CN102481365A

CN102481365A - 用dll4拮抗剂和化疗剂治疗癌症的方法

Info

Publication number: CN102481365A
Application number: CN201080037619XA
Authority: CN
Inventors: I·诺格拉特罗伊赛; G·瑟斯顿; A·蒂博
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2012-05-30
Also published as: US8840886B2; SI2445528T1; MY173234A; IL216952A0; US20100330106A1; BRPI1011818A2; CA2766163A1; HRP20160045T1; WO2010151770A1; AU2010266004A8; JP2016006101A; US20130302356A1; AU2010266004A1; EP2445528A1; US20150064189A1; US8518887B2; AU2010266004B2; PL2445528T3; RU2012102415A; AR077241A1

Abstract

本发明提供了通过施用Dll4拮抗剂和化疗剂的组合从而治疗各种类型的癌症/肿瘤的方法，其中所述Dll4拮抗剂尤其是特异性结合Dll4的Dll4抗体和其片段。此类联合治疗与单独用任一治疗剂治疗相比表现出协同作用。因此，本发明的方法对于对由单独用任一治疗剂治疗所需的高剂量引起的副作用具有低耐受性的癌症患者尤其有益，这是因为能够降低有效剂量。还提供了含有Dll4拮抗剂和化疗剂的药物组合物及药盒。

Description

用DLL4拮抗剂和化疗剂治疗癌症的方法

背景技术

发明领域

本发明涉及用δ样配体4(Dll4)拮抗剂(尤其是与人Dll4特异性结合的人抗体或其片段)与一种或多种化疗剂联合治疗癌症或肿瘤的方法，并且涉及包含Dll4拮抗剂和化疗剂的药物组合物。

相关领域的描述

Dll4是Notch配体的δ家族的成员，其通过血管内皮显示出高选择性表达(Shutter等，2000，Genes Develop.14：1313-1318)。Dll4是Notch受体包括Notch1和Notch4的配体。Dll4拮抗剂可用于抑制各种癌症中的肿瘤生长。人Dll4(hDll4)的核酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和2所示。对人Dll4特异的抗体以及应用Dll4抗体的癌症/肿瘤治疗公开在国际专利申请公开文本WO 2007/143689、WO 2008/042236和WO 2007/070671中。

化疗剂单独地以及与外科手术和/或放疗联合地广泛用于治疗癌症。应用Dll4拮抗剂和化疗剂的联合治疗公开在美国专利申请公开文本US2008/0014196和US 2008/0107648中。

发明概述

在第一个方面，本发明涉及在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括给该受试者施用Dll4拮抗剂以及化疗剂，其中该癌症被治疗。通过本发明治疗的受试者可包括罹患癌症的任何哺乳动物物种，但优选人。

本发明的联合治疗尤其可用于Dll4相关的或Dll4介导的病症或疾病，所述病症或疾病直接或间接地受Dll4活性调节的影响。更具体地，由于已显示Dll4涉及血管生长和发育，因此应用Dll4拮抗剂抑制或降低Dll4介导的血管生长或发育或成熟是生长和存活需要充足的血液供应的癌症/肿瘤的有效疗法。此外，将Dll4拮抗剂与包括生长抑制剂和其他细胞毒性剂的化疗剂联用协同地提高了它们的抗癌/抗肿瘤效果。通过本发明的方法可治疗的癌症/肿瘤包括但不限于各种实体恶性肿瘤，包括卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、皮肤癌包括黑色素瘤、恶性软组织肉瘤包括但不限于尤因(Ewing)肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪细胞(adipocytic)肉瘤、滑膜肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、上皮样血管内皮瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤以及未分级肉瘤、白血病包括骨髓瘤等等。

在一个实施方案中，Dll4拮抗剂是以高亲和性与Dll4特异性结合并阻断Dll4与Notch受体结合和/或中和Dll4活性的Dll4抗体或其片段(“Dll4Ab”)。该抗体可为多克隆、单克隆、嵌合、人源化或完全人抗体。优选地，抗体是完全的(fully)人单克隆抗体或单克隆抗体片段。该抗体片段可为单链抗体、Fab或F(ab’)₂。

在另一实施方案中，Dll4 Ab与Dll4(SEQ ID NO：2)的N-端结构域(S27-R172)、或DSL结构域（V173-C217)、或N-端-DSL结构域(S27-C217)内的表位结合。在本发明方法中使用的Dll4 Ab能够以高亲和性与人Dll4结合，并且其解离常数(K_D)为约500pM或更低，包括约300pM或更低，以及包括约200pM或更低，如通过表面等离子体共振所测得的那样。例如，所述Dll4Ab具有包含三个重链CDR(H-CDR)的重链可变区(HCVR)和包含三个轻链CDR(L-CDR)的轻链可变区(LCVR)，其中该三个重链CDR包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，且该三个轻链CDR包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在另一实施方案中，Dll4Ab的重链CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：22、24和26的氨基酸序列。在另一实施方案中，Dll4Ab的轻链CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：30、32和34的氨基酸序列。在又一实施方案中，该Dll4Ab包含重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO：22、24和26，并且所述轻链CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含SEQ ID NO：30、32和34。在又一实施方案中，该Dll4Ab含有包含SEQ ID NO：20或116的氨基酸序列的HCVR，或包含SEQ ID NO：28或118的氨基酸序列的LCVR。在又一实施方案中，该Dll4Ab包含SEQ ID NO：20/28(REGN281)或116/118(REGN421)的HCVR/LCVR组合。

在另一实施方案中，该Dll4Ab包含选自以下的重链CDR1/CDR2/CDR3组合和轻链CDR1/CDR2/CDR3组合：分别为SEQ IDNO：6/8/10和SEQ ID NO：14/16/18；分别为SEQ ID NO：38/40/42和SEQID NO：46/48/50；分别为SEQ ID NO：54/56/58和SEQ ID NO：62/64/66；分别为SEQ ID NO：70/72/74和SEQ ID NO：78/80/82；分别为SEQ IDNO：86/88/90和SEQ ID NO：94/96/98；以及分别为SEQ ID NO：102/104/106和SEQ ID NO：110/112/114。在另一实施方案中，Dll4Ab含有包含SEQ IDNO：4、36、52、68、84或100的氨基酸序列的HCVR，或包含SEQ ID NO：12、44、60、76、92或108的氨基酸序列的LCVR。在又一实施方案中，Dll4Ab包含选自以下的HCVR/LCVR组合：SEQ ID NO：4/12(REGN279)、SEQ ID NO：36/44(REGN290)、SEQ ID NO：52/60(REGN306)、SEQ IDNO：68/76(REGN309)、SEQ ID NO：84/92(REGN310)和SEQ IDNO：100/108(REGN289)。

编码SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116和118的氨基酸序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115和117所示。

在一个实施方案中，化疗剂是抗有丝分裂剂，诸如多西紫杉醇、紫杉醇等；基于铂的化疗化合物，诸如顺铂、卡铂、异丙铂、奥沙利铂等；或其他常用的细胞毒性剂，诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、伊立替康、甲酰四氢叶酸、吉西他滨；受体酪氨酸激酶和/或血管发生抑制剂，诸如ErbB抑制剂、III类RTK抑制剂、VEGFR抑制剂等；并且Dll4拮抗剂是如上所述的Dll4抗体或其片段。

在第二方面，本发明涉及在有需要的受试者中降低、减少或停止肿瘤生长的方法，该方法包括给所述受试者施用Dll4拮抗剂和化疗剂，其中肿瘤生长被降低、减少或停止。

在第三方面，本发明涉及与单独施用各治疗剂相比，降低达到期望的治疗效果所需的化疗剂或Dll4拮抗剂的量的方法，其包括与Dll4拮抗剂一起施用化疗剂。在一个实施方案中，在存在共同施用的Dll4拮抗剂的情况下，达到期望治疗效果例如停止或减少肿瘤生长的化疗剂的量减少至少10％、减少至少20％、减少至少30％、减少至少40％、或减少至少50％，或者反之亦然。一般地，期望化疗剂或Dll4拮抗剂的量可减少约30％至约50％。因此，由于能够降低有效剂量，本发明的方法对于这样的癌症患者是尤其有利的，所述患者对任一种治疗剂单独治疗所需的高剂量引起的副作用具有低耐受性。

在第四方面，本发明涉及包含Dll4拮抗剂、化疗剂和可药用载体的药物组合物。在一个实施方案中，所述Dll4拮抗剂是以高亲和性与Dll4特异性结合并中和Dll4活性的Dll4Ab或其片段，并且所述化疗剂是本文所述那些中的任一种。

在第五方面，本发明涉及药盒(kit)，其含有包含本发明的药物组合物的容器和具有使用说明的包装说明书。在一个实施方案中，药盒可包含：其中包含特异性结合hDll4的抗体或其抗原结合片段的容器、其中包含至少一种选自本文所述的那些的化疗剂的一个或多个其他容器、以及具有使用说明的包装说明书。

其它目的和优点将在阅读后面的发明详述之后变得明了。

附图简述

图1显示了Dll4Ab与顺铂联合对移植在表达人源化Dll4蛋白的重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠(人源化Dll4SCID小鼠)中的人VMCub1肿瘤(膀胱癌)生长的影响(实施例1)。人Fc对照(带有实线的◆)；REGN421(Dll4Ab)2mg/kg/注射(带有虚线的◆)；顺铂0.5mg/kg/注射(□)；顺铂2mg/kg/注射(■)；REGN421 2mg/kg/注射+顺铂0.5mg/kg/注射(○)；以及REGN4212mg/kg/注射+顺铂2mg/kg/注射(●)。

