CN102472722A - 利用cnt传感器对过氧化物进行电测定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用了CNT传感器的过氧化物的浓度的测定方法。CNT传感器具有：配置在绝缘基板上的工作电极、接触工作电极的单层碳纳米管、对电极以及参比电极。通过向单层碳纳米管上提供试样，在工作电极和对电极之间形成电位差，能够测定试样中的过氧化物的浓度。本发明的测定方法能够应用于临床检查等。

Description

利用CNT传感器对过氧化物进行电测定的方法
技术领域
本发明涉及利用CNT传感器对过氧化物进行电的测定的方法。
背景技术
利用过氧化氢—过氧化物酶类的生化学检查是临床检查的基本手法之一。例如，在血糖或中性脂肪、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇、脂肪酸、尿酸(痛風的原因物質)、肌酸酐(肾功能的指标)等的检查中，在按每个测定对象而不同的第1工序中，通过对测定对象使用具有特异性的酶的反应而产生过氧化氢，在共同的第2工程中，通过使用了过氧化物酶类反应的分光学方法测定在第1工序中产生的过氧化氢。此外，在免疫测定中，过氧化氢—过氧化物酶类也被用作评价抗原抗体反应的生成物的指标之一。因此，对于这些检查而言，对过氧化氢进行定量是重要的程序。
另一方面，还公开了过氧化氢的电化学测定法。例如，通过将金或铂电极设为工作电极，Ag/AgCl电极等设为参比电极，并在向工作电极施加一定电压或对电压进行扫描时，测定在工作电极中流过的氧化还原电流，由此进行过氧化氢的定量。
活体内的过氧化脂质作为氧化应激标记物，有望用于临床(参照非专利文献1、2)。因此，需要过氧化脂质的定量方式。作为现有的过氧化脂质的测定方法，已知的有化学发光-HPLC法。但是，化学发光-HPLC法需要大规模的装置。此外，作为其他过氧化脂质的测定方法，还知道硫代巴比土酸法。但是，硫代巴比土酸法是主要用于测定过氧化脂质以外的醛类的非特异性方法。此外，硫代巴比土酸法需要烦杂的操作和分光学测定装置。
最近，提出了称作CNT传感器的电化学检查设备。CNT传感器实现了更高的高灵敏度化和设备的小型化。虽然提出了各种方式的CNT传感器，但是作为一般的方式之一，有一种CNT传感器具有如下的工作电极，该工作电极具有以接触金属电极的方式重叠了各种形态的碳纳米管(CNT)或石墨的结构(参照专利文献1～3)。
在先技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2006/103872号小册子
专利文献2：国际公开第2007/114140号小册子
专利文献3：特開2008-258594号公报
非专利文献
非专利文献1：Hui SP，Murai T，Yoshimura T，Chiba H，Nagasaka H andKurosawa T，″Improved HPLC Assay for Lipid Peroxides in Human PlasmaUsing the Internal Standard of Hydroperoxide″，Lipids，Vol.40，No.5，pp.515-522.
非专利文献2：Hui SP，Chiba H，Sakurai T，Asakawa C，Nagasaka H，Murai T，Ide H and Kurosawa T，″An improved HPLC assay forphosphatidylcholinehydroperoxides(PCOOH)in human plasma with syntheticPCOOH as internal standard″，Journal of Chromatography B，Vol.857，pp.158-163.
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于，提供能够简便地测定过氧化物浓度的方法及传感器。并且，本发明的目的还在于，将该方法和传感器应用于临床检查。
第一，本发明代替以往的过氧化氢的测定方法、即利用过氧化物酶类的分光学测定方法，而提供一种利用了以电信号形式检测过氧化物浓度的CNT传感器的电化学测定方法。以往的分光学测定方法需要光源或检测器。另一方面，利用CNT传感器的电化学测定方法实现了测定装置的简单化及小型化，对POCT等临床检查做很大贡献。
第二，本发明提供一种测定在过氧化物中尤其是脂质过氧化物的方法。以往，通过需要较大规模的装置的化学发光-HPLC法测定脂质过氧化物，所以很难成为POCT的检查对象。根据本发明，能够测定很多种类的脂质过氧化物的浓度。因此，本发明对临床检查做出了很大贡献。
解决技术问题的方案
本发明的第一方式涉及对以下所示的过氧化物进行测定的方法。
[1]一种对试样中的过氧化物进行测定的方法，包括：准备CNT传感器的步骤，该CNT传感器具备工作电极、单层碳纳米管、对电极以及参比电极，该工作电极配置在绝缘基板上，该单层碳纳米管接触上述工作电极，并且，在该单层碳纳米管的表面具有羟基或羧基；以与上述单层碳纳米管接触的方式，将含有过氧化物的溶液的试样提供到上述CNT传感器的步骤；以及在上述工作电极和上述对电极之间形成电位差的步骤。
