CN102475057B - 一种甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于油菜育种领域，公开了一种甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系(CMS)的选育方法，特征是：以人工合成萝卜甘蓝异源四倍体为母本，以甘蓝型油菜品种为父本杂交，从杂种自交后代中分离雄性不育株，通过连续回交育成稳定遗传的甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系。采用恢保关系测定及分子生物学方法分别从遗传学和DNA水平上研究证明该不育系的不育胞质与波里马细胞质雄性不育(pol CMS)、萝卜细胞质雄性不育(ogu CMS、kos CMS)和芥菜型油菜细胞质雄性不育(hau CMS)等类型均不相同，是一种新的油菜细胞质雄性不育类型。本发明增添了我国及世界油菜细胞质雄性不育新类型。

Description

一种甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系的选育方法

技术领域

本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及到一种甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系的选育方法，属于一种新的育种方法和新的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系材料。 

背景技术

目前，国内外油菜杂种优势利用的花粉控制系统主要有以下几种类型：细胞质雄性不育(简称CMS)、生态型细胞质雄性不育(简称ECMS)、细胞核雄性不育(简称GMS)、自交不亲和(简称SI)、化学杀雄和转基因雄性不育，其中CMS是油菜杂种优势利用最重要的花粉控制系统(傅廷栋等1995)。国内外已报道的油菜CMS类型较多，根据其细胞质来源不同可分为两大类：一类是植物自然繁殖过程中的突变或品种间杂交产生的雄性不育，即同源细胞质雄性不育，主要有波里马细胞质雄性不育(简称pol CMS)、shan2A CMS和nap CMS等类型，这类细胞质雄性不育对温度敏感，有微量花粉，不育性不稳定，从而影响杂种纯度。第二类为远缘杂交或原生质体融合产生的雄性不育，即异源细胞质雄性不育，主要有萝卜细胞质雄性不育(ogu cms和kos cms)和tour cms等类型，这类细胞质雄性不育对温度不敏感、没有花粉、不育性稳定，但发现和利用恢复基因的难度较大。 

目前，我国杂交油菜面积已约占我国油菜总面积的70％，其中细胞质雄性不育杂交种约占整个杂交油菜品种的70％以上，这些甘蓝型油菜细胞质雄性不育杂交种的不育胞质均来源于恢保关系相同的pol CMS和shan2A CMS。为了克服油菜细胞质雄性不育杂种不育胞质单一性的潜在威胁，国内外研究者经过多年的研究，先后发现和创建了Nca cms(从甘蓝型油菜与埃塞俄比亚芥的远缘杂交后代中选育，蔡明等1993)、Nsa cms(从新疆野芥与甘蓝型油菜体细胞杂交后代中选育，胡琼等2004)、Nea cms(通过远缘杂交和辐射诱变产生，蒋梁材等2002)和hau cms(天然野生芥菜型油菜雄性不育)等新型细胞质雄性不育类型，但是这些研究成果仅仅限于资源研究阶段，离实际应用还相差甚远。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系的选育方法，革新甘蓝型油菜现有细胞质雄性不育的温敏特性，育成无花粉型、稳定遗传的甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系，为油菜和十字花科植物杂种优势利用提供细胞质雄性不育新种质。 

本发明通过以下技术方案实现： 

一种甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系的选育方法，其步骤包括以人工合成萝卜甘蓝异源四倍体为母本与甘蓝型油菜品种为父本进行杂交，从杂种自交后代中分离筛选出雄性不育株，通过连续回交和品质检测选择，得到稳定遗传和品质性状优良的甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系，具体选育步骤包括： 

(1)以何庆萝卜为母本，白花芥蓝为父本进行杂交，得到杂种一代，播种该杂种一代，用10mg-50mg/L的秋水仙素处理该杂种一代幼苗，得到萝卜甘蓝异源四倍体；以该萝卜甘蓝异源四倍体为母本，甘蓝型油菜品种YD16作父本杂交，得到杂种一代，播种该杂种一代，选择得到甘蓝型油菜8102(套袋自交)，收获甘蓝型油菜8102的自交种子(该生物材料于2010年11月10日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为：CCTCC NO：P201016)； 

(2)播种甘蓝型油菜8102的自交种子，于花期鉴定其育性，得到甘蓝型油菜雄性不育株LB819，以该不育株LB819(该生物材料于2010年11月10日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为：CCTCC NO：P201015)为母本，以甘蓝型油菜YD16作父本(赵合句等，油菜与菘蓝及荠菜杂交选育抗病高产新品种，中国农业科学，1998，31(2))杂交，得到F1种子； 