图2显示了Dll4Ab与顺铂联合对移植在人源化Dll4SCID小鼠中的人A549肿瘤(非小细胞性肺癌)生长的影响(实施例2)。人Fc对照(●)；REGN421 6mg/kg总剂量(○)；顺铂5mg/kg总剂量(△)；顺铂9mg/kg总剂量(▲)；REGN421 6mg/kg+顺铂5mg/kg总剂量(◇)；以及REGN4216mg/kg+顺铂9mg/kg总剂量(◆)。

图3显示了Dll4Ab与5-FU联合对移植在人源化Dll4SCID小鼠中的人HCT116(结肠直肠癌)生长的影响(实施例5)。人Fc对照(●)；REGN4216mg/kg总剂量(○)；5-FU 45mg/kg总剂量(△)；5-FU 75mg/kg总剂量(▲)；REGN421 6mg/kg+5-FU 45mg/kg总剂量(◇)；以及REGN421 6mg/kg+5-FU 75mg/kg总剂量(◆)。

图4显示了Dll4Ab与伊立替康联合对移植在人源化Dll4SCID小鼠中的人HCT116肿瘤生长的影响(实施例6)。人Fc对照(●)；REGN4216mg/kg总剂量(○)；伊立替康22.5mg/kg总剂量(△)；伊立替康75mg/kg总剂量(▲)；REGN421 6mg/kg+伊立替康22.5mg/kg总剂量(◇)；以及REGN421 6mg/kg+伊立替康75mg/kg总剂量(◆)。

图5显示了与15mg/kg的hFc相比，使用0.5、5或15mg/kg的单剂量REGN421，移植在人源化Dll4SCID小鼠中的Colo205人结肠直肠肿瘤细胞中Hey1基因表达的平均(4只小鼠/组)倍数变化，在给药后5、10、24和72小时以及7天时测量。

发明详述

在描述本发明的方法之前，应当理解本发明并不局限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以改变。也应当理解，本文所用的术语仅旨在描述特定的实施方案，并不意在构成限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限定。

如本说明书和所附权利要求书所使用，单数形式“一种(a，an)”和“该/所述(the)”包括所复数的指代物，除非上下文中另有明确规定。因而，例如提及“一种方法”包括本文中所述类型的一种或多种方法、和/或步骤，和/或在阅读本发明内容之后它们对于本领域技术人员将是显而易见的。

除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等价的任何方法和材料均可用于实施或检验本发明，但优选的方法和材料是现在所描述的。

定义

“δ样配体4”、“Dll4”、“hDll4”可互换使用，用于指由SEQ IDNO：1的核酸序列编码的蛋白质和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。

Dll4拮抗剂包括能够阻断Dll4与下述结合的Dll4抗体及其片段：Notch受体(诸如Notch1和Notch4)、包含融合至多聚化成分上的Dll4胞外域的融合蛋白质或其片段(例如参见美国专利申请公开号2006/0134121和2008/0107648)；以及肽和肽体(peptibodies)(例如参见，美国专利申请公开号2003/0229023)。

除非另外明确指出，否则本文使用的术语“抗体”应当理解为包括：包含两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的抗体分子(即，“完全的抗体分子”)及其抗原结合片段。本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括与抗原特异性结合形成复合物的任何天然存在的、可通过酶获得的、合成的、或遗传工程的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可应用任何合适的标准技术例如从完全的抗体分子衍生得到，所述技术诸如是蛋白水解消化或包括编码抗体可变结构域及任选的恒定结构域的DNA的操作和表达的重组基因工程技术。此类DNA是公知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(例如包括噬菌体-抗体文库)获得，或可合成得到。可对DNA进行测序以及进行化学操作或通过应用分子生物学技术操作，例如将一个或多个可变和/或恒定结构域排列至合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸等等。

抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab′)₂片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补决定区(CDR))。其他工程分子，诸如双体(diabodies)、三体、四体和微型体(minibodies)也包括在本文使用的表述“抗原结合片段”之内。

抗体的抗原结合片段一般将包含至少一个可变结构域。该可变结构域可以是任意大小的或具有任意的氨基酸组成，并且通常将包含与一个或多个框架序列相邻或在一个或多个框架区构架内的至少一个CDR。在具有与V_L结构域相关联的V_H结构域的抗原结合片段中，该V_H和V_L结构域可以以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚的，并含有V_H-V_H、V_H-V_L或V_L-V_L二聚体。备选地，抗体的抗原结合片段可含有单体V_H或V_L结构域。

在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可在本发明的抗体的抗原结合片段中发现的可变和恒定结构域的非限制性、示例性构型包括：(i)V_H-C_H1；(ii)V_H-C_H2；(iii)V_H-C_H3；(iv)V_H-C_H1-C_H2；(v)V_H-C_H1-C_H2-C_H3；(vi)V_H-C_H2-C_H3；(vii)V_H-C_L；(viii)V_L-C_H1；(ix)V_L-C_H2；(x)V_L-C_H3；(xi)V_L-C_H1-C_H2；(xii)V_L-C_H1-C_H2-C_H3；(xiii)V_L-C_H2-C_H3和(xiv)V_L-C_L。在可变和恒定结构域的任何构型(包括上述任何示例性构型)中，可变和恒定结构域可彼此直接连接或通过完全或部分铰链区或连接区连接。铰链区可由至少2(例如，5、10、15、20、40、60或更多)个氨基酸组成，其在单个多肽分子中的相邻可变和/或恒定结构域之间产生柔性的或半柔性连接。此外，本发明抗体的抗原结合片段可包含上述的任何可变和恒定结构域构型非共价地彼此关联和/或与一个或多个单体V_H或V_L结构域关联(例如，通过二硫键)的同型二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。

如完全的抗体分子那样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段一般地将包含至少两个不同的可变结构域，其中每一个可变结构域能够特异性地与单独的抗原结合、或与相同抗原上的不同表位结合。包括本文公开的示例性双特异性抗体类型(format)在内的任何多特异性抗体类型可以采用本领域可获得的常规技术而适用于本发明抗体的抗原结合片段的情况中。

本文使用的术语“人抗体”意图包括具有得自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人mAb可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变、或通过体内体细胞突变而引入的突变)，例如在CDR中，并且尤其是在CDR3中。然而，本文使用的术语“人抗体”不意图包括其中衍生自另一哺乳动物物种种系(例如小鼠)的CDR序列嫁接到人FR序列中的mAb。

与相应种系序列相比较，本文公开的完全的人抗-Dll4抗体可在重链和轻链可变结构域的框架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失。此类突变可通过将本文公开的氨基酸序列与例如可从公开的抗体序列数据库中获得的种系序列相比较而很容易地确定。本发明包括衍生自本文公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架区和/或CDR区中的一个或多个氨基酸回复突变为相应的种系残基或相应种系残基的保守氨基酸置换(天然或非天然)(此类序列改变可称为“种系回复突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，可容易地产生许多包含一个或多个单独的种系回复突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，V_H和/或V_L结构域中的所有框架和/或CDR残基均回复突变为种系序列。在其他实施方案中，仅有某些残基回复突变为种系序列，例如仅为在FR1的前8个氨基酸或FR4的后8个氨基酸中发现的突变残基，或仅为CDR1、CDR2或CDR3中发现的突变残基。此外，本发明的抗体可含有框架区和/或CDR区中的两个或更多个种系回复突变的任何组合，即其中某些个体残基突变回种系序列，而某些与种系序列不同的其他残基得以保留。一旦获得，则可容易地测试含有一个或多个种系回复突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种期望的性质，诸如改进的结合特异性、升高的结合亲和性、改进的或增强的拮抗或激动生物学性质(按它们可能的情况)、降低的免疫原性等。以这种一般方法得到的抗体和抗原结合片段包括在本发明之内。

本发明还包括包含本文公开的任意HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体的抗Dll4抗体，其中所述变体具有一个或多个保守置换。例如，本发明包括这样的抗Dll4抗体，其包含相对于本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少、2个或1个保守氨基酸置换的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列。在一个实施方案中，HCVR包含其中具有10个或更少保守氨基酸置换的SEQ ID NO：116的氨基酸序列。在另一个实施方案中，HCVR包含其中具有8个或更少保守氨基酸置换的SEQ ID NO：116的氨基酸序列。在另一个实施方案中，HCVR包含其中具有6个或更少保守氨基酸置换的SEQ ID NO：116的氨基酸序列。在另一个实施方案中，HCVR包含其中具有4个或更少保守氨基酸置换的SEQ ID NO：116的氨基酸序列。在又一个实施方案中，HCVR包含其中具有2或1个保守氨基酸置换的SEQ ID NO：116的氨基酸序列。在一个实施方案中，LCVR包含其中具有10个或更少保守氨基酸置换的SEQ ID NO：118的氨基酸序列。在另一个实施方案中，LCVR包含其中具有8个或更少保守氨基酸置换的SEQ IDNO：118的氨基酸序列。在另一个实施方案中，LCVR包含其中具有6个或更少保守氨基酸置换的SEQ ID NO：118的氨基酸序列。在另一个实施方案中，LCVR包含其中具有4个或更少保守氨基酸置换的SEQ ID NO：118的氨基酸序列。在又一个实施方案中，LCVR包含其中具有2个或1个保守氨基酸置换的SEQ ID NO：118的氨基酸序列。

