CN102477411A - 含有苹果干细胞提取物的脂肪来源干细胞的干细胞性增进用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有苹果干细胞提取物作为有效成分的脂肪来源干细胞的干细胞性增进用组合物。本发明的组合物含有苹果干细胞提取物作为有效成分，从而增进脂肪来源干细胞的干细胞性，由此对美容或整形为目的的脂肪组织的增加有用。因此，本发明的组合物能够增进皮肤饱满感，使可透过皮肤的低分子成分通过皮肤的传递能够有效地进行，从而促进脂肪来源干细胞的再生，并恢复损伤的皮下脂肪的功能，因此能够作为用于增进皮肤饱满感的美容或整形用组合物而使用，并且能够作为用于增进皮肤饱满感的皮肤外用剂组合物来使用。

Description

含有苹果干细胞提取物的脂肪来源干细胞的干细胞性增进用组合物
技术领域
本发明涉及维持并增进脂肪来源干细胞的特性的干细胞性增进用组合物。
背景技术
皮肤为构成人体的器官中最大的器官，占我们身体体积的约16％，面积为1.8m2，厚度为2～4mm，重量为约3kg，由表皮、真皮以及皮下脂肪层构成。这种皮肤与外部环境直接接触而起到使人体免受人体有害微生物之类的多种有害因子和紫外线等外部刺激的影响的重要的保护膜作用，并且是营造全身的代谢所需的生化功能的对生命维持必不可少的器官。尤其，存在于真皮下方的皮下脂肪层由脂肪细胞(adipocyte)的小叶构成，针对外部的热量起到保护皮肤内部的器官以及吸收冲击的缓冲作用，将营养成分以甘油三酸酯(Triglyceride)的形态储存在称之为脂肪体(Lipid droplet)的细胞小器官中，需要时作为能量源来使用。但是，随着年龄的增加，皮肤因自然性因素和各种外部刺激而受到损伤，尤其，真皮中左右弹性的胶原纤维(胶原蛋白)、弹性纤维(弹性蛋白)的活性以及表达降低，从而弹性降低的同时皮下脂肪中的脂肪生成也减少，结果皮肤全面性地无法正常实现各构成细胞的原本的功能。因此，现在广泛使用的方法为脂肪移植手术，它是利用具有郁金香针(tulipneedle)形状的尖部不锋利的针的注射器，采集自身的脂肪而移植到看上去弹性降低的皮肤的各个部位的手术。但是，有报告指出，在脂肪移植手术以后，移植体积的40～60％重新被吸收到体内，皮肤薄且皮下脂肪少的部位上进行的脂肪移植手术中被指出存在能够摸到细胞块等问题，且实际上移植的脂肪的生存率和生存时间无法达到预期而发生需要再移植的情形。
因此，对能够代替存在这些问题的脂肪移植手术且能够增加足够的皮下脂肪层的组合物的要求提高。另外，由于皮肤的基本结构由皮下脂肪组织来维持，且这些皮下脂肪组织起到左右皮肤的体积和强度的作用，因此与以往使用的给皮肤外围层的真皮或表皮赋予弹性的方法相比，增加脂肪组织的体积的方法反而会对维持皮肤的饱满感
Figure BDA0000113281850000021
起到更好的效果。
因此，为了维持以及增进皮肤的饱满感，期待开发出能够增加脂肪组织的体积的组合物。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种能够使可增加脂肪组织的脂肪来源干细胞的干细胞性增进，并且能够增加皮肤饱满感的组合物。
为实现上述目的，本发明提供一种含有苹果干细胞提取物作为有效成分的脂肪来源干细胞的干细胞性增进用组合物。
另外，本发明提供一种含有苹果干细胞提取物作为有效成分的用于增进皮肤饱满感的美容或整形用组合物。
另外，本发明提供一种含有苹果干细胞提取物作为有效成分的用于增进皮肤饱满感的皮肤外用剂组合物。
本发明的组合物含有苹果干细胞提取物作为有效成分，从而增进脂肪来源干细胞的干细胞性，由此对美容或整形为目的的脂肪组织的增加有效。因此，本发明的组合物能够增进皮肤饱满感，促进脂肪来源干细胞的再生，恢复损伤的皮下脂肪的功能，从而能够作为用于增进皮肤饱满感的美容或整形用组合物而使用，并且能够作为用于增进皮肤饱满感的皮肤外用剂组合物来使用。
附图说明
图1是为了确认本组合物的细胞毒性，对人的脂肪来源干细胞(human adipose derived stem cells，hADSCs)以0.0001～10％浓度的苹果干细胞提取物进行处理，并利用CCK-8试剂盒来确认细胞毒性程度的图表。
图2为向脂肪来源干细胞施加氧化胁迫后，用苹果干细胞提取物进行处理而对代表脂肪来源干细胞的干细胞性特征的基因CD29、44、73、90、105的表达状态进行比较的图表。
图3为向脂肪来源干细胞施加氧化胁迫后，用苹果干细胞提取物进行处理而对代表脂肪来源干细胞的干细胞性特征的蛋白质的表达状态进行比较的图表。
