有益特征及其实施方案在所附的权利要求书和详细描述中定义。
附图简述
参照附图，从下述对本发明的示例性实施方案的描述，本发明的这些和其它方面、特征和优点将是明显的，在所述附图中：
图1A是显示未处理的酵母细胞的生长曲线的图，图1B是显示根据一个实施方案的处理的细胞的生长曲线的图；
图2公开了实验仪器的插图。图2A是侧视图，图2B是正视图；
图3是显示用于测试本发明的小鼠的纹状体中DA含量的图；
图4是这样的图，其分别显示不同时间的行动、站起(rearing)和总活动的均值和SD值；
图5是分别显示行动、站起和总活动的均值和SD值的图；和
图6-15是显示研究的不同结果的图。
详细描述
由于M.B.Golant等的开创性工作，在20世纪60年代中期由俄国起源，开始了在非传统领域，如医学、生物学和生物技术中使用低强度电磁毫米波的趋势。毫米波是具有极高频率的电磁波，所以称为EHF-波。频率范围在约30GHz至约300GHz。这些波被水和其它含水介质大量吸收，对生物生物体具有多种效果。组织中EHF辐射的穿透深度仅是毫米的部分。同时，使用活生物体进行的直接实验表明EHF对活体表面的影响也影响位于远离暴露于辐射位点的组织。
数个实验研究表明在细胞和模式系统中低强度毫米波对化学、生物化学和代谢过程的影响。例如，已经显示毫米波加速Na+-离子的主动运输，影响脂膜的传导性，刺激细胞中ATP的合成。EHF范围的波被认为是生物体自身调节系统用于恢复受干扰的功能和维持稳态的主要工具。在俄国，已经有多于2 000 000名患者通过EHF疗法治疗，并且已经显示其有效抵抗例如胃肠道的疾病和症状。此外，因为EHF疗法减少应激且缓解疼痛，EHF疗法可用作药物和其它类型辐射治疗的补充。
EHF波被细胞膜相关的长效蛋白结构形成的谐振电路促进。这种促进的发生以获自于细胞代谢的能量为代价。
细胞膜是包含蛋白的脂双层。其也是极化的，这意味着在膜的外表面和内表面之间存在电势。正常细胞功能的各种偏差总是伴随出现细胞膜中的电不对称性。声波沿膜的传播导致通过泊松因子(Poisson factor)测量的膜厚度的周期性变化。膜厚度变化的空间周期等于声波的波长。在极化电介质膜中厚度的此类变化伴随电场的变化，其与声波具有同样的时间和空间周期。细胞膜中的这些波因此被称为声-电波。
活生物体在它们的膜中本身产生EHF信号。然而，在具有对称电分布和正常功能的细胞中，没有理由产生特定谐振频率。但是如果这些信号发生，它们能够通过生物体的细胞团发送，扩展外部辐射的效应。EHF辐射被生物体自身用于恢复。这种恢复通过精确的控制论系统特别地进行组织，该系统管理恢复过程和生物体稳态的维持。生物体的所有细胞、器官和系统的信息系统参与这种系统的功能，并且生物体所有成分的恢复过程被反映所发生的干扰的特性的自身信号控制。
细胞中的谐振波也来自于外部EHF辐射。因而外部EHF辐射能够被转化成谐振波，细胞自身产生的内部EHF波，用于恢复的目的。细胞自身能够在没有外部EHF刺激时完成电对称性的复原。然而，如果细胞被以任何方式压制，天然复原可能缓慢或从不发生。在这些情况下，EHF辐射能够用于加速复原。这是通过EHF辐射治疗的原因，但是在外部技术装置的帮助下不可能产生精确的信号组，人们可以诱导内部EHF信号。例如，人由多达1013个细胞组成，每个具有产生个体信号系统的潜能，使其再生将是不可能的。然而，如果用外部信号处理细胞，生物体的细胞、器官和功能的信息系统将这些信号转化成协调的内部EHF声-电波，所述波对应于这些细胞本身恢复的天然机制。
由于此类转化，外部EHF辐射有助于生物体恢复必需信号的形成。膜中电对称性的复原导致产生声-电波的机制终止。因此，细胞膜中出现的暂时蛋白亚结构在功能正常化之后逐渐消失。
细胞中有多于上千种不同类型的蛋白分子的谐振频率波段与EHF波段重叠。此类分子的两极振荡导致EHF波，其以取自细胞代谢的能量为代价。已经显示在电分布大的膜区所述蛋白形成集成物。因而，位于膜表面的蛋白能够提供振幅振荡，产生声-电波。
另外，由于所述波不能通过自由空间传播，其中振荡相互同相的集成物作为天线栅格工作，发送信号至相邻细胞。因此，EHF辐射在活生物体中触发的机制似乎基于协调EHF振荡刺激导致的细胞间和细胞内恢复过程的同步化，即，EHF辐射的效应增加了多细胞系统中的阻抗。在例如人体中的血液和淋巴系统中循环的细胞能够进一步传播EHF波，因为它们不停地与邻居交换EHF振荡。
已经令人吃惊地发现，包含酵母细胞的组合物有效用于治疗或预防神经变性疾病或病症，所述酵母细胞用范围在30GHz至300GHz的电磁波处理，或所述酵母细胞生长自用范围在30GHz至300GHz的电磁波处理的酵母细胞(因此称为处理的酵母细胞或处理的酵母)。所述组合物的一个优点是其允许对神经变性疾病或病症的改善的和成本有效性的治疗。
电磁波可用本领域已知的任何电子或光装置递送。电磁波可具有低于1mW/cm2，如约0.1mW/cm2的功率密度。
在一个实施方案中，振荡频率在约35至约65GHz的范围内。电磁波可用本领域已知的任何电子或光装置递送。电磁波可具有低于1mW/cm2，如约0.1mW/cm2的功率密度。