“中和”或“阻断”性抗体用来指结合Dll4导致Dll4生物活性抑制的抗体。这种Dll4生物活性的抑制可通过测量Dll4生物活性的一种或多种指示物来评价。这些Dll4生物活性的指示物可通过本领域已知的若干标准的体外或体内检测中的一种或多种检测来评价。例如，通过Dll4与Notch受体的结合所受到的抑制，评价抗体的中和Dll4活性的能力。

术语“特异性结合”等的意思是抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可通过至少约1x10^-6M或更低(例如，更小的K_D表示更紧密的结合)的平衡解离常数来表征。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域公知的，并且例如包括平衡透析法、表面等离子体共振等。然而，与hDll4特异性结合的分离的抗体可展示出与其他抗原(诸如来自其他物种的Dll4分子)的交叉反应性。此外，与hDll4以及一种或多种其他抗原结合的多特异性抗体(例如，双特异性)仍然被认为是本文所使用的与hDll4“特异性结合”的抗体。

本文使用的术语“K_D”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。

术语“高亲和性”抗体是指以少于约500pM、少于约400pM、少于约300pM、或少于约200pM的K_D与Dll4结合的那些抗体，如通过表面等离子体共振(例如BIACORE^TM)或溶液亲和性ELISA，应用例如单体Dll4所测得；或以少于约100pM、少于约50pM、或少于约20pM的K_D与Dll4结合的那些抗体，如通过表面等离子体共振应用二聚体Dll4所测得。

本文所使用的术语“表面等离子体共振”是指允许通过检测生物传感器矩阵中的蛋白质浓度的改变分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如应用BIACORE^TM系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，N.J.)。

术语“表位”是抗原的被抗体结合的区域。表位可作为结构或功能来定义。功能表位通常是结构表位的子集，并且具有直接对相互作用的亲和性作出贡献的那些残基。表位也可以是构象的，即由非线性的氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可包括决定簇，其为分子诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基基团或磺酰基团的化学活性表面的集合，以及在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。

化疗剂是可用于治疗癌症的化合物，并且包括生长抑制剂或其他细胞毒性剂。可用于本发明方法的化疗剂的实例包括烷化剂诸如塞替派和环磷酰胺

烷基磺酸酯类诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类诸如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；亚乙基亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺和trimethylolomelamine；氮芥类诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氧化氮芥盐酸盐、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；硝基脲类诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素(calicheamicin)、carabicin、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-FU；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧脲苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，诸如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素类，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺；氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；

雷佐生；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类家族成员，诸如紫杉醇(

Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西紫杉醇(Aventis Antony，France)及其类似物；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨；受体酪氨酸激酶和/或血管发生抑制剂，包括索拉非尼(

Bayer Pharmaceuticals Corp.)、舒尼替尼(

Pfizer)、帕唑帕尼(pazopanib)(VOTRIENT^TM，GlaxoSmithKline)、toceranib(PALLADIA^TM，Pfizer)、凡德他尼(vandetanib)(ZACTIMA^TM，AstraZeneca)、西地尼布(cediranib)(

AstraZeneca)、regorafenib(BAY 73-4506，Bayer)、阿西替尼(axitinib)(AG013736，Pfizer)、来他替尼(lestaurtinib)(CEP-701，Cephalon)、厄洛替尼(erlotinib)(

Genentech)、吉非替尼(Iressa^TM，AstraZeneca)、BIBW 2992(TOVOK^TM，Boehringer Ingelheim)、拉帕替尼(lapatinib)(

GlaxoSmithKline)、neratinib(HKI-272，Wyeth/Pfizer)；等等，以及上述任何化合物的可药用盐、酸或衍生物。在该定义中还包括起调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂诸如抗雌激素类，例如包括他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑类、4-羟泰米芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬()；以及抗雄激素类，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何物质的可药用盐、酸或衍生物。其他常用的细胞毒化合物，如在Wiemann等，1985，Medical Oncology(Calabresi等编辑)，第10章，McMillan Publishing中公开的那些，可用于本发明的方法中。

术语“生长抑制剂”是指在体外或在体内抑制细胞、尤其是癌细胞生长的化合物或组合物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进展(在非S期的位置)的抑制剂，诸如诱导G1停止和M-期停止的物质。典型的M-期阻断剂包括长春胺(长春新碱和长春碱)；紫杉烷家族成员，包括但不限于紫杉醇

多西紫杉醇及其类似物(例如，XRP9881和XRP6258；参见Ojima等，Curr Opin Investig Drugs 4：737，2003)；以及拓扑异构酶抑制剂，诸如伊立替康、托泊替康、喜树碱、片螺素(lamellarin)D、多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。那些停止G1的治疗剂还溢出进入S期停止，例如DNA烷化剂诸如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-FU和阿糖胞苷。

一般说明

本发明是基于这样的发现，即共同施用Dll4拮抗剂(例如，与Dll4特异性结合并阻断Dll4活性的Dll4抗体或其片段)和化疗剂(例如，顺铂或多西紫杉醇)导致比任一单独治疗剂更高的肿瘤生长抑制。对于完全的人Dll4Ab，包括重组人Dll4Ab的描述，参见国际专利申请公开号WO2008/076379。

Dll4Ab的制备方法

制备抗体的方法是本领域公知的。参见，例如，Kohler & Milstein(1975)Nature 256：495-497；Harlow & Lane(1988)Antibodies：a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY)。从非人的生物体如小鼠、大鼠、兔、牛分离出的抗体，可通过嵌合或人源化使其更类似于人的。

非人(例如，鼠)抗体的“人源化”或嵌合形式为含有衍生自非人免疫球蛋白的结合抗原所需最小序列的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂或抗体的其它结合抗原的亚序列)。它们与提供构建嵌合或人源化抗体的起始原料的小鼠或其它非人抗体具有相同或相似的结合特异性和亲和性。嵌合抗体是其轻链和重链基因已经由属于不同物种的免疫球蛋白基因片段构建(通常通过遗传工程)的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变(V)片段可与人恒定(C)片段如IgG1和IgG4连接。因此典型的嵌合抗体为由来自小鼠抗体的V或抗原结合结构域和来自人抗体的C或效应器结构域组成的杂交蛋白。人源化的抗体具有基本上来自人抗体(称为受体抗体)的可变区框架残基和基本上来自小鼠抗体(称为供体免疫球蛋白)的互补决定区(CDR区)。参见，Queen等，Proc.Natl.AcadSci. USA 86：10029-10033(1989)和国际专利申请公开号WO 90/07861和U.S.专利5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101和5,225,539。若存在的话，则恒定区也基本上或完全来自人免疫球蛋白。人可变结构域通常选自这样的人抗体，即其框架序列显示出与从其获得CDR的鼠可变区结构域的高度序列同一性。重链和轻链可变区框架残基可源自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然存在的人抗体序列或可以是数种人抗体的共有序列。参见国际专利申请公开WO92/22653。基于其对CDR构象和/或对抗原结合的可能影响，选择来自人可变区框架残基的某些氨基酸用于置换。这种可能影响的研究可通过特定位点的氨基酸特性的模拟、检验或者经验性观察特定氨基酸的置换或诱变的效应来进行。例如，当鼠可变区框架残基和所选择的人可变区框架残基之间的氨基酸不同时，通常人框架氨基酸将被来自小鼠抗体的等价框架氨基酸置换，条件是当合理预期所述氨基酸：(1)非共价直接结合抗原；(2)与CDR区邻接；(3)否则与CDR区(例如在CDR区的约

之内)相互作用，或(4)参与V_L-V_H界面。其它用于置换的候选者是在该位置上对于人免疫球蛋白不常见的受体人框架氨基酸。这些氨基酸可被来自小鼠供体抗体的等价位置或来自更典型的人免疫球蛋白的等价位置的氨基酸置换。其它用于置换的候选者是在该位置上对于人免疫球蛋白不常见的受体人框架氨基酸。人源化的免疫球蛋白的可变区框架通常显示与人可变区框架序列或此类序列的共有序列至少85％的序列同一性。

产生人抗体的方法包括，例如，VELOCIMMUNE^TM(RegeneronPharmaceuticals)、XENOMOUSE^TM技术(Abgenix)，“minilocus”方法和噬菌体展示。VELOCIMMUNE^TM技术(US专利6,596,541)包括产生对选定抗原具有高特异性的完全人抗体的方法。该技术涉及具有包含可操作性连接至内源性小鼠恒定区位点(loci)的人重链和轻链可变区的基因组的转基因小鼠的产生，使得小鼠响应抗原刺激产生包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。编码该抗体的重链和轻链的可变区的DNA经分离并可操作性连接至编码人重链和轻链恒定区的DNA。然后在能表达完全人抗体的细胞中表达所述DNA。在一个实施方案中，细胞为CHO细胞。