(3)播种步骤(2)的F₁种子，于花期鉴定其育性，发现全部不育，以其中甘蓝型油菜雄性不育单株W01作母本，与甘蓝型油菜8102杂交，得到测交F₁种子； 

(4)播种步骤(3)的测交F₁种子，于花期鉴定其育性，得到甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育株系4270，并以所述的雄性不育株系4270作母本与甘蓝型油菜8102回交，得到回交一代BC₁F₁CMS(细胞质雄性不育简称CMS)； 

(5)用步骤(4)得到的BC₁F₁ CMS为母本与甘蓝型油菜8102回交，得到回交二代BC₂F₁ CMS；以后用所述的甘蓝型油菜8102为轮回亲本与所述BC₁F₁ CMS连续回交2-3个世代，直到育成甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系NR04270A。 

本发明的优点在于： 

1.本发明的甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系为无花粉型，对环境反应不敏感，不育性遗传稳定，在中国湖北省武汉市、湖北省长阳县以及甘肃省和政县连续5年10世代种植，其不育性稳定，均表现无花粉，调查结果见表1。 

表1本发明的NR04270A CMS不同环境下的不育性调查及与经典波里马pol CMS的比较 

2.本发明的甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系农艺性状优良，杂交结实率高，有利于繁殖不育系种子和生产杂交种。 

3.本发明的育种目标明确，育种程序简单，育种研究和利用方便。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明用于探针设计的6个与油菜细胞质雄性不育相关的基因的核苷酸序列，基因全长分别为1524bp；787bp；760bp；669bp；1182bp和699bp。 

图1：甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系NRO4270A的选育流程。 

图2：甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系NRO4270A的花器官形态。图中：A为本发明的NRO4270A细胞质雄性不育系(CMS)和对照(正常甘蓝型油菜)的花器官；B：本发明NRO4270A和对照的花器官解剖图；C：本发明NRO4270A细胞质雄性不育系(CMS)的田间表现。 

图3：PCR扩增获得的6个探针电泳检测图(DNA均来自甘蓝型油菜品种华双5号)。图中A为探针atp6、atp1和atp9的扩增带型及片段大小；B：探针cox2的扩增带型及片段大小；C：探针orf222和cob的扩增带型及片段大小。 

图4(含图4续1和图4续2)：是本发明的6个探针/酶组合的Southern杂交结果。图中： 

I：atp1/酶组合；II：atp6/酶组合；III：atp9/酶组合； 

IV：orf222/酶组合；V：cox2/酶组合；VI：cob/酶组合； 

A：探针/EcoR I组合；B：探针/BamH I组合；C：探针/HindIII组合； 

1：pol CMS，2：ogu CMS，3：kos CMS，4-6：NRO4270A CMS， 

7：hau CMS；8：8102(NRO4270A CMS的保持系)；9：华双5号(对照) 

具体实施方式

实施例1：甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系选育 

甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系NRO4270A的选育步骤： 

由图1所示： 

(1)以何庆萝卜(Raphanus sativus L，2n＝18，RR)为母本，白花芥蓝(Brassica alboglabraBailey，2n＝18，CC)为父本进行杂交，得到杂种一代，播种该杂种一代，用0.3％的秋水仙素处理所述杂种一代幼苗，得到萝卜甘蓝异源四倍体(Raphanobrassica，RRCC，2n＝36)(陈洪高，吴江生等，萝卜-芥蓝异源四倍体的合成及GISH分析作物学报，2006，32(8))；以该萝卜甘蓝异源四倍体为母本，甘蓝型油菜品种YD16(赵合句等，油菜与菘蓝及荠菜杂交选育抗病高产新品种，中国农业科学，1998，31(2))作父本杂交，得到杂种一代，播种该杂种一代，选择得到甘蓝型油菜8102套袋自交，收获8102自交种子(该材料于2010年11月10日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：P201016)；

(2)播种甘蓝型油菜8102自交种子，于花期鉴定其育性，得到甘蓝型油菜雄性不育株LB819(该材料于2010年11月10日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：P201015)，以该不育株LB819为母本，甘蓝型油菜YD16作父本进行杂交，得到F1种子； 