在一个实施方案中，振荡频率选自由下列各项组成的组：40GHz，41GHz，42GHz，43GHz，44GHz，45GHz，46GHz，47GHz，48GHz，49GHz，50GHz，51GHz，52GHz，53GHz，54GHz或55GHz。电磁波可用本领域已知的任何电子或光装置递送。电磁波可具有低于1mW/cm2，如约0.1mW/cm2的功率密度。在一个实施方案中，振荡频率为42194±10MHz，并在围绕这种频率的100MHz波段内线性调制。电磁波可用本领域已知的任何电子或光装置递送。电磁波可具有低于1mW/cm2，如约0.1mW/cm2的功率密度。在一个实施方案中，振荡频率为53534±10MHz，并在围绕这种频率的50MHz波段内线性调制。电磁波可用本领域已知的任何电子或光装置递送。电磁波可具有低于1mW/cm2，如约0.1mW/cm2的功率密度。
在一个实施方案中，所述酵母细胞是酵母属(Sacharomyces)的，如选自包括卡尔斯伯酵母(Sacharomyces carlsbergesis)或酿酒酵母(Sacharomycescerevisiae)的组。这样的一个优点是此类酵母可以容易地低成本获得。
神经变性疾病或病症通常由神经细胞或多或少选择性地进行性损失导致。随着疾病进展，神经细胞的进行性损失可能加速。
根据可塑性原理，每个神经细胞在给予正确的条件下都具有自我修复的能力。此类条件可以是身体的或生活方式的因素。例如，本领域熟知体育锻炼可帮助延缓神经变性疾病或病症的进展。
通常，体育锻炼已经显示在刺激神经组织中的营养因子(所谓的神经营养因子)中具有重要作用。一种此类因子是脑源性神经营养因子(BDNF)。已经显示体育锻炼增加BDNF的水平。根据本发明人的一个非限制性理论，假定处理的酵母细胞结合体育锻炼诱导进一步增加BDNF水平的超-刺激。然后，增加水平的BDNF作为神经组织复原和修复动员的基础。由于结合体育锻炼和酵母化合物的增加的可塑性，据假定其提供协同作用，降低神经变性病况的进展。
已经显示BDNF的水平特异性影响许多神经变性病况(如帕金森病，阿尔茨海默病和ALS)的进展。2型糖尿病的神经变性效应也被BDNF的不平衡影响。
在一个实施方案中，所述神经变性疾病或病症是帕金森病。
在一个实施方案中，所述神经变性疾病或病症是阿尔茨海默病。
在一个实施方案中，所述神经变性疾病或病症是肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
在一个实施方案中，所述神经变性疾病或病症是2型糖尿病。
在一个实施方案中，所述治疗是口服治疗，例如以麦芽饮料或以包含处理的酵母的任何类型饮料的形式。
另外，处理的酵母可以任何适当的形式分发给受试者。受试者可以是任意哺乳动物，如例如人。因而EHF能量以通过EHF辐射外部刺激的处理的酵母的形式转移到受治疗的受试者中。
一方面，所述组合物可通过包括下述步骤的方法获得：制备生长培养基；灭菌或巴氏灭菌所述生长培养基；在所述生长培养基中生长酵母细胞；和用电磁波处理所述酵母，其中所述电磁波的范围为30GHz至300GHz。
在一个实施方案中，电磁波的范围在约35至约65GHz的范围内：如40GHz，41GHz，42GHz，42.2GHz，43GHz，44GHz，45GHz，46GHz，47GHz，48GHz，49GHz，50GHz，51GHz，52GHz，53GHz，54GHz或55GHz。在一个实施方案中，振荡频率为42194±10MHz，并且在围绕这种频率的100MHz波段内线性调制。在一个实施方案中，振荡频率是53534±10MHz，并且在围绕这种频率的50MHz波段内线性调制。电磁波可用本领域已知的任何电子或光装置(如基于IMPATT二极管振荡器的YAV-1治疗装置)递送。电磁波可具有低于1mW/cm2，如0.004mW/cm2和0.2mW/cm2之间，例如约0.1mW/cm2的功率密度。
EHF治疗的效果显示于图1中。
图1A是未处理细胞的生长曲线。N/N0(Y轴)是培养物中细胞数目N与起始数目N0的比率，t(以小时为单位，X轴)是培养-发育时间。图1B是处理的细胞的生长曲线。细胞产生的振荡的频率可通过细胞信息结构的相应重排同步化，其导致单个细胞分裂周期持续时间中的差别被实际上消除，产生生长曲线上的“阶梯”。从图1B中明显的是每个分裂周期之后，细胞数目同步加倍，从而细胞数目对时间的相关性表示为阶梯曲线。
表1是用辐射频率42.2GHz在不同功率密度水平(P，mW/cm2)同步所有细胞的细胞分裂所需最小时间(t0，min)的概况。
表1
  t0，min   P，mW/cm2
  126   0.005
  103   0.009
  81   0.015
  60   0.026
  49   0.040
  38   0.077
  36   0.130
  34   0.209
表2是用辐射频率42.2GHz在不同功率密度水平(P，mW/cm2)同步15％的细胞的细胞分裂所需时间(t0，min)的概况。
表2
  t0，min   P，mW/cm2
  111   0.003
  86   0.006
  65   0.012
  45   0.024
  38   0.037
  33   0.052
  31   0.074
  27   0.130
  26   0.200
因此，在一个实施方案中，EHF处理时间在20和120分钟之间。