XENOMOUSE^TM技术(Green等，1994，Nature Genetics 7：13-21)产生同时具有来自重链和κ轻链位点的人可变区和恒定区的小鼠。在另一方法中，其他人已经使用了‘minilocus”方法，其中通过包含源自Ig位点的个体基因模拟外源性Ig位点(参见，例如，US专利5,545,807)。可分离与编码人重链和轻链恒定区的DNA操作性连接或不连接的编码可变区的DNA。

备选地，噬菌体展示或相关展示技术可用于鉴定特异性结合Dll4的抗体、抗体片段，诸如可变结构域和异数(heteromeric)Fab片段。(例如参见美国专利申请公开2003/0229023)。

优选的免疫球蛋白(抗体)的筛选和选择可通过本领域已知的各种方法进行。例如，对于特异性针对Dll4的单克隆抗体的存在的初步筛选可通过使用基于ELISA的方法或噬菌体展示进行。优选地进行第二道筛选以鉴定和选择所需的单克隆抗体。第二道筛选可用本领域已知的任何适宜的方法进行。一种优选的方法，称为“Biosensor Modification-AssistedProfiling”(“BiaMAP”)描述于美国专利申请公开2004/101920中。BiaMAP可以迅速识别产生具有所需特性的单克隆抗体的杂交瘤克隆。更具体而言，基于抗体：抗原相互作用的评价将单克隆抗体分类为不同的表位相关组。备选地，基于ELISA的、基于珠子的或基于

的竞争分析可用于鉴定结合对，所述结合对结合不同的Dll4表位并因此可能以高亲和性协作结合配体。

施用方法

本发明提供了治疗方法，其包括给受试者施用有效量的包含Dll4拮抗剂(诸如Dll4Ab)以及化疗剂和/或佐剂的药物组合物，所述化疗剂诸如抗有丝分裂剂，例如多西紫杉醇、紫杉醇等(紫杉烷类)；基于铂的化疗化合物，诸如顺铂、卡铂、异丙铂、奥沙利铂等；嘧啶类似物，诸如5-Fu、卡培他滨(Roche)等；拓扑异构酶抑制剂，诸如伊立替康、托泊替康、喜树碱、片螺素D等；所述佐剂诸如亚叶酸(甲酰四氢叶酸)等(详见上面的定义部分)。

Dll4拮抗剂和化疗剂可一起或分开地共同施用。当使用分开剂量制剂时，Dll4拮抗剂和化疗剂可同时施用，或以交错的时间分开施用，即顺次施用。

各种递送系统是已知的且可用于施用本发明的药物组合物，例如脂质体中的包囊、微粒、微囊、能表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞(参见，例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：44294432)。引入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、眼内、硬膜外和口服的途径。组合物可通过任何途径施用，例如通过输注或快速推注、通过上皮或粘膜内层吸收(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)施用，且可与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。施用可以是急性的或长期的(例如，每天、每周、每月等)，或与其他物质联用。也可以采用肺部施用，例如，通过利用吸入器或喷雾器和含雾化剂的制剂施用。

就皮下递送而言，笔式(pen)递送装置容易地应用于递送本发明的药物组合物。此笔式递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置通常利用含有药物组合物的可更换的药筒。一旦该药筒中的所有药物组合物被施用完了，并且该药筒是空的时，可容易地弃去该空药筒，并换上含有药物组合物的新药筒。于是该笔式递送装置可重复使用。在一次性笔式递送装置的情况下，没有可更换的药筒。而是，该一次性笔式递送装置在装置的储器中预填装有药物组合物。一旦该储器没有了药物组合物，则弃去整个装置。

多种可重复使用的笔式递送装置适用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但显然不限于AUTOPEN^TM(Owen Mumford，Inc.，Woodstock，UK)、DISETRONIC^TM笔(Disetronic Medical Systems，Burghdorf，Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25^TM笔、HUMALOG^TM笔、HUMALIN 70/30^TM笔(Eli Lilly and Co.，Indianapolis，IN)、NOVOPEN^TMI、II和III(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、NOVOPEN JUNIOR^TM(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、BD^TM笔(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)、OPTIPEN^TM、OPTIPEN PRO^TM、OPTIPENSTARLET^TM和OPTICLIK^TM(sanofi-aventis，Frankfurt，Germany)，这仅是聊举数例。适用于皮下递送本发明药物组合物的一次性笔式递送装置的实例包括但显然不限于SOLOSTAR^TM笔(sanofi-aventis)、FLEXPEN^TM(Novo Nordisk)和KWIKPEN^TM(Eli Lilly)。

在另一实施方案中，活性剂可以在囊泡(vesicle)或脂质体中递送(参见Langer(1990)Science 249：1527-1533)。在另一实施方案中，活性剂可在控释系统中递送。在一实施方案中，可以使用泵(参见Langer(1990)如上)。在另一实施方案中，可以使用聚合材料(参见Howard等(1989)J.Neurosurg.71：105)。在另一实施方案中，当本发明的活性剂为编码蛋白的核酸时，可通过将其构建为适宜的核酸表达载体的一部分并将其施用使其成为细胞内的，例如通过利用逆转录病毒载体(参见，例如美国专利4,980,286)，或通过直接注射，或通过利用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或以脂质或细胞表面受体或转染剂包衣，或通过以与已知会进入细胞核的同源异型框样肽连接的形式将其施用(参见例如，Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88：1864-1868)等，来体内施用该核酸以促进其编码的蛋白的表达。备选地，可通过同源重组将核酸引入细胞内并掺入宿主细胞DNA中用于表达。

在一具体的实施方案中，可能期望局部地将本发明的药物组合物施用至需要治疗的区域，这可通过以下的方式实现(例如不限于)：在手术期间局部输注、例如通过注射局部施用、通过导管的方式、通过植入物的方式，其中所述植入物为多孔的、非多孔的或凝胶状的材料，包括膜诸如sialastic膜、纤维、或商品化的皮肤替代物。

有效治疗癌症/肿瘤的本发明活性剂的量可基于本说明书通过标准的临床技术来确定。此外，可任选地运用体外试验以帮助确定最佳的剂量范围。用于制剂中的精确剂量还将取决于施用途径和病症的严重程度，并根据医师的判断和每个患者的情况来决定。不过，静脉施用的适宜剂量范围通常为每公斤体重约0.2至30毫克的活性化合物。鼻内施用适宜的剂量范围通常为约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。有效剂量可由从体外或动物模型试验系统获得的剂量-反应曲线来推断

对于全身施用，可从体外测试初步评估治疗有效剂量。例如，可在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养中确定的IC₅₀的循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定人类中的有用剂量。也可从体内数据(例如，动物模型)应用本领域公知的技术估算起始剂量。本领域普通技术人员可基于动物数据容易地最优化人类的施用。

剂量可能根据待施用的受试者的年龄和大小(例如，体重或体表面积)、靶疾病、状况、施用途径等而不同。对于全身施用Dll4拮抗剂特别是Dll4抗体，静脉内施用的典型剂量范围为约0.01至约100mg/kg体重、约0.1至约50mg/kg、或约0.2至约10mg/kg的日剂量。对于皮下施用，该抗体可以以约10mg至约500mg、约20mg至约400mg、约30mg至约300mg、或约50mg至约200mg，以至少约25mg/ml、约50mg/ml、约75mg/ml、约100mg/ml、约125mg/ml、约150mg/ml、约175mg/ml、约200mg/ml或约250mg/ml的抗体浓度，至少每天1至5次、每周1至5次、或每月1至5次地施用。备选地，该抗体可最初通过静脉内注射施用，随后进行连续的(sequential)皮下施用。

一般地，化疗剂以每周50mg/m²至5000mg/m²的剂量范围静脉内或口服使用，但该剂量范围根据多种因素而不同，所述因素包括待治疗的受试者、受试者体重和年龄、疾病的严重度、施用方式、所使用的化疗剂类型、处方医生的判断等。当症状可检测到或甚至当它们不能检测到时，可间歇地重复治疗。治疗的持续时间也会取决于待治疗的疾病的严重程度以及受试者对可能的副作用(若有的话)的耐受水平而不同，并且可持续所需要的时间长度，或只要受益超过任何副作用即可持续。

在联合治疗中每一治疗剂的剂量可进一步调整，其中与单独施用两者中任一治疗剂相比，达到期望治疗效果所需的每一治疗剂的量减少了(即，展示出协同作用)(参见以下实施例1和2)。

可在本发明的联合治疗中使用的化疗剂还包括在公知的化疗方案中应用的那些。例如，FOLFOX是用于治疗结肠直肠癌(CRC)的化疗方案，并且是5-FU、亚叶酸和奥沙利铂的组合。FOLFIRI是用于CRC的另一化疗方案，并且是5-FU、亚叶酸和伊立替康的组合。XELOX是用于CRC的二线化疗方案，并且是卡培他滨和奥沙利铂的组合。

此外，采用化疗剂与Dll4拮抗剂的组合的治疗可单独提供，或与其它药物联合地提供，所述其它药物诸如其它抗血管发生剂，例如VEGF拮抗剂，包括抗VEGF抗体(例如，Genentech的

)、结合VEGF的融合蛋白(例如，Regeneron Pharmaceuticals的aflibercept)等，以及其它治疗剂，诸如镇痛剂、抗炎剂，包括非甾类抗炎药(NSAIDS)，诸如Cox-2抑制剂等，以便于改善和/或减轻伴随根本的癌症/肿瘤的症状。

节律化疗(Metronomic Chemotherapies)