图4为向脂肪来源干细胞施加氧化胁迫后，用苹果干细胞提取物进行处理而确认脂肪来源干细胞分泌的生长因子的图表。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明提供一种含有苹果干细胞提取物作为有效成分的脂肪来源干细胞的干细胞性增进用组合物。上述干细胞性(stemness)是指带有干细胞的自我再生能力和动态平衡且具有干细胞的活性的状态；干细胞性增进是指维持干细胞性或增加干细胞的活性。
获得本发明的苹果干细胞提取物的方法如下。
将苹果的外表面用锋利物造成伤口时，因植物特有的反应而想要进行再生。此时，将再生部位移到培养基板
Figure BDA0000113281850000031
通过一般细胞培养方法使细胞增殖。如此，在培养基上细胞增殖而获得大量的苹果干细胞。在多种植物中选择苹果的原因在于，苹果的干细胞的增殖比其它植物快，且能够获得大量的干细胞，因此使用方便。
本发明的一实施例中，上述脂肪来源干细胞(Adipose derived stemcell：ADSC)是人脂肪来源干细胞(human adipose derived stem cells，hADSCs)。
本发明的一实施例中，上述组合物使脂肪组织增加而提高皮肤的饱满感。上述组合物促进脂肪来源干细胞分化为脂肪细胞而生成脂肪体(Lipid droplet)。因此，使脂肪组织增加而给特定部位的皮肤提高饱满感。
本发明的一实施例中，上述组合物能够增加作为脂肪来源干细胞标记物
Figure BDA0000113281850000032
的分化群29(Cluster of Differentiation29：以下称之为CD29)、分化群44(Cluster of Differentiation 44：以下称之为CD44)、分化群73(Cluster of Differentiation 73：以下称之为CD73)、分化群90(Cluster of Differentiation 90：以下称之为CD90)或分化群105(Cluster of Differentiation 105：以下称之为CD105)的表达量。与阴性对照组比较，CD29、CD44、CD73、CD90或CD105的表达量的增加意味着脂肪来源干细胞的活性的增加。CD29为整合素β1(integrinbeta 1)的别称，是脂肪来源干细胞的标记物，CD44通过Wnt信号(signaling)活性而增加脂肪来源干细胞的活性。CD73是5′-核苷酸酶(5`-nucleotidase)的别称，是将核苷酸转化为核苷的酶，是脂肪来源干细胞的标记物，CD90是Thy1的别称，是干细胞的代表性标记物，CD105为内皮糖蛋白(Endoglin)的别称，是TGFb的受体的一部分，是脂肪来源干细胞的标记物。
本发明的一实施例中，上述组合物使脂肪来源干细胞的生长因子的表达量增加。作为上述生长因子的非限定性例子，可列举神经营养因子3(neurotrophin3：以下称之为NT3)、神经营养因子4(neurotrophin4：以下称之为NT4)、血小板衍生生长因子受体A(platelet-derived growthfactor receptor A：以下称之为PDGF Ra)、血小板衍生生长因子受体B(platelet-derived growth factor receptor B：以下称之为PDGF Rb)、转化生长因子b2(transforming growth factor b2：以下称之为TGFb2)或转化生长因子b3(transforming growth factor b3：以下称之为TGFb3)。与阴性对照组比较，生长因子的表达量的增加意味着脂肪来源干细胞的活性的增加。NT3和NT4与细胞分裂和生长相关的生长因子的一种，PDGF Ra、PDGF Rb、TGFb2以及TGFb3为与细胞分裂和生长相关的生长因子PDGF的受体。
本发明的一实施例中，相对于组合物总重量，上述组合物可含有0.0001～10重量％的苹果干细胞提取物、可优选含有0.0001～0.1重量％、可更优选含有0.0001～0.001重量％。未达到0.0001重量％时效果甚微；若超过10重量％时，存在显示细胞毒性的问题。
本发明的一实施例提供一种含有苹果干细胞提取物作为有效成分的用于增进皮肤饱满感的美容或整形用组合物。