在一个实施方案中，所述方法还包括在生长培养基中生长处理的酵母细胞的步骤。当获得所需细胞浓度时，所述生长可在任何时间中止。
根据一个具体实施方案，所述生长培养基是麦芽汁，即从麦芽汁和酵母获得的滋补麦芽饮料。可以使用任何类型的酵母。可以使用任何类型的麦芽汁。然而，在一个实施方案中，所述麦芽汁获自酿造厂。在另一个实施方案中，所述麦芽汁由大麦麦芽制造。在又一个实施方案中，所述麦芽汁由麦芽汁浓缩物制造。
如果麦芽汁获自酿造厂或如果使用麦芽汁浓缩物，可以调整干物质的重量分数，即通过下式调整：
W＝Q*(Co/Cd-1)
其中，W是将添加用于稀释原始麦芽汁的水的体积，以升(L)表示，Q是原始(起始)麦芽汁(即从酿造厂或以浓缩形式获得的麦芽汁)的体积(L)；C0是原始麦芽汁的提取物含量，以重量％表示；和Cd是稀释的麦芽汁中干物质的重量分数。
在一个实施方案中，稀释的麦芽汁中干物质的重量分数可以是大约11重量％(11重量％麦芽汁)，如10.5重量％至11.4重量％。
如果麦芽汁由大麦麦芽制造，用于生产100L麦芽汁所需的原材料的量可以通过下式计算：
C = wf * ρ * cc * 100 * 100 ( E avg - L B ) * ( 100 - B )
其中C是具体麦芽消耗量，以kg/100L水表示；wf是原始麦芽汁中干物质的重量分数，以重量％表示；ρ是麦芽汁的密度比，以g/100g表示；cc是麦芽汁体积和最终饮料体积之间的压缩系数；Eavg是所用麦芽的含量，以重量％表示；LB表示含量损失，以％表示；和B表示体积损失，以％表示。
在一个实施方案中，根据任何上述实施方案生产的麦芽汁在高压灭菌器室中以0.05MPa的压力灭菌20分钟。然后麦芽汁在18-20℃的温度下在密封容器中存储多达6个月。
根据另一个实施方案，根据任何上述实施方案生产的麦芽汁也可通过，如将其加热至70-75℃持续多于30分钟进行巴氏灭菌。然后麦芽汁在18-20℃的温度下在密封容器中存储多达2周。
根据一个实施方案，酿酒酵母(S.cerevisiae)通过在小体积的灭菌的11重量％麦芽汁中悬浮而复活。重要的是没有其它微生物污染所述麦芽汁。
复活的培养物随后接种在许多具有琼脂化麦芽汁的培养皿上，以获得纯的酵母培养物。这可以通过显微镜确认。
在EHF处理前，来自具有无菌纯培养物的平皿之一的酵母转移到含有无菌11重量％麦芽汁(如10-12mL)的管中。培养物生长直至表层物出现，典型地在25-28℃进行20-24小时。
然后所述酵母培养物在EHF-场中处理。这可以如下完成：首先用酵母悬浮液填充无菌培养皿。然后覆盖该平皿并放置在EHF设备中。此类设备可以是产生在EHF范围的电磁振荡的任何设备。EHF处理时间优选少于60分钟。EHF振荡的功率密度优选为约0.1mW/cm2。振荡频率在30-300GHz的范围内。电磁波可以在约35至约65GHz的范围内，如40GHz，41GHz，42GHz，42.2GHz，43GHz，44GHz，45GHz，46GHz，47GHz，48GHz，49GHz，50GHz，51GHz，52GHz，53GHz，54GHz或55GHz。在一个实施方案中，振荡频率为42194±10MHz，并且在围绕这种频率的100MHz波段内线性调制。在一个实施方案中，振荡频率是53534±10MHz，并且在围绕这种频率的50MHz波段内线性调制。电磁波可用本领域已知的任何电子或光装置(如基于IMPATT二极管振荡器的YAV-1治疗装置)递送。
在一个实施方案中，电磁波的频率调制是各自平均频率的0％至约0.5％，如各自平均频率的0.5％。
在EHF设备中处理后，将上述处理的悬浮液转移到含有无菌11重量％麦芽汁的管(如50-100mL管)中。允许细胞生长直至表层物出现，典型地在25-28℃进行20-24小时。这是种子材料。
然后将所述种子材料添加到巴氏灭菌或灭菌的麦芽汁(典型地2-3L)中，填充到容器(管、罐等)中，所述容器具有比数量标语略大的标称容积(典型地4-5L)，并且进行培养直到达到3X107个细胞/mL的细胞浓度，典型地在25-28℃进行20-24小时后。
在另一个实施方案中，如果生产大体积的饮料，上述处理可在数个阶段进行，通过将前一个培养周期的成果作为种子材料以种子材料∶麦芽汁1∶10的比例添加到无菌麦芽汁中。允许细胞生长直至表层物出现，典型地在25-28℃进行20-24小时。当达到不低于3X107个细胞/mL的细胞浓度时，认为完成饮料生产阶段的最后阶段。
一旦完成生产阶段，饮料准备好销售并且可转移到适当的运输容器中，例如瓶或罐中。如果需要存储，饮料可冷却至约2-4℃并且然后可以存储，如多达3天。
本发明可以任何适当形式实施，包括食品产品、饲料、其它饮用产品等或这些的任何组合，而不背离本发明的主旨。
本发明实施方案的要素和成分可以任何适当的方式在物理上、功能上和逻辑上实施。事实上，所述功能可以单个组合物、多个组合物或作为其它功能组合物的一部分实施。
在一个实施方案中，所述组合物可在用于治疗或预防受试者(如人)中神经变性疾病或病症的方法中使用。
处理的酵母细胞
下述是生产程序的实用实施方案。然而，在本发明的范围内，许多不同备用生产程序是可能的，本领域技术人员将认识到这一点。
从酿造厂获得麦芽汁，并且将稀释的麦芽汁中干物质的重量分数调整到11重量％(11重量％麦芽汁)。