节律化疗作为施用化疗的改进方式出现。传统化疗以不引起威胁生命水平的毒性的最高可能剂量例如以最大耐受剂量(MTD)通过单剂量或短治疗期施用。MTD治疗在相继的治疗周期之间需要2-3周的延长中断期。尽管此类化疗的数量和用于测试它们的大量临床试验，然而就治愈或显著延长罹癌患者生命而言进展是不大的(Kerbel等，2004，Nature ReviewsCancer 4：423-436)。

节律化疗是指以显著低于MTD的剂量频繁地、甚至每天施用化疗，不需要延长的无药中断期。除了降低急性毒性外，当与特定抗血管发生药物(诸如VEGF抑制剂)联合施用时，节律化疗的效力可以增加(Kerbel等，2004，同上)。

因此，本发明涉及在有需要的受试者中治疗癌症的节律化疗方法，其包括给该受试者施用Dll4拮抗剂以及化疗剂，其中所述癌症被治疗。在一具体的实施方案中，可在相对短的时期(例如，1-12周)一起或顺序施用Dll4拮抗剂和化疗剂，然后在延长的时期(例如，6-24个月)节律施用化疗剂。

药物组合物

本发明提供了包含Dll4拮抗剂、化疗剂和可药用载体的药物组合物。术语“可药用的”的意思是经联邦或州政府管理机构批准的或者列在美国药典或其它公认的药典中的供动物更尤其是人使用的。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或溶媒。这类药用载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，诸如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。适宜的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、混悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。组合物可与常规的粘合剂和载体诸如甘油三酯一起配制成栓剂。口服制剂可包括标准的载体诸如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适宜的药用载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中。

在优选的实施方案中，组合物按常规方法配制成适合于静脉内施用给人类的药物组合物。必要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因以在注射部位减轻疼痛。在输注施用组合物的情况下，可用装有无菌药用级水或盐水的输液瓶配制组合物。在组合物注射施用的情况下，可提供一安瓿的灭菌注射水或盐水以便在施用之前可以混合各成分。

本发明的活性剂可以以中性或盐的形式配制。可药用盐包括与游离氨基形成的盐，诸如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等获得的盐，以及与游离羧基形成的盐，诸如由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等获得的盐。

可用于实施本发明方法的组合物可以是包含本发明治疗剂的液体，其为溶液、混悬液、或两者的形式。术语“溶液/混悬液”是指这样的液体组合物，其中第一部分的活性剂存在于溶液中，而第二部分活性剂在液体基质的混悬液中以微粒的形式存在。液体组合物可以是水性的，并且还包括凝胶和软膏形式。

可用于实施本发明方法的水性混悬液或溶液/混悬液可含有一种或多种作为助悬剂的聚合物。有用的聚合物包括水溶性聚合物，诸如交联的含羧基聚合物。本发明的水性混悬液或溶液/混悬液优选为粘稠的或粘膜粘着的，或甚至更优选为粘稠的且粘膜粘着的。

药盒

本发明还提供了生产的物品或药盒，其包含包装材料、容器和包含在该容器中的药物物质，其中所述药物物质包括至少一种Dll4拮抗剂(诸如Dll4抗体)以及至少一种化疗剂，并且其中该包装材料包括指示该Dll4拮抗剂和化疗剂可用于治疗癌症或减少或终止肿瘤生长的标签或包装说明书。在一个实施方案中，Dll4拮抗剂和化疗剂可包含在不同的容器中，因此，本发明提供了一种药盒，其包含：在其中包含特异性结合hDll4的抗体或其抗原结合片段的容器，以及一个或多个在其中包含至少一种化疗剂的其它容器。

实施例

给出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完全公开和说明，而不意欲限制发明人所考虑的其发明的范围。已经努力地确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应说明存在一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压，以及图误差线＝平均值±SEM。

实施例1：抗hDll4抗体与顺铂联合的效果

对移植在表达人源化Dll4蛋白的重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠(人源化Dll4SCID小鼠)中的肿瘤评估了抗Dll4抗体(REGN421)与顺铂(顺氯氨铂，顺-二氯二氨合铂)联合对肿瘤生长的作用。通过在胚胎干(ES)细胞中用人Dll4基因(7kb)的相应细胞外区域替换小鼠Dll4基因的整个细胞外结构域而制得人源化Dll4SCID小鼠。产生纯合hDll4小鼠，并培育成SCID背景。

对每一小鼠皮下(sc)植入1×10⁶个人VM-Cub1肿瘤细胞(膀胱癌细胞)加MATRIGEL^TM(BD Biosciences，#354234)。在肿瘤在小鼠中确立之后(肿瘤大小150-200mm³，植入后约14天)，测量肿瘤，随机化，并用hFc、REGN421、顺铂、或REGN421与顺铂的组合治疗。总共45只小鼠分为9组(每组群n＝5)。第一组用2mg/kg的hFc皮下(sc)治疗；第二和第三组分别用0.5和2mg/kg的REGN421sc治疗；第四和第五组分别用0.5和2mg/kg的顺铂腹膜内(ip)治疗；第六组用0.5mg/kg的REGN421sc和0.5mg/kg的顺铂ip治疗；第七组用0.5mg/kg的REGN421sc和2mg/kg的顺铂ip治疗；第八组用2mg/kg的REGN421sc和0.5mg/kg的顺铂ip治疗；以及第九组用2mg/kg的REGN421sc和2mg/kg的顺铂ip治疗。从第14天开始每3-4天施用REGN421，并且小鼠总共接受3剂量。从第14天开始每24小时施用顺铂，小鼠总共接受4剂量。

为评估REGN421和顺铂作为单独治疗剂或联合治疗的效果，记录肿瘤大小的变化。在开始REGN421治疗前三天、每次REGN421治疗当天(第14、17和21天)以及此后每3-4天测量肿瘤生长，直到肿瘤达到～600mm³大小。应用公式(长×宽²)/2计算体内肿瘤大小(图1和表1)。

表1

治疗(mg/kg/剂量)	TGI(％)	TGD(天)	安乐死(天)
				hFc	-	-	32
REGN421(0.5)	-13.7	0	32
				REGN421(2)	83.1	12	44
顺铂(0.5)	60.7	13	45
				顺铂(2)	53.8	9	41
REGN421(0.5)+顺铂(0.5)	4.4	2	34
				REGN421(0.5)+顺铂(2)	-0.8	0	28
REGN421(2)+顺铂(0.5)	104.8	49	＞81
				REGN421(2)+顺铂(2)	57.9	7	39

肿瘤生长抑制(TGI)通过在对照群组安乐死当天(即第32天)计算被治疗的(T)肿瘤的肿瘤大小相对于溶媒对照(C)肿瘤而言的差异来确定；TGI＝[1-(T_最终-T_初始)/(C_最终-C_初始)]x100。

肿瘤生长延缓(TGD)作为每一群组达到特定肿瘤大小时被治疗的(T)肿瘤与对照(C)肿瘤之间的天数差来评估。这一实验预确定的肿瘤大小为600mm³。

结果显示单独用REGN421治疗导致肿瘤生长减少54％。用顺铂单独治疗导致肿瘤生长减少(0.5mg/kg/注射的剂量为61％减少；而2mg/kg/注射的剂量为54％减少)。与任一单独治疗剂治疗相比，联合治疗产生更高的肿瘤生长的减少(0.5mg/kg/注射的顺铂加2mg/kg/注射的REGN421为104％减少；2mg/kg/注射的顺铂加2mg/kg/注射的REGN421为58％减少)。

这些结果显示用Dll4阻断剂和顺铂的组合(2mg/kg/注射的Dll4阻断剂和0.5mg/kg/注射的顺铂)治疗肿瘤可比任一单独治疗剂产生更高的肿瘤生长抑制。

实施例2：抗hDll4抗体与顺铂联合的效果

对如上所述的移植至人源化Dll4SCID小鼠中的肿瘤评估了REGN421与顺铂联合对肿瘤生长的影响。对每一小鼠皮下(sc)移植5×10⁶个人A549肿瘤细胞(非小细胞肺癌或“NSCLC”)。在小鼠中确立肿瘤之后(肿瘤大小100-150mm³，移植后约29天)，测量肿瘤，随机化，并用hFc、REGN421、顺铂、或REGN421与顺铂的组合治疗。将总共36只小鼠分为6组(每组群n＝6)。第一组用2mg/kg的hFc sc治疗；第二组用2mg/kg的REGN421sc治疗；第三组和第四组分别用2.5和4.5mg/kg的顺铂ip治疗；第五组用2mg/kg的REGN421sc和2.5mg/kg的顺铂ip治疗；以及第六组用2mg/kg的REGN421sc和4.5mg/kg的顺铂ip治疗。从第29天开始每3-4天施用REGN421，并且小鼠总共接受3剂量。从第29天开始每24小时施用顺铂，小鼠总共接受2剂量。

为评估REGN421和顺铂作为单独治疗剂或联用的效果，在开始REGN421治疗前三天、每次治疗剂治疗当天(第29、30、33和36天)以及此后每3-4天测量肿瘤大小(体积)，直到肿瘤达到～600mm³大小。应用公式(长×宽²)/2计算体内肿瘤大小。对肿瘤生长的影响显示于图2和表2。