本发明的一实施例中，相对于组合物总重量，上述组合物可含有0.0001～10重量％的苹果干细胞提取物、可优选含有0.0001～0.1重量％、可更优选含有0.0001～0.001重量％。未达到0.0001重量％时，效果甚微；若超过10重量％时，存在显示细胞毒性的问题。
上述组合物例如可用于以下目的使用，即通过形成乳房组织而进行的隆胸，微细脂肪移植术、自身脂肪移植术等增进脸部皮肤的饱满感而去除八字皱纹、眉间皱纹以及维持弹性，但并非仅限于此。
上述组合物可根据药学领域的通常方法来制成适于向患者体内给药的单位给药型制剂来进行给药。符合此目的的剂型优选为作为非口服给药剂型的注射剂或局部给药用制剂等。注射用剂型优选为等渗水溶液或悬浊液。但此时能够将通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或塑形剂一同使用。
这样制备的本发明的制剂可根据通常的方法经非口服，例如向特定部位直接给药。此时，组合物注入利用注射器来实现。上述组合物的1日给药量为1×105到1×107细胞/kg体重、优选为5×105到5×106细胞/kg体重，可分成1次或数次来给药。但是，应理解，有效成分的实际给药量应根据所要分化以及增殖的脂肪细胞的量、给药途径、患者的体重、年龄以及性别等多种相关因素来确定，因此，上述给药量不论是在任何方面上都并非用以对本发明范围进行限定。
本发明的一实施例提供一种含有苹果干细胞提取物作为有效成分的用于增进皮肤饱满感的皮肤外用剂组合物。
本发明的一实施例中，相对于组合物总重量，上述组合物含有0.0001～10重量％的苹果干细胞提取物，可优选含0.0001～0.1重量％，可更优选含0.0001～0.001重量％。未达到0.0001重量％时效果甚微；10重量％以上时，存在显示细胞毒性的问题。
上述皮肤外用剂组合物可以为化妆料组合物或药物组合物。
上述化妆料组合物的剂型没有特别限制，可按需要适当进行选择。例如制备成柔肤水、营养化妆水、按摩霜、精华、营养霜或面膜等剂型，但并非仅限于此。
上述药物组合物可以为洗剂、软膏、凝胶、霜、贴片或喷雾剂等经皮给药型剂型，但并非仅限于此。
就根据各剂型的皮肤外用剂组合物而言，除了上述本发明的组合物之外的其它成分可由本领域技术人员根据其它皮肤外用剂的剂型或使用目的等而毫无难度地进行适当选择并进行配比，此时，与其它原料一同使用时可起到协同效果。
另外，本发明的组合物作为药物组合物来使用时，可进一步含有防腐剂、稳定剂、可湿性粉剂或乳化促进剂、用于渗透压调节的盐或缓冲剂等药物辅料以及其它治疗上有效的物质，根据通常的方法以多种口服或非口服给药形态进行剂型化。
应理解，有效成分的实际给药量应根据症状的严重度、选择的给药途径、对象的年龄、性别、体重以及健康状态等多种相关因素来决定。
通常，有效成分的给药量为0.001mg/kg/日到大约2000mg/kg/日的范围。更优选的给药量为0.5mg/kg/日到2.5mg/kg/日。
本发明的增进脂肪来源干细胞的干细胞性的组合物适用部位包括身体的所有脂肪组织，不限定在特定部位上，例如，可包括脂肪层少的脸部。另外，上述脂肪组织的增加效果有：美容或整形目的的脂肪组织增加效果所致的皮肤饱满感增加效果，但并非限定于此。
以下，通过下述实施例以及实验例来对本发明进行更具体的说明，但这仅仅是用于例示本发明，本发明的范围不被此限定。
[实验例1]研究苹果干细胞提取物在人脂肪来源干细胞中的细胞毒性
将脂肪来源干细胞在75cm2T-flask中进行传代培养，在CO2培养箱(CO2Incubator)中以37℃，5％CO2的条件下进行培养。一般在第二次或第三次中进行了细胞的传代培养(passage)。
将人脂肪来源干细胞(human adipose derived stem cells，hADSCs)从龙沙公司(Lonza，Inc.Walkersville，MD，USA)购入，并根据龙沙公司的说明书来进行培养。为了研究该组合物的细胞毒性，以0.0001～10％的浓度进行处理，并利用CCK-8试剂盒(Dojindo)确认了细胞毒性程度。从图1的结果可知，在以0.001％的浓度处理时无细胞毒性，且达到了约10％左右的细胞分裂增进效果。
[实验例2]测定苹果干细胞提取物对于脂肪来源干细胞标记物基因的表达水平的效果
脂肪来源干细胞的氧化胁迫是用过氧化氢(H2O2)以200uM浓度进行了24小时处理，为了研究脂肪来源干细胞的干细胞性增进效果，将该组合物以0.001％添加到培养基内。去掉脂肪来源干细胞的细胞培养液，用2ml磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗涤细胞之后，然后，使用总RNA提取试剂(Trizol reagent，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分离了细胞内的RNA。