麦芽汁在高压灭菌器室中以0.05MPa的压力灭菌20分钟，并且在18-20℃存储。
酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)通过在无菌条件下悬浮在少量灭菌的11重量％麦芽汁中复活。
将所述酵母接种在许多具有琼脂化麦芽汁的培养皿上，以获得纯的酵母培养物。这通过显微镜确认。
在EHF处理前，将来自具有无菌纯培养物的平皿之一的酵母转移到含有11mL无菌11重量％麦芽汁的管中。培养物在28℃生长20-24小时直至表层物出现。
然后所述酵母培养物在EHF-场中处理。这可以如下完成：首先用酵母悬浮液填充无菌培养皿。然后覆盖该平皿并放置在EHF设备中，该设备产生在EHF范围内的电磁振荡。EHF处理时间是40分钟。EHF振荡的功率密度保持在0.1mW/cm2附近。振荡频率是53534±10MHz，并且在围绕这种频率的50MHz波段内线性调制。电磁辐射通过基于IMPATT二极管振荡器的YAV-1治疗装置产生。
在EHF设备中处理后，将上述处理的悬浮液转移到含有无菌11重量％麦芽汁的75mL管中。允许细胞在28℃生长22小时直至表层物出现。这是种子材料。
然后将所述种子材料添加到3L填充到标称容积为5L的管中的巴氏灭菌或灭菌的麦芽汁中，并且进行培养直到达到3X107个细胞/mL的细胞浓度。这些处理的酵母细胞如下所述给予小鼠。
实验
小鼠用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)处理以诱发类似于神经变性疾病或病症的症状，给予该小鼠包含如上所述处理的酵母细胞的组合物，并与锻炼联合。
本领域熟知MPTP导致类似于患有神经变性疾病或病症的患者的症状，如运动徐缓、休息性震颤和强直。MPTP本身似乎不是有毒性的，但是已知其穿过血脑屏障，之后，其发生生物转化为涉及单胺氧化酶(MAO)的毒性代谢物。MAO是MPTP转换为2，3-二氢吡啶
Figure BDA0000137832360000111
中间物(MPDP+)的第一步。MPDP+在驱动下氧化，形成1-甲基-4-苯基吡啶
Figure BDA0000137832360000112
离子(MPP+)。MPP+是MPTP最重要的毒性代谢物，其产生症状效应。在所述模型中，当在小鼠中注射MPTP时，年龄发挥关键作用，因为许多神经变性疾病或病症已知在人中晚发病。
材料和方法
初始实验
在实验中使用总共90只2月龄雄性C57BL/6小鼠，其来自于瑞典Scanbur B和K，Sollentuna，重量为27±2g。在到达实验室后，允许小鼠在控制温度(22±1℃)，湿度(55±5％)的房间顺应一周，它们均可获得食物，来自于瑞典
Figure BDA0000137832360000113
的R35颗粒，和无限制的自来水。房间中有恒定光-暗周期(12小时开/12小时关，光线在6.00AM-6.00PM之间打开)。小鼠分成六组，每组15只动物，并圈养在具有金属线顶部的实验室聚碳酸酯笼(55*35*18cm)中。笼子标记数字以便将它们分开。在每个笼子中有两个窝，其中小鼠能够躲藏和睡眠。
总共使用16个直径测量为17.5cm的滚轮(running wheels，来自LivingWorld的Deluxe)。为了防止小鼠躲避轮子，所述轮子包有塑料壁。切下一块塑料包被物并形成与轮子相同直径，放置在轮子的每一侧，一侧附有尼龙搭扣(Velcro)以允许小鼠从轮子中进出。在轮子另一侧，将塑料粘贴到锻炼轮上。
使用包括macrolon啮齿动物测试笼(40*25*15cm)的运动-活动测试仪器。每个测试室，即运动活动测试笼，放置在隔音木盒中，该木盒具有12cm厚的壁和前面板和小的双层玻璃窗以允许进行观察。每个盒具有昏暗的光照，都放置在两个系列的红外线光线内(在两个不同的高度，一个低，一个高，分别为2和8cm，在1cm深的锯屑的表面上)，用于测量MPTP和对照小鼠的自发的和/或药物诱发的运动活动(Rat-O-Matic，ADEAElectronic AB，Uppsala，瑞典)。红外光线之间的距离如下：低水平光线相对于测试室为纵向73mm距离和横向58mm距离；高水平光线放置在紧随测试室的每个长边，为28mm距离。
图2A是运动活动测试仪器的侧视图，图2B是同样仪器的正视图。在基部支持物20中放置笼子和传感器。笼子是透明塑料笼21，在顶部具有贯穿的铝盖22。塑料笼21静置于弹性橡胶支持物23上。电视摄像管(pick-up)24安装在带有平衡物的杠杆上，许多红外(IR)传感器25靠近塑料笼21放置。
在所有测试过程中，盐水分发用作赋形剂。如果适用，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)(Research Biochemical Inc.，Natick，MA.USA)在分发前溶解在赋形剂中。
类似地，L-多巴(
Figure BDA0000137832360000121