(3)播种步骤(2)的F₁种子，于花期鉴定其育性，发现其全部不育，以其中甘蓝型油菜雄性不育单株W01作母本，与甘蓝型油菜8102杂交，得到测交F₁种子； 

(4)播种步骤(3)测交F₁种子，于花期鉴定其育性，得到甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育株系4270，并以所述的雄性不育株系4270作母本与甘蓝型油菜8102回交，得到回交一代BC₁F₁ CMS； 

(5)用步骤(4)得到的BC₁F₁ CMS作母本与甘蓝型油菜8102回交，得到回交二代BC₂F₁ CMS； 

以后用所述的甘蓝型油菜8102作为轮回亲本连续回交2-3个世代，直到育成甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系NR04270A(育种技术路线见图1所示)。 

甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系NR04270A的繁殖： 

在人为设置或选择自然隔离条件下，在湖北省武汉市进行秋播(每年9月，长江流域一般为秋播)或湖北省长阳县火烧坪镇(一种湖北省高山小生态环境)和甘肃省和政县进行夏播(每年5月，甘肃省一般为夏播，)，按甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系：甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育保持系为2∶1或3∶1的行比繁殖甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系，其它栽培条件同正常的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系。 

实施例2：甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系NR04270A的遗传分类 

1.恢保关系测定： 

(1)在甘蓝型油菜中选取8个代表性品种或品系分别与pol CMS、ogu CMS、kos CMS、hau CMS和NR04270A CMS材料进行测交，其恢保关系测定结果如表2所示： 

表2NR04270A CMS与几种油菜CMS材料之间的恢保关系测定结果 

注：(1)表中S表示不育，F表示可育。 

(2)表2所列测交材料是检验本发明材料的恢复程度和保持程度的效果，不是依赖测交材料完成的发明创造(中国现有的育种资源只要具备上述材料的遗传特征均一作为本发明步骤的测交材料，因此本实施例不限于此)。 

表2测交材料的来源： 

25cc1、00N269c、9A001C为ogu CMS和kos CMS的恢复系，是从国外引进的ogu CMS和kos CMS商品种中通过常规方法获得，由华中农业大学油菜研究室提供。 

恢复系7-5、91-恢5900、恢5148为中国国内大面积推广应用的甘蓝型油菜杂交品种华杂9号、华杂5号和华杂7号的父本，即pol CMS的恢复系(www.crop.com.cn)，由华中农业大学油菜研究室提供(国内目前没有审定恢复系作为品种的，这些恢复系只是作为中间材料加以利用，该中间材料通常也是公开的，可以相互交流的，上述恢复系都是华中农业大学选育的，见：www.crop.com.cn作物网上都可以检索到)；华双4号为中国农业部发布，国家级审定的在中国大面积推广应用的甘蓝型油菜品种。 

ogu CMS和kos CMS是从引进的ogu CMS和kos CMS商品种中通过常规方法获得，由华中农业大学油菜研究室提供。 

pol CMS和hau CMS由由华中农业大学油菜研究室提供。是傅廷栋院士从天然甘蓝型油菜和芥菜型油菜细胞质雄性不育株转育而成(pol CMS在全世界都是公开的，hau CMS见参考文献Zhengjie Wanet.al.Genetic characterization of a new cytoplasmic male sterility system(hau)in Brassica juncea and its transferto B.napus.Theor Appl Genet，2008，116：355-362)。 

(2)对测交获得的F₁进行育性调查，结果表明：本发明NRO4270A与其它几类油菜细胞质雄性不育系恢保关系不同。 

2、花药发育的细胞学观察 

取NRO4270A的花蕾制作石蜡切片(参照余风群等，1990；杨光圣等，1998报道的方法，见文末的参考文献)，显微结构观察发现：本发明的不育系NRO4270A花药发育受阻于四分体 至单核花粉期，其主要特点是：在四分体以前，花药发育正常，即与正常花药一样能产生孢原细胞，由孢原细胞分裂分化成造孢细胞，进而发育成花粉母细胞，通过减数分裂形成四分体。小孢子早期，细胞质浓，细胞核居于中央，绒毡层细胞液泡化并逐渐膨大增厚；小孢子中期，细胞质稀薄并继续液泡化，细胞核大多呈不规则形状分布；小孢子晚期，细胞质彻底消失，细胞核解体，绒毡层细胞也逐渐解体并最终消失，药室内仅剩下无细胞结构的残留物，并最终成为空腔。表3所示NRO4270A败育时期与现有的几种油菜细胞质雄性不育系的比较。 