将分离后的RNA用凯杰公司的RNA试剂盒(QIAGEN RNeasy kt，QIAGEN，Valencia，CA)再次提纯后，使用安捷伦公司的2100型生物分析仪(Agilent 2100BioAnalyzer，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)确认了RNA的质量(quality)。利用英杰公司的逆转录酶试剂盒(Superscript Reverse Transcriptase(RT)kit，Invitrogen，Carlsbad，CA)从上述RNA合成了cDNA，将此通过实时逆转录聚合酶链反应(realtime-reverse transcription polymerase chain reaction，Q-RT-PCR)进行了定量分析。
脂肪来源干细胞中CD29、44、73、90、105基因的表达图案变化是利用应用生物系统公司的TaqMan基因表达系统(TaqMangeneexpression assay kit，Applied Biosystems，Foster City，CA)(CD29基因引物：Hs00559595_m1，CD44基因引物：Hs01075861_m1，CD73基因引物：Hs01573922_m1，CD90基因引物：Hs00174816_m1，CD105基因引物：Hs00923996_m1)进行了评价，并将其结果显示在图2中。确认了各基因的表达量比阴性对照组增加了约50％左右。这样的增加在统计学上具有显著性，且该统计是利用双侧t检验进行了验证，表示了当p值在0.05以下时具有显著的差异。
[实验例3]通过流式细胞分析的脂肪来源干细胞的测定
将人脂肪来源干细胞以0.25％胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)从75cm2Ti瓶中进行分离后，以1500rpm使细胞沉淀5分钟后，去掉培养液后，加入3ml封闭液：封闭缓冲液、2％胎牛血清(Fetal calf serum：FCS)及2％牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin(BSA)KGM-2)，使细胞悬浊。
使细胞(约106个细胞)在4℃适应
Figure BDA0000113281850000081
15分钟后，将附着有FITC(异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate))的CD44抗体(CatNo.560977)(BD Pharmingen，CA，US)和附着有PE-Cy(藻红蛋白-花菁(phycoerythrin-cyanine))的CD29抗体(Cat  No.559882)(BDPharmingen，CA，US))各以100∶1加入，在4℃下反应45分钟。另一方面，作为阴性对照组来使用的细胞中将FITC Rat IgG2a，k同种型(isotype)(Cat No.555742)和PE-Cy5mouse IgG1k同种型(Cat No.555750)也以100∶1加入，在4℃下反应45分钟。
反应结束后用3ml洗涤缓冲液(2％Bovine Serum Albumin(BSA)KGM-2)洗涤2次后，使细胞悬浊。此后用FACSCalibur(BD Bioscience，San Jose，CA，U.S)观察脂肪来源干细胞中表达CD29、44的细胞的数量的变化，将其表示于图3、表1中。
表1
  阴性对照组   苹果干细胞提取物
  表达CD29的脂肪来源干细胞   2558   3030
  表达CD29的脂肪来源干细胞   增加％   34％
  表达CD44的脂肪来源干细胞   3112   6363
  表达CD44的脂肪来源干细胞   增加％   104％
参照图3和表1可确认，相比阴性对照组，CD29增加了34％，CD44增加了104％。
[实验例4]确认苹果干细胞提取物所致的脂肪来源干细胞的生长因子的表达
为了研究本发明的苹果干细胞提取物对脂肪来源干细胞的生长因子表达造成的影响，实施了生长因子阵列(Growth factor array，Raybio)。