瑞典)在分发前溶解在盐水中。本领域已知L-多巴用于治疗神经变性疾病或病症。神经递质系统考虑三种神经递质，去甲肾上腺素(NE)，多巴胺(DA)和5-羟色胺(5HT)。DA的氨基酸前体酪氨酸(TYR)从血流通过主动运输泵运输到神经系统。TYR在神经元内顺次作用于三种酶。首先TYR与调节NE合成的羟化酶作用。酪氨酸羟化酶(TOH)然后将TYR转化为二羟基苯基-丙氨酸(DOPA)。第二种酶，DOPA脱羧酶(DDC)然后作用并将DOPA转化为DA。第三种酶多巴胺β羟化酶将DA转化为NE。已知至少五种DA受体的药理学亚型。在PD中多巴胺2(D2)-受体被多巴胺能激动剂如L-二羟基苯基-丙氨酸(L-多巴)刺激。L-多巴(DA的前体)是在外周和中枢均代谢成DA的氨基酸。L-多巴不同于DA，其能够穿过血脑屏障，因为L-多巴通过L-氨基酸载体摄取穿过血脑屏障。L-多巴的施用与脱羧酶抑制剂联合以降低外周代谢。几年治疗之后，L-多巴的效果降低，患者发生运动障碍和/或起停(on-off)症状。无论如何，L-多巴是本领域最常用的治疗，并因此在此用作参照。
总计90只2-月龄C57BL/6雄性小鼠根据表3分成6组。
表3.测试细分概况
  组   1周   处理  6周
  1   赋形剂
  2   轮子   赋形剂  轮子
  3   MPTP
  4   轮子   MPTP  轮子
  5   MPTP  酵母
  6   轮子   MPTP  酵母+轮子
在第一周顺应之后，组1和2的小鼠给予2*2ml/kg赋形剂，组3，4，5和6的小鼠给予2*40mg/kg MPTP，S.C.，间隔16小时，以诱发神经变性疾病或病症的症状。锻炼的小鼠允许在处理后休息3天，然后开始滚轮30min/天，5天/周，进行6周。锻炼在行为测试室中进行。通过抓住小鼠尾巴将小鼠放入滚轮中，此后扣紧塑料。每次锻炼期间结束，除去塑料，允许小鼠从轮子中出来，自己爬进住所笼子中。向组5和6提供0.5ml/受试者含有一百万活化的酵母细胞的处理的酵母，在6周的过程中一周两次(星期一和星期四)口服提供，同时进行锻炼。组3和4与组5和6以同样的方式操作，尽管它们没有给予任何口服处理。
在滚轮期间之后，小鼠在特别安排的测试室进行运动活动(motoractivity)测试。这种测试室，其中放置12个ADEA活动测试室，是良好隔离的并且仅用于此目的。小鼠逐个测试一小时，并且小鼠放置在室中心。记录下述参数：
变量LOCOMOTION(行动)通过低栅格的红外光线测量。仅当小鼠在水平面围绕测试笼移动时登记计数。
变量REARING(站起)在全部时间内当至少一个高水平光线被打断时进行登记，即，计数的数目与站起花费的时间量成比例。
变量TOTAL ACTIVITY(总活动)通过传感器(类似于留声机探针的电视摄像管，安装在具有平衡物的杠杆上)测量，通过它与测试笼一直保持联系。
传感器登记了来自测试笼的所有类型的振动，如通过行动和站起两者产生的以及通过摇动、震颤、搔抓和理毛(grooming)产生的那些。
所有三种行为参数在三个连续的20-min期间测量。运动-活动参数在三个连续的20-min期间仅在一次事件上测试。在自发活动后，测试小鼠的诱发活动，其是被锻炼和处理的酵母影响的运动。小鼠皮下(s.c.)注射亚阈值剂量的L-多巴，0.5mg/kg。然后小鼠再次逐个放入测试室中4小时。仅考虑最后3小时的测量，以排除操作和注射程序导致的运动。进行测试后，将小鼠断颈，将纹状体区迅速剖出并存储于-80℃直至进行神经化学分析。
神经化学分析使用具有电化学检测的高效液相色谱(HPLC-EC)进行，以测定DA和内部标准卡比多巴(Carbidopa)。冷冻的纹状体称重并在1毫升0.1M高氯酸中匀浆。添加卡比多巴作为内部标准。离心(10 000rpm，即12519*g，4℃，15min)和过滤后，将0.05毫升体积的匀浆物用流动相1∶4稀释，并注射20μl到HPLC-EC中。HPLC系统由以下各项组成：Bischoffpump型号2250(Bischoff，德国)，装有保持在5℃冷却的盘的自动取样器/自动注射器(Midas，Spark Holland)，装有保持在30℃的保护柱(A.Maisch，德国)的分析柱(Reprosil-Pur，C 18-AQ，250*4mm，5μm)，和Coulochem It ESA多电极传感器，其装有在氧化电势+300mV下操作的Model 5011-A双分析池(ESA Analytical，Chelmsford，MA，USA)。流动相，pH 3.0±0.1，由以下各项组成：100mM NaH2PO4，0.5mM 1-辛烷磺酸，1mM EDTA和甲醇10％。流速是0.7ml/min。
对在活动测试室中的3个连续20-min期间的自发行动、站起和总活动数据进行本领域熟知的裂区ANOVA设计。来自于纹状体中多巴胺水平的结果和5mg/kg L-多巴对行动、站起和总活动的复原效应，4小时中最后3小时的总和(排除第一小时的皮下注射的效应)进行单因素ANOVA设计。此后，不同处理组之间的配对检验通过本领域熟知的Tukey′s HSD检验进行。自始至终维持1％的显著性水平，除非另有说明。
进一步的实验
恢复研究1(recovery study 1)