表3  NRO4270A与几种油菜细胞质雄性不育材料花药败育时期比较 

3、RFLP分子标记分析 

(1)从本发明获得蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系NRO4270A CMS、波里马细胞质雄性不育系pol CMS、ogu CMS、kos CMS、hau CMS、8102(NRO4270A CMS的保持系)和甘蓝型油菜品种华双5号(一个在中国大面积公开推广应用的甘蓝型油菜品种为对照)共7份材料中分别提取基因组DNA，提取方法参照经典的CTAB法提取基因组DNA(Dlyle J J andDoyle J L，1990)，具体步骤如下： 

A、加2％报道的CTAB提取液20ml，60℃加热1hr，轻摇，冷却至室温； 

B、加等体积氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)，轻轻混匀，至下层为深绿色，静置10分钟； 

C、将上一步骤中的混合液离心，在3000rpm下离心15分钟； 

D、取上清，加入1/10体积10％CTAB提取液，混匀，于60℃温浴10分钟； 

E、加入等体积氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)纯化，轻轻混匀，3000rpm离心15分钟； 

F、加1倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)沉淀DNA，在-20℃条件下放置20min； 

G、用浓度为76％的乙醇洗涤DNA 2-3次，置于管壁，室温晾干； 

H、加入RNA酶(RNase)消化，37℃，1小时； 

I、加200μl Tris-EDTA(TE)，4℃过夜，待DNA溶解后，检测浓度及质量。 

(2)制备线粒体探针atp1、atp6、atp9、orf222、cox II和cob，这些探针均是根据已公布的油菜细胞质雄性不育基因特异区段(马三梅等，2005；吴豪等，2007)，利用primer5.0软件设计的特异引物进行扩增，其中引物序列及扩增片段大小见表4所示，探针PCR扩增的电泳检测见图3，探针基因序列信息详见表4 

(3)用3种限制性内切酶EcoR I、BamH I和HindIII对上述7份材料的基因组DNA进行酶切。 

(4)进行southern杂交(参见：Sambrook et.al，1989)。 

a.预杂交 

将尼龙膜放入杂交袋中，按照10ml/100cm²的比例加入杂交液(2×柠檬酸钠缓冲液(SSC缓冲液)，杂交液浸没膜，具体配制方法如下所述)，赶气泡，封口，放入65℃的杂交箱中，预杂交6-12hrs。 

表4  本发明用于RFLP分析的几种线粒体探针 

b.探针标记 

探针标记反应体系及操作顺序： 

1-2blots(19.5×9.5cm²)，100ng probe DNA，2.0μl Random primer，加双蒸水至总体系14.0μl。将探针DNA变性(100℃，5min)，再冰浴5min，快速离心，置于冰上；按反应体系加入2.5μl 10×buffer，2.5μl dNTPs(-dCTP)，1.0μl Klenow Fragment；再在同位素操作台上加入2.0μlα-³²P-dCTP(10Ci/μl)，37℃水浴4h以上；沸水变性10min，冰浴10min，备用。 

c.杂交 

加入300μl杂交液(65℃预热)至标记好的探针溶液中，再将混合液加入杂交袋中(忌直接加于膜上)，混匀，65℃杂交过夜。 

d.洗膜 

从低严谨度到高严谨度冼膜：30ml洗膜液A(2×SSC、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，洗膜两次，每次15min；再用30ml洗膜液B(0.5×柠檬酸缓冲液(SSC)、0.1％SDS、65℃预热) 洗膜两次，每次30min，并检测放射性信号强度。 

e.包膜 

从洗膜液中取出膜，置于滤纸上晾干，至膜表面无可见水膜为止(忌太干，以防探针难以洗脱影响再次使用)，用保鲜膜包膜，根据信号强弱压磷屏4-12hrs，置于-4℃。 

f.扫磷屏 

磷屏成像分析系统扫描磷屏，得到同位素标记的杂交结果。 

杂交缓冲液： 

终浓度                      原液            体积. 