表2

结果显示单独用REGN421治疗导致肿瘤生长减少54％。用顺铂单独治疗导致肿瘤生长减少(2.5mg/kg/注射的剂量为35％减少；而4.5mg/kg/注射的剂量为22％减少)。与任一单独治疗剂治疗相比，联合治疗产生更高的肿瘤生长的减少(2.5mg/kg/注射的顺铂加2mg/kg/注射的REGN421为69％减少；4.5mg/kg/注射的顺铂加2mg/kg/注射的REGN421为80％减少)。与对照和任一单独治疗剂相比，联合治疗显著地延缓肿瘤生长(2.5mg/kg/注射的顺铂加2mg/kg/注射的REGN421为21天，4.5mg/kg/注射的顺铂加2mg/kg/注射的REGN421为26天)(p＜0.01)。

这些结果显示用Dll4阻断剂与顺铂的组合(2mg/kg/注射的Dll4阻断剂和2.5-4.5mg/kg/注射的顺铂)治疗肿瘤可比任一单独治疗剂产生更高的肿瘤生长抑制。

实施例3：抗hDll4抗体与多西紫杉醇联合的效果

对移植在重度联合免疫缺陷症(SCID)小鼠中的肿瘤评估了抗hDll4抗体与多西紫杉醇

联合对肿瘤生长的影响。将每一小鼠皮下(sc)移植1×10⁶个大鼠C6肿瘤细胞(成胶质细胞瘤细胞)。在肿瘤在小鼠中确立之后(肿瘤大小～100-150mm³，，移植后约13天)，用hFc、多西紫杉醇、Dll4抗体、或多西紫杉醇与Dll4抗体的组合进行治疗。由于这些小鼠表达小鼠Dll4，因此这一实验中使用的Dll4Ab是基于公开的序列(国际专利申请公开WO 2007/143689)内部制备的，并且称之为REGN 577。REGN577结合人和小鼠Dll4，但不能可检测地结合人Dll1和JAG1。将总共30只携瘤雄性小鼠随机分为6组(N＝5)。第一组用hFc(25mg/kg)皮下治疗并用溶媒静脉内(iv)治疗；第二组用5mg/kg的REGN577sc治疗；第三组用4.5mg/kg的多西紫杉醇iv治疗；第四组用6mg/kg的多西紫杉醇iv治疗；第五组用4.5mg/kg的多西紫杉醇iv加5mg/kg的REGN577sc治疗；以及第六组用6mg/kg的多西紫杉醇iv加5mg/kg的REGN577sc治疗。多西紫杉醇和/或Dll4抗体在同一天施用。动物每周接受2次治疗，并且总共接受3剂量。从开始治疗当天开始，每周测量体重和肿瘤两次，直到当肿瘤达到～600mm³时对小鼠实施安乐死。应用公式(长x宽²)/2计算肿瘤大小。

对照肿瘤在第25天达到～600mm³大小，并收获。在第25天，结果显示单独用Dll4抗体治疗导致不大的肿瘤生长减少(约44％)。单独用多西紫杉醇治疗导致肿瘤生长减少(4.5mg/kg的剂量为62％减少；以及6mg/kg的剂量为70％减少)。联合治疗产生比对照和任一单独治疗剂治疗更大的肿瘤生长减少(4.5mg/kg多西紫杉醇加Dll4Ab为75％减少；以及6mg/kg多西紫杉醇加Dll4Ab为81％减少)。测定了TGI和TGD(表3)。

表3

这些结果显示：与任一单独治疗剂相比，用Dll4阻断剂和各种剂量的多西紫杉醇的组合治疗肿瘤可使肿瘤生长延缓几乎两倍长的时间，并导致更高的肿瘤生长抑制。

实施例4：抗hDll4抗体与多西紫杉醇联合的效果

对移植在重度联合免疫缺陷症(SCID)小鼠中的肿瘤评估了抗Dll4抗体与多西紫杉醇(

sanofi-aventis)联合对肿瘤生长的影响。对每一小鼠应用MATRIGEL^TM(BD Biosciences编号#84540)“假常位地”移植(皮下移植至乳腺#3)5×10⁶个人MDA-MB-231乳腺癌细胞。在肿瘤在小鼠中确立之后(肿瘤大小～150-200mm³，移植后约45天)，用hFc、多西紫杉醇、Dll4抗体、或多西紫杉醇与Dll4抗体的组合治疗小鼠。将总共25只携瘤雄性小鼠随机分为5组(每组N＝5)。第一组用hFc(25mg/kg)皮下和溶媒静脉内(iv)治疗；第二组用5mg/kg的Dll4抗体REGN577sc治疗；第三组用4.5mg/kg的多西紫杉醇iv治疗；第四组用6mg/kg的多西紫杉醇iv治疗；第五组用6mg/kg的多西紫杉醇iv加5mg/kg的REGN577sc治疗。多西紫杉醇和/或Dll4抗体在同一天施用。动物每周治疗2次，并且总共接受3剂量。从开始治疗当天开始，每周测量体重和肿瘤两次，直到对小鼠实施安乐死。当肿瘤达到～600mm³时对小鼠实施安乐死。应用公式(长x宽²)/2计算肿瘤大小。

对照肿瘤在第63天达到～600mm³大小，并收获。在第63天，结果显示单独用多西紫杉醇治疗导致不大的肿瘤生长减少(4.5mg/kg的剂量为37％减少；以及6mg/kg的剂量为52％减少)。单独用Dll4抗体治疗导致显著的肿瘤生长减少(约85％减少)；同时联合治疗导致肿瘤消退(6mg/kg多西紫杉醇加Dll4Ab为105％减少)。测定了TGI和TGD(表4)

表4

多西紫杉醇单独治疗产生最小的肿瘤生长延缓(4.5mg/kg的剂量为4天；以及6mg/kg的剂量为4天)。单独用Dll4抗体治疗的肿瘤使肿瘤生长延缓21天。联合治疗比对照和任一单剂量治疗更加延缓肿瘤生长(6mg/kg多西紫杉醇加Dll4Ab为28天，p＜0.5)。

这些结果显示MDA-MB-231肿瘤对多西紫杉醇单独治疗仅有不大的反应，但对抗Dll4抗体治疗非常敏感。与任一单独治疗剂相比，Dll4阻断剂与多西紫杉醇的组合能进一步延缓肿瘤生长，并轻微地改善肿瘤生长抑制(肿瘤消退)。

实施例5：抗hDll4抗体与5-FU联合的效果

对移植在人源化Dll4SCID小鼠中的肿瘤评估了抗Dll4抗体(REGN421)与5-FU联合对肿瘤生长的影响。每一小鼠皮下(sc)移植5×10⁶个人HCT116肿瘤细胞(CRC)。在肿瘤在小鼠中确立之后(肿瘤大小～150mm³，移植后22天)，测量肿瘤，并随机化。用hFc、REGN421、5-FU或REGN421与5-FU的组合治疗小鼠。总共30只小鼠分为6组(每组群n＝5)。第一组用2mg/kg的hFc sc治疗；第二组用2mg/kg的REGN421sc治疗；第三组和第四组分别用15和25mg/kg的5-FU ip治疗；第五组用2mg/kg的REGN421sc和15mg/kg的5-FU ip治疗；以及第六组用2mg/kg的REGN421sc和25mg/kg的5-FU ip治疗。从第22天开始每3-4天施用REGN421，并且小鼠总共接受3剂量。从第22天开始每3-4天施用5-FU，小鼠总共接受3剂量。

为评估REGN421和5-FU作为单独治疗剂或联用的效果，测量肿瘤大小(体积)的变化，在开始REGN421治疗前三天开始，然后在每一治疗剂治疗当天(第22、26和29天)以及此后每3-4天进行测量，直到肿瘤达到～600mm³大小。应用公式(长×宽²)/2计算体内肿瘤大小(图3和表5)。

表5

5-FU单独治疗导致最小的肿瘤生长延缓(45mg/kg总剂量为4天，以及75mg/kg总剂量为2天)。用Dll4抗体单独治疗的肿瘤使肿瘤生长延缓6天。与对照相比，联合治疗进一步延缓肿瘤生长(p＜0.043)。

实施例6：抗hDll4抗体与伊立替康联合的效果

对移植在人源化Dll4SCID小鼠中的肿瘤评估了抗Dll4抗体(REGN421)与伊立替康(盐酸伊立替康)联合对肿瘤生长的影响。

对每一小鼠皮下(sc)移植5×10⁶个人HCT116肿瘤细胞。在肿瘤在小鼠中确立之后(肿瘤大小～150mm³，移植后15天)，测量肿瘤，并随机化。用hFc、REGN421、伊立替康或REGN421与伊立替康的组合治疗小鼠。总共30只小鼠分为6组(每组群n＝5)。第一组用2mg/kg的hFc sc治疗；第二组用2mg/kg的REGN421sc治疗；第三组和第四组分别用7.5和25mg/kg的伊立替康ip治疗；第五组用2mg/kg的REGN421sc和7.5mg/kg的伊立替康ip治疗；以及第六组用2mg/kg的REGN421sc和25mg/kg的伊立替康ip治疗。从第15天开始每3-4天施用REGN421，并且小鼠总共接受3剂量。从第15天开始每3-4天施用伊立替康，小鼠总共接受3剂量。