到达后三周，在到达后第4周的星期五，上述两组小鼠(n＝10)施用MPTP(40mg/kg，s.c.)，两组施用盐水(赋形剂，2ml/kg)。在到达后第5、6、7周的每个星期五维持相似的MPTP或赋形剂施用。在每种情况下，在MPTP/赋形剂施用之前，在活动测试室进行行为测试(测试1-5)。同时，在第4-7周和第8周，一个赋形剂和一个MPTP组每周四天(周一-周四)给予30-min锻炼期间。随之，锻炼期间终止，但是，在第10周和第12周测试所有小鼠(测试6和7：周五)。设计检查单次每周给药MPTP(40mg/kg)，而非间隔24小时的2x40mg/kg剂量，当在MPTP施用后一周进行活动测试时，是否能够提供进行性运动功能减退增量(progressivehypokinesic increment)。该实验也设计用于测试连续四天的滚轮锻炼方案是否将减弱神经毒素的运动功能减退效应(hypokinesic effect)。表4显示实验设计和小鼠处理，所述小鼠施用MPTP或赋形剂，进行或不进行五周的滚轮锻炼。
表4.实验设计和小鼠处理，所述小鼠施用MPTP或赋形剂，进行或不进行六周的滚轮锻炼。
Figure BDA0000137832360000151
Figure BDA0000137832360000171
*MPTP(40mg/kg)
Figure BDA0000137832360000172
在60min内自发运动活动
恢复研究2
在第二恢复研究中，在连续四周内每周连续4天的滚轮活动(参见下述表5)之后，在测试自发运动活动后，向小鼠施用单次每周剂量的MPTP(1x40mg/kg，s.c)，在第5周施用相似程序，不同之处在于，在测试运动活动后没有施用MPTP。此后，所有小鼠放置两周，不进行处理或滚轮锻炼，然后在自发运动测试上再次测试，随后进行L-多巴诱发的运动活动测试。不进行处理或滚轮锻炼再过两周后，对所有小鼠进行最后的自发运动测试，然后进行L-多巴诱发的运动活动测试(参见下述表5)。在随后的一周中，杀死MPTP和赋形剂小鼠，解剖出纹状体区用于神经化学分析。
此后，所有小鼠放置两周，不进行处理或滚轮锻炼，然后在自发运动测试上再次测试，随后进行L-多巴诱发的运动活动测试。此后，在随后九周中，所有小鼠维持在滚轮锻炼或静息放置在胶质玻璃笼子中的条件下，但是以两周为间隔进行测试，其中评估自发运动活动(测试1-14)和L-多巴诱发的活动(测试1-5，在实验的第6，8，10，12和14周时)两者。在随后的一周(第15周)，杀死MPTP和赋形剂小鼠，解剖出额皮质、顶叶皮质、海马和纹状体区用于DA和BDNF的神经化学分析。根据这种设计，仅一个赋形剂组(包括不锻炼的组)显示在注射赋形剂的动物中滚轮锻炼没有产生行为改变。
表5.施用MPTP或赋形剂小鼠的实验设计和处理，进行或不进行三周的滚轮锻炼。显示了在60min间隔内自发运动活动测试和亚阈值L-多巴测试。
Figure BDA0000137832360000181
Figure BDA0000137832360000182
MPTP(40mg/kg)在前四周的过程中注射
*在60min内的自发运动活动
**L-多巴(5mg/kg，s.c.)，在测试笼子驯化60-min之后
复原研究(restoration study)
进行了复原研究，其中测试自发运动活动，在前两个连续的周内不进行滚轮活动，但是对于MPTP+锻炼(2)组从第三周开始滚轮锻炼，在这之后向小鼠施用单次每周剂量的MPTP(1x30mg/kg，s.c)；MPTP+锻炼(4)组在第3和第4周继续不进行滚轮锻炼，但是从第5周往后开始接受滚轮。然后，对于MPTP+锻炼(2)和MPTP+锻炼(4)组，在第5周至第10周维持滚轮程序，不同之处在于，在测试运动活动之后不再进一步施用MPTP。当MPTP+锻炼(2)和MPTP+锻炼(4)组允许滚轮锻炼的整个30-min期间，赋形剂和MPTP组中的小鼠放置在相同房间的单个笼子中持续30-min期间。此后，所有小鼠放置两周，不进行处理或滚轮锻炼，然后再次测试自发运动测试，随后进行L-多巴诱发的运动活动测试。此后，在随后九周中，所有小鼠维持在滚轮锻炼或静息放置在胶质玻璃笼子中的条件下，但是以两周为间隔进行测试，其中评估自发运动活动(测试1-14)和L-多巴诱发的活动(测试1-5，在实验的第6，8，10，12和14周时)两者。在随后的一周(第15周)，杀死MPTP和赋形剂小鼠，解剖出额皮质、顶叶皮质、海马和纹状体区用于DA和BDNF的神经化学分析。根据这种设计，仅一个赋形剂组(包括不锻炼的组)显示在注射赋形剂的动物中滚轮锻炼没有产生行为改变。表6是施用MPTP或赋形剂小鼠的实验设计和处理的概况，进行或不进行三周的滚轮锻炼，如在实验II中所进行的。显示了在60min间隔内自发运动活动测试和亚阈值L-多巴测试。
表6.施用MPTP或赋形剂小鼠的实验设计和处理，进行或不进行三周的滚轮锻炼。显示了在60min间隔内自发运动活动测试和亚阈值L-多巴测试。
Figure BDA0000137832360000191
Figure BDA0000137832360000201
Figure BDA0000137832360000211
Figure BDA0000137832360000212
仅SMA；
*SMA+L-多巴
3◇`＝第3周(w.3)开始锻炼+处理的酵母；◇`5＝第5周(w.5)开始锻炼+处理的酵母
结果和讨论
初始实验
