CN102475914A - 一种提高骨形态发生蛋白与煅烧骨载体复合效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明所涉及的是生物医学材料的制备领域。特别是一种提高骨形态发生蛋白与煅烧骨载体复合效率的方法。本发明方法是采用(1)煅烧骨的制备，(2)煅烧骨载体与骨形态发生蛋白(BMP)的复合。该方法是通过物理浸润沉积，离子电性吸附和非特异性化学吸附等因素协同作用，因此提高了骨形态发生蛋白(]BMP)与煅烧骨载体的复合率。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料的制备领域。特别是指一种提高骨形态发生蛋白与煅烧骨载体复合效率的方法。
背景技术
骨形态发生蛋白(bone morphogenet ic protein，简称BMP)是一种具有独特诱导成骨功能的机体蛋白因子，在机体骨组织再生和修复过程中发挥着关键作用。现在已可从牛、马、猪、羊、兔、鼠和人骨或骨肉瘤中生化提取不同种属来源的骨形态发生蛋白(BMP)，或利用生物工程技术制备基因重组的人的骨形态发生蛋白(BMP)。利用其诱导成骨活性，有望实现人体断骨的快速再生连接和缺骨的快速再生修复，在骨科和口腔科临床具有广泛的应用前景，并具有重大的经济和社会效益。
为了充分发挥骨形态发生蛋白(BMP)的独特的诱导成骨活性并取得良好的临床治疗效果，需要使骨形态发生蛋白(BMP)与适当的载体复合后使用。载体的作用是多方面的：它为被骨形态发生蛋白(BMP)诱导转化的新生成骨细胞提供附着位点；在骨组织再生和功能重建过程中提供充填、连接、支撑和定位作用；还起到骨形态发生蛋白(BMP)缓释和引导成骨方向和确定成骨范围的作用。载体材料应具有良好的生物相容性和安全性，不引起免疫炎症反应，并易于被组织吸收和同化。
煅烧骨与骨形态发生蛋白(BMP)复合有物理和化学两方面作用。骨形态发生蛋白(BMP)溶液通过浸泡被吸纳入煅烧骨的多孔结构，然后换液使水不溶性的骨形态发生蛋白(BMP)沉积于其中是物理吸附作用；通过调整骨形态发生蛋白(BMP)溶液的离子强度和pH值使带电荷的骨形态发生蛋白(BMP)分子与煅烧骨的无机钙离子发生电性结合或者使骨形态发生蛋白(BMP)与羟基磷灰石发生非特异性吸附是化学吸附作用。复合效率的高低对骨形态发生蛋白(BMP)一煅烧骨活性复合材料的生理作用有着直接的影响。
现有骨形态发生蛋白(BMP)与煅烧骨复合时一般是将水不溶性的骨形态发生蛋白(BMP)用高浓度的强变性剂，如4 mol盐酸胍溶解后，浸泡预成型的煅烧骨块，然后透析换液，使骨形态发生蛋白(BMP)沉淀吸附于载体中，最后冻干保存。这种复合方式主要依靠物理浸润沉积作用和化学非特异性吸附作用。高浓度的盐酸胍溶液具有很高的离子强度，不利于骨形态发生蛋白(BMP)分子与载体上无机钙离子的电性吸附。透析换液的过程缓慢，需要多次反复透析才可能将胍完全除去。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述技术问题，提出一种提高骨形态发生蛋白与煅烧骨载体复合效率的方法。
对于从事生物医学材料的人都清楚，煅烧骨是骨形态发生蛋白(BMP)的较好的载体，而煅烧骨的制备是用动物骨骼经过化学处理和高温煅烧后制成的一种载体材料。它来源于骨，经处理和煅烧后去除了有机成分而保留了骨的无机成分(主要是羟基磷灰石)，经煅烧的松质骨还保留了天然形成的立体多孔网架贯通性骨梁结构。因此，煅烧骨在成分和结构上都与机体骨组织十分接近，有极好的组织相容性，可被新生骨组织完全同化；其天然的多孔网架立体结构有助于细胞的附着和迁移，具有出色的传导成骨的作用；经高温煅烧后整体仍保留一定的机械强度，具有一般天然可降解有机材料无法替代的抗压支撑作用，在缺骨充填、断骨连接和矫形支撑定位等方面都有很大的应用价值；经高温煅烧后去除了有机成分，不会产生免疫排异反应。煅烧骨的主要成分是羟基磷灰石，易于与骨形态发生蛋白(BMP)等骨基质蛋白吸附结合，是一种性能优良的载体材料。
根据本发明方法的目的和煅烧骨载体的特点，我们的具体解决方案是由两部组成，其特征在于(1)煅烧骨载体的制备是取新鲜牛骨或猪骨股骨骺端去肌肉和筋膜， o．5 m01 NaoH浸泡，30％双氧水漂白，3：1氯仿甲醇脱脂，干燥后切削预成型，再置于马弗炉中，先缓慢加温至600。c并恒温，将有机质基本煅烧除去，缓慢降至常温；再升温至11 00。C并恒温煅烧，使材料部分陶瓷化以提高强度，缓慢降至常温，切磨修整成型；