5×柠檬酸缓冲液(SSC)        20×            250ml 

50mM PB(pH 6.8)             0.5M            100ml 

5×Denhardt’s              50×            100ml 

2.5mM EDTA(pH 8.0)          0.5M            5ml 

100μg/ml ssDNA             5mg/ml          20ml 

0.4％十二烷基硫酸钠(SDS)    20％            20ml 

Dextran sulfate                             50g 

加双蒸水至                                  1000ml 

20×柠檬酸缓冲液(SSC) 

NaCl        175.3g 

Na₃Citrate  88.2g 

加双蒸水至  1000ml 

(5)RFLP结果分析 

检测结果表明：atp1/酶、atp9/酶、orf222/酶和cox II/酶组合在NRO4270A与其它CMS材料间均检测到多态性，能将本发明的NRO4270A CMS与其它几种CMS材料在线粒体DNA水平上完全区分开；atp6/酶组合不能将NRO4270A CMS与ogu CMS和kos CMS区分开来；cob/酶组合在所有CMS材料中均为检测到多态性(如图4所示)。 

参考文献 

1.蔡明等，甘蓝型油菜雄性不育的遗传研究I，NCa甘蓝型油菜异核型雄性不育材料选育初报，中国油料，1993，4：1-3。 

2.陈洪高，吴江生等，萝卜-芥蓝异源四倍体的合成及GISH分析.作物学报，2006，32(8) 

3.傅廷栋，杂交油菜的育种与利用，武汉，湖北科学技术出版社，1995：42-91。 

4.胡琼等，属间体细胞杂交创建甘蓝型油菜细胞质雄性不育及其鉴定，中国农业科学，2004，37：333～338。 

5.蒋梁材等，甘蓝型油菜细胞质雄性不育材料NEA的发现与遗传研究，中国农业科学，2002， 35(1)：72-78。 

6.马三梅等，与油菜细胞质雄性不育相关的DNA位点和育性恢复基因的研究进展，植物生理与分子生物学学报，2005，31(2)：119-125。 

7.吴豪等，植物细胞质雄性不育及其育性恢复的分子基础，植物学通报，2007，24(3)：399-413。 

8.杨光圣等，甘蓝型油菜细胞质雄性不育的遗传分类研究，中国农业科学，1998，31(1)：27-31。 

9.余凤群等，甘蓝型油菜几个雄性不育系花药发育的细胞形态学研究，武汉植物学研究，1990，8(3)：209-216。 

10.赵合句，油菜与菘蓝及荠菜杂交选育抗病高产新品种，中国农业科学，1998，31(2)。 

11.Dlyle J J，Doyle J L.Isolation of plant DNA from fresh tissue.Focus，1990，12：13-15 

12.Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning：a laboratory manual(2nded.).Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 

13.Zhengjie Wan et.al.Genetic characterization of a new cytoplasmic male sterilitysystem(hau)in Brassica juncea and its transfer to B.napus.Theor ApplGenet，2008，116：355-362 

Claims (2)

1.一种甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系的选育方法，其特征在于：以人工合成萝卜甘蓝异源四倍体为母本与甘蓝型油菜品种为父本进行杂交，从杂种自交后代自交中分离雄性不育株，通过连续回交育成稳定遗传的甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系，其步骤包括：

(1)以何庆萝卜为母本，白花芥蓝为父本进行杂交，得到杂种一代，播种该杂种一代，用10mg/L-50mg/L的秋水仙素处理幼苗，得到萝卜甘蓝异源四倍体；以该萝卜甘蓝异源四倍体为母本，甘蓝型油菜品种YD16为父本进行杂交，得到杂种一代，播种该杂种一代，选择得到甘蓝型油菜8102，收获套袋自交的保藏号为CCTCC NO：P201016的8102自交种子；

(2)播种甘蓝型油菜8102种子，于花期鉴定育性，得到甘蓝型油菜雄性不育株LB819，其保藏号为：CCTCC P2010015，以该不育株LB819为母本，甘蓝型油菜YD16作父本进行杂交，得到F₁种子；

(3)播种步骤(2)的F₁种子，于花期鉴定育性，以其中甘蓝型油菜雄性不育单株WO1作母本，与甘蓝型油菜8102杂交，得到测交F₁种子；

(4)播种步骤(3)测交F₁种子，于花期鉴定育性，得到甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育株系4270，以所述的雄性不育株系4270作母本与甘蓝型油菜8102回交，得到回交一代BC₁F₁CMS；

(5)用步骤(4)中得到的BC₁F₁CMS作母本与甘蓝型油菜8102回交，得到回交二代BC₂F₁CMS；以后用所述的甘蓝型油菜8102为轮回亲本继续回交2-3个世代，直到育成甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系NR04270A。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在秋播或夏播人工或自然隔离条件下，将甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系NR04270A与作为保持系使用的甘蓝型油菜8102按2∶1或3∶1的行比种植，收获不育系所在行的种子，即为甘蓝型油菜萝卜甘蓝细胞质雄性不育系种子。

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