在MPTP处理后7周通过HPLC分析揭示，向6周龄小鼠施用MPTP导致依赖于后处理的纹状体中DA含量的随后改变。与赋形剂组相比，施用MPTP诱发纹状体中降低的DA含量。因而，单因素ANOVA显示纹状体中DA含量的显著的组间效应F(5，30)＝35.92，P＜.0001。图3显示纹状体中DA含量。y轴表示以ng/mg湿重表示的多巴胺水平。沿着x轴，不同样品以柱状显示。柱31为仅有赋形剂(对照样品)，组1。柱32为赋形剂联合锻炼，组2。柱33为MPTP 40mg/kg，组3。柱34为MPTP 40mg/kg联合锻炼，组4。柱35为MPTP 40mg/kg联合处理的酵母，组5。柱36为MPTP 40mg/kg联合处理的酵母和锻炼，组6。
柱形图显示处理的酵母对纹状体中多巴胺的水平有影响，因为组5小鼠比组3小鼠具有更高的水平。处理的酵母联合锻炼给出甚至更高的影响，如柱6所示。
使用Tukey′s HSD检验的配对检验揭示下述差别：与赋形剂相比，在所有处理组中，MPTP降低DA含量。锻炼部分拮抗所述降低，但是从处理的酵母没有看到额外的影响。施用赋形剂或MPTP，随后进行每周连续5天期间30-min的锻炼，和/或一周两次补充处理的酵母进行6周，部分修复由于MPTP引起的活动减退。处理的酵母本身不影响MPTP的运动功能减退效应。因而，裂区ANOVA显示显著的处理*时间相互作用：行动：F(IO，108)＝57.21，P＜.0001；站起：F(IO，108)＝89.56，P＜.0001；和总活动：F(10，108)＝89.56，P＜.0001.图4显示对于行动、站起和总活动的均值和SD值。
使用Tukey′s HSD检验的配对检验揭示不同MPTP后处理和赋形剂组之间的差别。在赋形剂小鼠中，在60min期间的所有自发行为存在活动的显著降低。此类降低是自发行为的正常模式。赋形剂加锻炼与赋形剂无伴随之间没有区别。MPTP处理与赋形剂处理相比产生的活动减退，其特征是降低的行动、站起和总活动平均计数，不受单独的处理的酵母的影响。相比之下，单独的锻炼在第一和第二期间部分复原行动。同样，对于组合，锻炼+处理的酵母，在第一和第二期间部分复原行动，连同对站起的复原效应。对于第一期间的行动和第二期间的站起，与单独的锻炼相比，处理的酵母+锻炼显著降低活动减退。
研究了暴露于亚阈值剂量5mg/kg L-多巴之后诱发的行为。这种剂量的L-多巴被其本身掩盖，对用40mg/kg MPTP预处理的活动减退的小鼠没有影响。诱发行为测量的4小时中最后3小时(排除第一小时中由操作和注射产生的活动)的行动、站起和总活动计数的总和进行单因素ANOVA。发现了显著的组间效应：
行动F(5，54)＝44.19P＜.0001；站起F(5，54)＝33.50P＜.0001和总活动F(5，54)＝25.69P＜.0001。
图4对结果进行了总结。显示了L-多巴施用后3小时的行动(图4A)、站起(图4B)和总活动(图4C)的均值和SD值。处理的酵母联合锻炼产生显著的行动和站起的增加。字母(大写.01和小写.05)显示显著差异，其中A表示锻炼和不锻炼之间的比较，B给予处理的酵母处理的组间比较。使用Tukey′s HSD检验的配对检验揭示下述差异：L-多巴对于没有锻炼的MPTP处理的小鼠，或仅用处理的酵母后处理的小鼠，不显示任何有益效果。与不锻炼和单独的处理的酵母相比较，锻炼组和锻炼+处理的酵母组对于所有三种变量具有显著更低的活动减退。处理的酵母联合锻炼产生显著增加的行动和站起。
本研究检查了每天滚轮形式的体育锻炼本身或联合处理的酵母用于复原(尽管是部分地复原)运动机能减退(hypokinesia)和一般神经化学缺陷，特别是MPTP施用(2*40mg/kg)诱发的DA耗竭的倾向性。结果总结如下：
1.由于MPTP施用导致的运动机能减退被每日锻炼部分复原，通过滚轮联合处理的酵母增加了该效应。
2.MPTP-诱发的运动机能减退在L-多巴刺激后被每日锻炼部分复原，通过滚轮联合处理的酵母增加了该效应。
3.以高剂量(2*40mg/kg)MPTP诱发的DA耗竭被每日锻炼恢复，但是滚轮和处理的酵母的组合没有明显增加该复原效应。
在自发活动测试中，对于在活动测试室中在0-20min和20-40min两个测试期间用低剂量MPTP处理的小鼠，六周滚轮显著增加了行动，但是不增加站起和总活动。滚轮和处理的酵母的组合，在六周期间一周两次，在所有3个参数方面显然增加MPTP处理的小鼠的运动活动。根据本发明人的非限制性理论，在进入治疗的受试者后，处理的酵母继续产生振荡。当处理的酵母接触受试者的细胞时，认为由于它们之间的偶极-偶极力，它们相互吸引并连接。在来自治疗的受试者的细胞膜上，缺少电对称性，可形成亚结构，其又形成EHF电场。具有扰乱功能的细胞和外部刺激的细胞一旦接触可形成临时联合系统，其中可发生恢复过程。此类过程类似于具有扰乱功能的细胞中发生的那些，但是由于细胞从外部过程向生物体注入大量EHF能量，此类细胞和需要恢复的细胞之间的能量交换导致后者富集EHF能量，从而加速其恢复。恢复后，生物体的相应细胞变得对称。此类细胞和外部处理的细胞之间的相互作用中断，因此停止从外部处理的细胞摄取EHF能量。
用高剂量MPTP处理然后进行L-多巴刺激的小鼠中的严重的功能缺陷被滚轮复原；与锻炼和处理的酵母的组合所产生的效应相比，单独锻炼的复原效应是不完全的。由高剂量MPTP导致的活动缺陷不包括站起(图4)；然而，在亚阈值剂量的L-多巴之后，行动和总活动形式的行为被6周期间的滚轮完全复原。