为评估REGN421和伊立替康作为单独治疗剂或联用的效果，测量肿瘤大小(体积)的变化，在开始REGN421治疗前三天开始，然后在每一治疗剂治疗当天(第15、19和22天)以及此后每3-4天进行测量，直到肿瘤达到～600mm³大小。应用公式(长×宽²)/2计算体内肿瘤大小。结果显示于图4和表6中。

表6

伊立替康单独治疗导致肿瘤生长的延缓(22.5mg/kg的总剂量为8天，以及75mg/kg的总剂量为16天)。用Dll4抗体单独治疗的肿瘤使肿瘤生长延缓9天。与任一单独治疗剂治疗相比，联合治疗显著地提高了抗肿瘤效力和进一步延缓肿瘤生长(75mg/kg伊立替康加Dll4Ab延缓19天，p＜0.0001)。

实施例7：抗hDll4抗体对Colo205肿瘤中Hey1基因表达的影响

在移植有人Colo205结肠直肠肿瘤细胞的人源化Dll4SCID小鼠中研究了抗hDll4抗体对肿瘤中差异基因表达的影响。简而言之，以每只小鼠2x 10⁶个Colo205细胞对雄性和雌性人源化Dll4SCID小鼠进行皮下移植。当肿瘤达到～150mm³时，用单剂量的0.5、5或15mg/kg REGN421、或15mg/kg的hFc对照治疗小鼠(每组4只动物)。在治疗后5小时、10小时、24小时、72小时和7天切除肿瘤，并将其储存在RNA后期稳定剂(Qiagen)中。应用Midi Kit(Qiagen)纯化肿瘤RNA。在混合磨中将组织在含有β-巯基乙醇的裂解缓冲液中匀化，上样至柱中，并洗涤出未结合的污染物。在该柱上进行DNA酶I消化，并将RNA洗脱在无RNA酶的水中。应用QUICK AMP^TM RNA扩增试剂盒(Agilent Technologies)将青蓝3(Cy3)-CTP掺入到从500ng总RNA扩增得到的cRNA中。然后使来自每一样品的Cy3-标记的cRNA与涵盖了小鼠和人转录组的定制阵列杂交。根据生产商的说明进行阵列的杂交和洗涤，并在Agilent微阵列扫描仪上对阵列进行扫描。应用Agilent Feature Extraction软件9.5从扫描的阵列图片提取数据。

为确定对照组和治疗组之间差异表达的基因，将每一芯片中位数中心应用于每一样品的完全基因组谱中。然后应用随机差异模型t-检验比较两组之间的基因表达值(Simon，R.A.等，2007，“Analysis of Gene ExpressionData Using BRB-Array Tools”，Cancer Inform 3：11-7)。选择那些两组间具有超过1.5倍平均差异且p-值＜0.05的基因，并按倍数变化降序排列。还进行了全局测试，其中个体样品标签改变次序达1000次，并重复基因选择过程。这用于确定是否鉴定为两组间差异表达的基因数比单独的偶然原因预期的更大。

Hey1是Hey家族成员，其已被鉴定为Notch活化的直接下游靶点，并且已显示在小鼠研究中体内抑制肿瘤中的Dll4-Notch通路信号导致Hey-1RNA水平的降低(Noguera-Troise，I等，2006，Nature444(7122)：1032-7)。如图5所示，在当前研究中应用微阵列对Hey1mRNA水平的分析揭示，与对照hFc-治疗的小鼠相比，REGN421-治疗的小鼠中Hey1mRNA水平降低了，这种降低从治疗后10小时开始，但在治疗后72小时和7天更显著地降低。在0.5mg/kg即最低剂量的REGN421中没有观察到显著的降低。这些结果表明REGN421有效地阻断了Notch信号通路，以及Hey1可能是用于Dll4抗体抑制Notch信号的有用药效标记物。

实施例8：I期中的初步药物代谢动力学研究

目前正在I期临床试验(first-in-human trial)中研究REGN421。该研究的首要目的是确定用于未来效力试验的REGN421的推荐剂量。第二个目的是表征药物安全情况(safety profile)、其药物代谢动力学、免疫原性和药效学、以及功效的初步证据。在这一研究中，每3周静脉内施用抗hDll4抗体REGN421至患者，所述患者的肿瘤用常规治疗仍然进展。研究设计遵从剂量渐增的标准方法以及剂量限制性毒性的限定。迄今为止，将7位患者以每三周0.25mg/kg/剂量进行治疗，以及将6位患者每三周地以0.50mg/kg/剂量治疗。为进行药物代谢动力学研究，在第一个周期第1天的给药之前、0小时、给药后1、2、4和8小时，随后第2、3、4、8和15天；以及≥2个周期的第1天的给药前、0小时，接下来在治疗后第15、30和60天获得血液样品。通过ELISA测量样品中REGN421的血浆/血清水平，未稀释血清样品中的定量上限是2.5μg/mL且定量下限为0.039μg/mL。该研究正在进行中，目的是施用更高剂量，在方案中定义为1、2、4和7mg/kg/剂量。

目前可获得的数据在表7中显示，所述数据显示了以0.25mg/kg(7位患者)和0.5mg/kg(2位患者)单次30-min.IV输注REGN421后的血浆药物代谢动力学参数。C_最大：药物的最大血清浓度；T_最后：至药物最后的可定量浓度的时间；C_最后：药物的最后可定量浓度；AUC_最后：直至药物最后浓度的曲线下面积；AUC：曲线下总面积(即，药物暴露)；t_1/2Z：终末半衰期；V_ss：稳态分布容积；CL：药物清除率。数值为：平均值、(CV％)以及[范围](a：中位数[范围])。

表7

如表7所示，REGN421的峰血清浓度在0.25mg/kg水平时为平均值6.27μg/mL，以及在0.50mg/kg剂量水平时为9.88μg/mL。这些值在动物异种移植模型中与抗肿瘤活性相关的REGN421浓度范围之内。

已应用微阵列技术对REGN421施用之前以及施用后24小时收集的患者血清样品分析了REGN421对Dll4-notch信号通路的药效作用。结果显示于表8中。

表8

如表8所示，在所有样品中，REGN421施用后Hey-1基因的表达与治疗前的样品相比均降低了。如在人源化Dll4SCID小鼠的异种移植肿瘤模型中观察到的那样(参见上述实施例7)，该结果表明REGN421确实抑制人的Dll4的生物学活性。

实施例9：Dll4Ab与吉西他滨联合施用至I期患者

该研究在患有晚期或转移癌的成年患者中进行，所述癌症难以用标准治疗方法治疗或没有经批准的治疗选择。根据病理、身体和放射检查诊断为患有晚期实体恶性肿瘤、具有ECOG(东部合作肿瘤学组(EasternCooperative Oncology Group))功能状态(performance status)得分0-2(0-5级)以及足够的肾、肝和血液学实验参数的患者有资格参与本研究。患者在研究期间允许接受并行的支持疗法，诸如输血和镇痛药。患者可以已经接受了用于转移性疾病的化疗或生物治疗。将患者分配在3+3设计的顺序增量组群中。将3位患者编入第一剂量水平，若没有出现剂量限制性毒性(DLT)，则将剂量上升至下一剂量水平。如果最先3位患者中的1位经历了DLT，则将3位其他患者编入这一剂量水平。如果最先3位患者中的2位经历了DLT，则将认为该剂量水平具有过度的毒性，并将3位其他患者编入之前的剂量水平。患者将接受：第1天：历时30分钟IV的0.25至10mg/kg抗Dll4抗体(例如REGN421或REGN281)+历时30分钟IV输注的吉西他滨1250mg/m²，以及第8天：历时30分钟IV输注的吉西他滨1250mg/m²。每3周重复该联合治疗方案，直到癌症进展或不能忍受的毒性出现。

主要的终点是评估抗Dll4抗体与吉西他滨联合的安全性、耐受性和剂量限制性毒性，以及在患晚期实体恶性肿瘤患者中鉴定与吉西他滨联合的抗Dll4抗体的最大耐受剂量(MTD)。第二终点包括当与吉西他滨联合时抗Dll4抗体的根据RECIST标准(Eisenhauer等，2009，Eur J Cancer 45：228-247)的抗肿瘤活性的描述，和药物代谢动力学(PK)情况的评估，以及确定抗Dll4抗体的免疫原性。应用身体检查、放射学方法(X-射线、计算机断层扫描或磁共振成像)评估疾病缓解。应用国立癌症研究所不良事件普通术语标准(National Cancer Institute Common Terminology Criteriafor Adverse Events)(CTCAE v 4.0，可在国立癌症研究所网址的癌症治疗评估程序(Cancer Therapy Evaluation Program)或CTEP下获得)评估不良事件。从患者取得血清样品，以测量抗Dll4抗体的浓度以及可能的针对抗Dll4抗体的抗体的存在。