收获以各条件分别进行培养的脂肪来源干细胞的培养液(conditioned medium)而完成了生长因子阵列。用2ml的封闭液在室温处理30分钟之后，将1ml培养液在常温进行了2小时的处理。此后以2ml的洗涤缓冲液每次5分钟洗涤5次后，与结合了生物素(Biotin)的抗生长因子(anti-growth factor)抗体在常温下反应了2小时。进一步以2ml的洗涤缓冲液每次5分钟洗涤5次后，以结合有HRP的链酶亲和素(streptoavidin)2ml进行处理而反应2小时，利用洗涤缓冲液洗涤后，与检测(detection)缓冲液进行反应，用LAS-3000(Fujifilm)仪器进行显像。
根据图4，分析了共41种的生长因子，结果分析出氧化胁迫导致分泌量减少10％以上，且苹果干细胞提取物的处理导致增加10％以上的生长因子为NT3、NT4、PDGF Ra、PDGF Rb、TGFb2以及TGFb3。这样的增加在统计学上具有显著性，且该统计是利用双侧t检验进行了验证，表示了当p值在0.05以下时具有显著的差异。
以下例示本发明的组合物的剂型例以及制剂例。
[剂型例1]柔肤水
利用表2所示的组成，通过通常的制备方法制备了含有上述实施例1的柔肤水剂型。
表2
  成分   含量(重量％)
  甜菜碱   3.0
  纳托胶   3.0
  纤维素胶   0.005
  乙醇   10.0
  聚氧乙烯氢化蓖麻油   0.2
  醋酸维生素E   2.0
  苹果干细胞提取物   10
  防腐剂   微量
  色素   微量
  香料   微量
  纯净水   余量
[剂型例2]营养化妆水
利用表3所示的组成，通过通常的制备方法制备了含有上述实施例1的营养化妆水剂型。
表3
Figure BDA0000113281850000111
[剂型例3]霜
利用表4所示的组成，通过通常的制备方法制备了含有上述实施例1的霜剂型。
表4
[制剂例1]片剂
将根据本发明的苹果干细胞提取物提取物100mg、乳糖400mg、玉米淀粉400mg以及硬脂酸镁2mg进行混合后，根据通常的片剂的制备方法进行压片而制备出了片剂。
[制剂例2]胶囊剂
将根据本发明的苹果干细胞提取物100mg、乳糖400mg、玉米淀粉400mg以及硬脂酸镁2mg进行混合后，根据通常的胶囊剂的制备方法填充到明胶胶囊中而制备出了胶囊剂。
以上对本发明的特定部分进行了详细叙述，本领域技术人员应知悉这种具体的技术仅仅是优选的实施例而已，这并不会对本发明的范围进行限定。因此，本发明的实质上的范围由权利要求及其等同物来定义。

Claims (11)

1.一种脂肪来源干细胞的干细胞性增进用组合物，其中，含有苹果干细胞提取物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述脂肪来源干细胞为人的脂肪来源干细胞。
3.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述组合物通过增加脂肪组织而使皮肤增进饱满感。
4.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述组合物增加作为脂肪来源干细胞标记物的CD29、CD44、CD73、CD90或CD105的表达量。
5.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述组合物增加脂肪来源干细胞的生长因子的表达量。
6.根据权利要求5所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述生长因子为NT3、NT4、PDGF Ra、PDGF Rb、TGFb2或TGFb3。
7.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，相对于组合物总重量，所述组合物含有0.0001～10重量％的苹果干细胞提取物。
8.一种用于增进皮肤饱满感的美容或整形用组合物，其中，含有苹果干细胞提取物作为有效成分。
9.根据权利要求8所述的用于增进皮肤饱满感的美容或整形用组合物，其中，相对于组合物总重量，所述组合物含有0.0001～10重量％的苹果干细胞提取物。
10.一种用于增进皮肤饱满感的皮肤外用剂组合物，其中，含有苹果干细胞提取物作为有效成分。
11.根据权利要求10所述的用于增进皮肤饱满感的皮肤外用剂组合物，其中，相对于组合物总重量，所述组合物含有0.0001～10重量％的苹果干细胞提取物。
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