图5是分别显示L-多巴施用后3小时行动(图5A)、站起(图5B)和总活动(图5C)的均值和SD值的图。处理的酵母联合锻炼给出行动和站起的显著增加。字母(大写.01和小写.05)显示显著差异，其中A表示锻炼和不锻炼之间的比较，B给予处理的酵母处理的组间比较。
处理的酵母(联合或不联合锻炼)还可以对于神经变性疾病或病症的进展具有影响。
进一步的实验
恢复研究1
图6显示自发运动活动。锻炼方案减弱MPTP的运动活动缺陷。处理的酵母(酵母)诱发几乎完全的自发活动的恢复。
图7显示L-多巴诱发的活动。锻炼方案减弱MPTP的运动活动缺陷。处理的酵母(酵母)诱发几乎完全的L-多巴诱发活动的恢复。
图8显示多巴胺分析结果。在用处理的酵母(酵母)处理的组存在多巴胺水平的显著恢复。
恢复研究2
图9显示关于自发运动活动的结果。锻炼方案减弱MPTP的运动活动缺陷。处理的酵母(酵母)诱发完全的自发活动的恢复。
图10显示L-多巴诱发的活动。处理的酵母(酵母)产生L-多巴诱发活动的完全恢复。
图11显示多巴胺分析的结果。处理的酵母(酵母(1))在小鼠纹状体中产生多巴胺水平的完全恢复。
图12显示BDNF分析的结果。与仅有锻炼(MPExer)和未处理的酵母(MPExM)组相比较，处理的酵母诱发最大的BDNF表达(MpExMa组)。(MpExMa组＞MPExM，MPExer组＞MPTP组)。
复原研究
图13显示自发运动活动。在两次施用MPTP后，处理的酵母(酵母)诱发对自发活动的显著复原效应。
图14显示L-多巴诱发的效应。在两次施用MPTP后，处理的酵母(酵母)诱发对L-多巴诱发活动的完全的复原效应。
图15显示多巴胺分析的结果。在两次施用MPTP后，处理的酵母(酵母)对多巴胺水平诱发显著的复原效应。
在权利要求书中，术语“包括/包含”不排除其他要素或步骤的存在。此外，尽管单个列举，多个装置、要素或方法步骤可在例如单个器件中实施。
另外，尽管单个特征可包含于不同权利要求中，这些可能有利地进行组合，包含于不同权利要求中并非暗示特征的组合是不可行和/或有利的。此外，提及单数并不排除复数。术语“一个”、“一种”、“第一”、“第二”等并不排除复数。权利要求中的附图标记仅作为阐明实例提供，不应解释为以任何方式限制权利要求的范围。

Claims (19)

1.包含酵母细胞的组合物在制备用于治疗或预防神经变性疾病或病症的药物中的应用，所述酵母细胞用30GHz-300GHz范围内的电磁波处理，或生长自用30GHz-300GHz范围内的电磁波处理的酵母细胞，其中所述神经变性疾病或病症选自由以下组成的组：帕金森病，阿尔茨海默病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)和2型糖尿病。
2.根据权利要求1的应用，其中所述电磁波在35GHz至65GHz的范围内。
3.根据权利要求1或2的应用，其中所述电磁波选自由下列各项组成的组：40GHz,41GHz,42GHz,42.2GHz,43GHz,44GHz,45GHz,46GHz,47GHz,48GHz,49GHz,50GHz,51GHz,52GHz,53GHz,54GHz或55GHz。
4.根据权利要求1或2的应用，其中所述电磁波具有低于1mW/cm2的功率密度。
5.根据权利要求4的应用，其中所述电磁波具有0.004mW/cm2-0.2mW/cm2的功率密度。
6.根据权利要求1或2的应用，其中所述电磁波以平均频率的0%-0.5%范围内的频率调制。
7.根据权利要求1或2的应用，其中所述处理时间为20分钟-130分钟。
8.根据权利要求1或2的应用，其中所述酵母细胞是酵母属(Sacharomyces)的。
9.根据权利要求8的应用，其中所述酵母细胞选自由卡尔斯伯酵母(Sacharomyces carlsbergesis)或酿酒酵母(Sacharomyces cerevisiae)组成的组。
10.根据权利要求1或2的应用，其中所述治疗是口服治疗。
11.制备在前述权利要求任一项中所述的组合物的方法，所述方法包括下列步骤：
制备生长培养基；
灭菌或巴氏灭菌所述生长培养基；
在所述生长培养基中生长酵母细胞；和
用电磁波处理所述酵母细胞，其中所述电磁波在30GHz-300GHz的范围内。
12.根据权利要求11的方法，其中所述电磁波在35GHz至65GHz的范围内。
13.根据权利要求12的方法，其中所述电磁波为40GHz,41GHz,42GHz,42.2GHZ,43GHz,44GHz,45GHz,46GHz,47GHz,48GHz,49GHz,50GHz,51GHz,52GHz,53GHz,54GHz或55GHz。
14.根据权利要求11或12的方法，其中所述电磁波具有低于1mW/cm2的功率密度。
15.根据权利要求14的方法，其中所述电磁波具有0.004mW/cm2-0.2mW/cm2的功率密度。
16.根据权利要求11或12的方法，其中所述电磁波以平均频率的0%-0.5%范围内的频率调制。
17.根据权利要求11或12的方法，其中所述处理的时间为20分钟-130分钟。
18.根据权利要求11或12的方法，还包括在所述生长培养基中生长所述处理的酵母细胞的步骤。
19.根据权利要求11或12的方法，其中所述生长培养基是麦芽汁。
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