实施例10：给CRC患者施用Dll4Ab和FOLFOX

简而言之，根据病理、身体和放射检查诊断为患有局部晚期或转移结肠直肠癌、具有ECOG(东部合作肿瘤学组)功能状态得分0-2(0-5级)以及足够的肾、肝和血液学实验参数的成年患者有资格参与本研究。患者在研究期间允许接受并行的支持疗法，诸如输血和镇痛药。患者可能还未接受在先的用于转移性疾病的化疗(或抗血管发生、或抗EGFR治疗)；用于他们疾病的辅助治疗的此类在先治疗是允许的，但必须在参加这一研究之前至少12个月已完成。将患者以1∶1的比例随机分配接受：静脉内FOLFOX化疗(第1天：奥沙利铂85mg/m²IV输注和亚叶酸(甲酰四氢叶酸)200mg/m²IV输注，随后历经2-4分钟给予5-FU 400mg/m²IV推注，随后为22小时连续输注5-FU 600mg/m²IV。第2天：亚叶酸200mg/m²IV输注，随后历经2-4分钟给予5-FU 400mg/m²IV推注，随后为22小时连续输注的5-FU 600mg/m²IV输注)和贝伐单抗(：抗血管内皮生长因子(VEGF)的人源化单克隆Ab，Genentech)(第1天：10mg/kg IV)，每两周一次；或第一天0.25至10mg/kg IV抗Dll4抗体(REGN421)与前述治疗的联合。

首要终点是达到至少部分缓解(根据RECIST标准(Eisenhauer等，2009，同上)，同一个癌症病灶直径总和减少30％或更多)的患者比例，以及第二终点包括肿瘤进展时间，以及总存活。应用身体检查、放射学方法(X-射线、计算机断层扫描或磁共振成像)以及血清中测得的癌胚抗原(CEA)水平评估疾病缓解。其它临床参数诸如不良事件也应用国立癌症研究所不良事件普通术语标准(CTCAE v 4.0，同上)进行评估。取得患者的血清样品，以测量抗Dll4抗体的血清浓度以及可能的针对抗Dll4抗体的抗体的存在。

实施例11：Dll4Ab与多西紫杉醇联合的II期

该研究将在患有晚期不能手术或转移乳腺癌的成年患者中进行。他们可能在之前的辅助治疗中已经失败了。根据病理、身体和放射检查诊断为患有乳腺癌、具有ECOG(东部合作肿瘤学组)功能状态得分0-2(0-5级)以及足够的肾、肝和血液学实验参数的患者有资格参与本研究。患者在研究期间允许接受并行的支持疗法，诸如输血和镇痛药。患者可能未接受在先的用于转移性疾病的化疗或生物治疗。在成功通过用以确定患者资格的筛选程序后，将治疗达100例患者的顺序群组。患者将接受：第1天：历时30分钟IV的0.25至10mg/kg抗Dll4抗体(REGN421)+历时30分钟IV输注的多西紫杉醇75mg/m²。每3周重复该联合治疗方案，直到癌症进展或不能忍受的毒性出现。

首要的终点是基于根据RECIST标准(Eisenhauer等，2009，Eur JCancer 45：228-247)的肿瘤响应率以及疾病进展的时间评估治疗效力。第二终点将包括当与多西紫杉醇联合给药时抗Dll4抗体的安全性和药物代谢动力学(PK)情况的描述，以及抗Dll4抗体的免疫原性的确定。应用身体检查、放射学方法(X-射线、计算机断层扫描或磁共振成像)评估疾病缓解。应用国立癌症研究所不良事件普通术语标准(CTCAE v 4.0，可在国立癌症研究所网址的癌症治疗评估程序或CTEP下获得)评估不良事件。从患者取得血清样品，以测量抗Dll4抗体的浓度以及可能的针对抗Dll4抗体的抗体的存在。

实施例12：Dll4Ab与顺铂/吉西他滨的II期研究

该研究将在患有晚期不能手术或转移膀胱癌的成年患者中进行。根据病理、身体和放射检查诊断为患有浸润性膀胱癌、具有ECOG(东部合作肿瘤学组)功能状态得分0-2(0-5级)以及足够的肾、肝和血液学实验参数的患者有资格参与本研究。患者在研究期间允许接受并行的支持疗法，诸如输血和镇痛药。患者可能未接受在先的用于转移性疾病的化疗或生物治疗。在成功通过用以确定患者资格的筛选程序后，将治疗达100例患者的顺序群组。患者将接受在第1天的历时30分钟IV的0.25至10mg/kg抗Dll4抗体(REGN421)，加上第1、8和15天的历时30-60分钟的吉西他滨1,000mg/m²，加上第2天的顺铂70mg/m²。每4周重复该联合治疗方案，直到癌症进展或不能忍受的毒性出现。

首要的终点是基于根据RECIST标准(Eisenhauer等，2009，Eur JCancer 45：228-247)的肿瘤响应率以及疾病进展的时间评估治疗效力。第二终点将包括当与多西紫杉醇联合给与时抗Dll4抗体的安全性情况和药物代谢动力学(PK)情况的描述，以及抗Dll4抗体的免疫原性的确定。应用身体检查、放射学方法(X-射线、计算机断层扫描或磁共振成像)评估疾病缓解。应用国立癌症研究所不良事件普通术语标准(CTCAE v 4.0，可在国立癌症研究所网址的癌症治疗评估程序或CTEP下获得)评估不良事件。从患者取得血清样品，以测量抗Dll4抗体的浓度以及可能的针对抗Dll4抗体的抗体的存在。

Claims

1.分离的与人δ样配体4(hDll4)特异性结合的人抗体或其抗原结合片段，其通过与化疗剂联合施用用于在受试者中治疗癌症或减少或停止肿瘤生长，其中所述人抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述重链可变区包含分别为SEQ ID NO：22、24和26的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区包含分别为SEQ IDNO：30、32和34的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。

2.权利要求1的人抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：116的HCVR序列，或者SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：118的LCVR序列。

3.权利要求1的人抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：20/28或116/118的HCVR/LCVR组合。

4.前述任一项权利要求的人抗体或抗原结合片段，其中所述化疗剂是选自以下的至少一种：抗有丝分裂剂、基于铂的化疗剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、嘧啶类似物、拓扑异构酶抑制剂和佐剂。

5.权利要求4的人抗体或抗原结合片段，其中所述抗有丝分裂剂是多西紫杉醇或紫杉醇、或其可药用类似物或盐。

6.权利要求4的人抗体或抗原结合片段，其中所述基于铂的化疗剂是顺铂、卡铂、异丙铂或奥沙利铂，或者其可药用盐。

7.权利要求4的人抗体或抗原结合片段，其中所述受体酪氨酸激酶抑制剂是索拉非尼、舒尼替尼或帕唑帕尼，或其可药用盐。

8.权利要求4的人抗体或抗原结合片段，其中所述嘧啶类似物是吉西他滨、5-FU或卡培他滨，或其可药用盐。

9.权利要求4的人抗体或抗原结合片段，其中所述拓扑异构酶抑制剂是伊立替康、托泊替康、喜树碱或片螺素D，或其可药用盐。

10.权利要求4的人抗体或抗原结合片段，其中所述佐剂是亚叶酸，或其可药用盐。

11.权利要求4的人抗体或抗原结合片段，其中所述化疗剂是5-FU、亚叶酸和奥沙利铂的组合；5-FU、亚叶酸和伊立替康的组合；卡培他滨和奥沙利铂的组合；或顺铂和吉西他滨的组合。

12.前述任一项权利要求的人抗体或抗原结合片段，其中所述癌症选自卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、皮肤癌、白血病以及恶性软组织肉瘤。

13.前述任一项权利要求的人抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段和所述化疗剂用于同时或顺次施用。

14.前述任一项权利要求的人抗体或抗原结合片段，其用于与权利要求1或4-11中任一项定义的化疗剂联合施用至人受试者。

15.药物组合物，其包含如权利要求1-3中任一项定义的抗体或其抗原结合片段、如权利要求1或4-11中任一项定义的化疗剂、以及可药用载体。

16.药盒，其包含：其中包含如权利要求1-3中任一项定义的抗体或其抗原结合片段的容器，以及一个或多个其中包含至少一种如权利要求1或4-11中任一项定义的化疗剂的其它容器。

17.如权利要求1-3中任一项定义的人抗体或抗原结合片段通过与如权利要求1或4-11中任一项定义的化疗剂联合施用从而用于在受试者中治疗癌症或减少或停止肿瘤生长的用途。

18.如权利要求1-3中任一项定义的人抗体或抗原结合片段在制备通过与如权利要求1或4-11中任一项定义的化疗剂联合施用而用于在受试者中治疗癌症或减少或停止肿瘤生长的药物中的用途。

19.在受试者中治疗癌症或减少或停止肿瘤生长的方法，其包括给所述受试者施用如权利要求1-3中任一项定义的人抗体或抗原结合片段以及如权利要求1或4-11中任一项定义的化疗剂。

20.权利要求17-19中任一项的用途或方法，其中所述癌症如权利要求12所定义。

21.权利要求17-20中任一项的用途或方法，其中所述抗体或抗原结合片段和所述化疗剂用于同时或顺次施用。

22.权利要求17-21中任一项的用途或方法，其中所述受试者是人受试者。

23.减少在罹患癌症或肿瘤的受试者中达到期望治疗效果所需化疗剂的量的方法，该方法包括给所述受试者联合施用所述化疗剂和与hDll4特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段如权利要求1-3中任一项所定义，并且所述化疗剂如权利要求1或4-11中任一项所定义；并且其中与不存在所述抗体或抗原结合片段时达到相同治疗效果所需的量相比，所述化疗剂的量减少了。

24.权利要求23的方法，其中达到期望治疗效果所需化疗剂的量减少了至少20％、或约30％至约50％。