(2)煅烧骨与骨形态发生蛋白(BMP)复合是先将骨形态发生蛋白(BMP)溶解于含6—8 mol尿素的磷酸盐缓冲液pH7．2，离心后取上清浸泡煅烧骨载体，浸泡并搅动24小时，然后根据体积加入无水乙醇至终浓度85％(V／V)，经充分混匀后再于-70。C放置2小时，使骨形态发生蛋白(BMP)沉淀出来，漩涡振荡后离心，用85％乙醇洗涤3—5遍，用无水乙醇洗涤3遍，冻干保存。
采用本发明方法所制备的煅烧骨与骨形态发生蛋白(BMP)复合后具有以下特点，首先是利用了煅烧骨材料在结构和组成成分上与天然骨组织十分相近的特点，使骨形态发生蛋白(BMP)与载体材料构成的活性复合体能够彼此协同促进，更好地发挥诱导成骨的作用。
其次尿素在溶液中并不解离，故此8 m01尿素溶液的离子强度很低，有利于骨形态发生蛋白(BMP)分子与煅烧骨中的羟基磷灰石发生电性吸附；在pH7．2的磷酸盐缓冲液中，pH值为5．5的骨形态发生蛋白(BMP)分子带负电荷，易于与羟基磷灰石中带正电荷的Ca2+离子相结合。提高了复合效率。
再有85％乙醇沉淀和洗涤可以快速除去变性剂尿素，同时起到消毒作用。
总之骨形态发生蛋白(BMP)依靠物理和化学的多方面协同作用与煅烧骨载体相复合，提高了复合效率，也缩短了复合操作所需的时间。
具体实施方式 冶金部钢铁研究总院生物材料与工程中心于1996年用猪和牛的股骨松质骨按照上述方法制备了一批煅烧骨材料。通过与提纯骨形态发生蛋白(BMP)复合，按照上述方法制成骨形态发生蛋白(BMP)一煅烧骨活性复合材料。经小鼠骨囊肿充填实验，表明这种复合剂型易于成型和复合，具有良好的生物相容性和安全性，成骨效果良好。
实施例1
本发明实施例首先是煅烧骨载体的制备应取新鲜的猪骨股骨后端，去肌肉和筋膜，o．5 mol NaoH浸泡，30％双氧水漂白，3：l氯仿甲醇脱脂，干燥后切削预成型，再置于马弗炉中，先缓慢加温至600。C并恒温，将有机质基本煅烧除去，缓慢降至常温；再升温至11 00。C并恒温煅烧，使材料部分陶瓷化以提高强度，缓慢降至常温，切磨修整成型。然后是煅烧骨与骨形态发生蛋白的复合，是将骨形态发生蛋白(BMP)溶解于含6 m01尿素的磷酸盐缓冲液pH7.2，离心后取上清浸泡煅烧骨载体，浸泡并搅动24小时，然后根据体积加入无水乙醇至终浓度85％(V／V)，经充分混匀后再于-70。C放置2小时，使骨形态发生蛋白(BMP)沉淀出来，漩涡振荡后离心，用85％乙醇洗涤3—5遍，用无水乙醇洗涤3遍，冻干保存。
实施例2
本发明实施例首先是煅烧骨载体的制备应取新鲜的牛骨股骨后端，去肌肉和筋膜，o．5 m01 Na0H浸泡，30％双氧水漂白，3：1氯仿甲醇脱脂，干燥后切削预成型，再置于马弗炉中，先缓慢加温至600。C并恒温，将有机质基本煅烧除去，缓慢降至常温；再升温至1100。C并恒温煅烧，使材料部分陶瓷化以提高强度，缓慢降至常温，切磨修整成型。然后是煅烧骨与骨形态发生蛋白的复合，是将骨形态发生蛋白(BMP)溶解于含8 mol尿素的磷酸盐缓冲液pH7．2，离心后取上清浸泡煅烧骨载体，浸泡并搅动24小时，然后根据体积加入无水乙醇至终浓度85％(V／V)，经充分混匀后再于-70。C放置2小时，使骨形态发生蛋白(BMP)沉淀出来，漩涡振荡后离心，用85％乙醇洗涤3—5遍，用
无水乙醇洗涤3遍，冻干保存。
Claims (3)
1. 一种提高骨形态发生蛋白与煅烧骨载体复合效率的方法，其特征在于：该方法是由煅烧骨的制备和煅烧骨载体与骨形态发生蛋白的复合两部份组成。
2.根据权利要求1所述的一种提高骨形态发生蛋白与煅烧骨载体复合效率的方法，其特征在于：煅烧骨载体的制备是取新鲜牛骨或猪骨股骨骺端，去肌肉和筋膜，0．5 mol NaoH浸泡，30％双氧水漂白，3：1氯仿甲醇脱脂，干燥后切削预成型，再置于马弗炉中，先缓慢加温至600。C并恒温，将有机质基本煅烧除去，缓慢降至常温；再升温至11 00。C并恒温煅烧，使材料部分陶瓷化以提高强度，缓慢降至常温，切磨修整成型。
3.根据权利要求1所述的一种提高骨形态发生蛋白与煅烧骨载体复合效率的方法，其特征在于：煅烧骨与骨形态发生蛋白的复合是将骨形态发生蛋白(BMP)溶解于含6—8 mol尿素的磷酸盐缓冲液pH7．2，离心后取上清浸泡煅烧骨载体，浸泡并搅动24小时，然后根据体积加入无水乙醇至终浓度85％(V／V)，经充分混匀后再于-70。C放置2小时，使骨形态发生蛋白(BMP)沉淀出来，漩涡振荡后离心，用85％乙醇洗涤3—5遍，用无水乙醇洗涤3遍，冻干保存。
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