[2]根据[1]所述的方法，上述单层碳纳米管是在含有酸及过氧化氢的溶液中被分散而处理过的碳纳米管。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，上述过氧化物是通过使用对活体成分具有特异性的酶使上述活体成分进行反应而生成的过氧化氢。
[4]根据[3]所述的方法，上述活体成分选自：葡萄糖、总胆固醇、游离胆固醇、甘油三酸酯、磷脂、LDL胆固醇、HDL胆固醇、游离脂肪酸、尿酸、肌酸、胆红素、乳酸、丙酮酸、肌酸酐、胆碱、酶。
[5]根据[1]或[2]所述的方法，上述过氧化物是过氧化脂质。
[6]根据[5]所述的方法，上述过氧化脂质是胆固醇酯过氧化物、胆固醇过氧化物、磷脂过氧化物、甘油三酸酯过氧化物、糖脂质过氧化物。
本发明的第二方式涉及以下所示的传感器。
[7]一种过氧化物测定用的传感器，具备：工作电极，配置在绝缘基板；单层碳纳米管，接触上述工作电极，在其表面具有羟基或羧基；对电极；以及参比电极。以接触上述单层碳纳米管的方式提供用于测定过氧化物的试样溶液。
[8]根据[7]所述的过氧化物测定用的传感器，上述单层碳纳米管是在含有酸及过氧化氢的溶液中被分散而处理过的碳纳米管。
发明效果
根据本发明，能够高灵敏度且迅速地测定过氧化物。例如，根据本发明，能够高灵敏度且迅速地测定各种浓度的过氧化物。因此，能够通过本发明的方法，对以往通过利用了过氧化物酶类反应的分光学方法测定的临床检查对象物进行测定。
并且，根据本发明，能够测定活体中的过氧化物(例如蛋白质，核酸，脂质等的过氧化物，尤其是过氧化脂质)。已知过氧化脂质成为生活习惯病的指标。因此，过氧化脂质的测定方法对生活习惯病的诊断和生活习惯病的治疗方法的开发做贡献。
附图说明
图1A是示出用于本发明的测定方法的CNT传感器的例子的俯视图。
图1B是示出用于本发明测定方法的CNT传感器的例子的截面图。
图2是示出在实施例中使用的CNT传感器的结构的立体图。
图3是示出基于使用了CNT传感器的电化学测定的过氧化氢的测定结果(黑色方形，实线)和基于分光学测定的过氧化氢的测定结果(空心圈，虚线)的图表。
图4是示出抗坏血酸的存在对过氧化氢的电化学测定的影响的图表。
图5是示出胆红素的存在对过氧化氢的电化学测定的影响的图表。
图6是示出尿酸的存在对过氧化氢的电化学测定的影响的图表。
图7是示出人血清白蛋白的存在对过氧化氢的电化学测定的影响的图表。
图8是示出进行了过滤的血清(黑色方形，实线)或未进行过滤的血清(空心圈，虚线)的存在对过氧化氢的电化学测定的影响的图表。
图9是示出乳酸的电化学测定的测定结果的图表。
图10是示出基于胆固醇酯及胆固醇酯的过氧化物的电化学测定的测定结果的图表。
图11是示出利用共轭二烯法(实心黑圆)、TBARS法(黑三角)及本发明的方法(黑色方形)测定了氧化LDL的结果的图表。
图12是示出利用本发明的方法测定了氧化LDL(实线)及未氧化LDL(虚线)的结果的图表。
具体实施方式
1.CNT传感器
本发明的CNT传感器具备：绝缘性基板、配置在上述绝缘基板上的工作电极、接触上述工作电极的碳纳米管、对电极以及参比电极。在图1A及图1B上示出了CNT传感器的例子。如图1A所示，在绝缘性基板110上固定有工作电极120和接触工作电极120的碳纳米管130。在固定于绝缘性基板110上的碳纳米管130上，提供作为试料的试样溶液140。此外，对电极150及参比电极160配置成接触试样溶液140(参照图1B)。对电极150及参比电极160无需固定在绝缘性基板110上，优选配置成能够从绝缘性基板110拆下。
优选对电极配置成不接触碳纳米管。若对电极接触碳纳米管，则工作电极和对电极之间的电流变大，因而有时不能够确定过氧化物的取决于用量的氧化还原电流之差。若调整所固定的碳纳米管的量，则还能够把对电极配置成接触碳纳米管，但是，通常把对电极配置成不接触碳纳米管。
绝缘性基板的材料可以是无机物，也可以是有机物。例如，绝缘性基板是玻璃基板。工作电极及对电极的材料通常是金属，优选为金、铂、钛等。工作电极最好成膜并固定在绝缘性基板上。在绝缘性基板上成膜的电极也可以是二层电极。例如，可以把贴近性高的铬作为衬底层，层叠导电性高的金或铂。对电极例如是针状的金属。参比电极不特别限定，但是，例如是Ag/AgCl电极。
固定在绝缘性基板上的碳纳米管优选为单层碳纳米管。此外，优选碳纳米管在含酸及过氧化氢的溶液中被分散处理。发明人认为经过该处理的碳纳米管的表面上，被导入了羟基及/或羧基。因此，该处理对于碳纳米管在绝缘性基板上的固定也有效果。
一般来说，为了得到碳纳米管的分散液，需要界面活性剂的共存。但是，为了抑制对传感器的性能的影响，优选不用界面活性剂。
[CNT传感器的制作例]
首先，在玻璃基板上形成工作电极。例如，对形成电极的区域以外的玻璃基板的表面，覆上抗蚀剂膜。之后，在用于形成电极的区域，通过蒸镀法，对金、铂、铬等的金属、ITO等导电性氧化物、或光透射性半导体进行成膜。如上所述，电极也可以是二层电极。
接着，以接触工作电极的方式，将碳纳米管固定在玻璃基板上。对玻璃基板的固定有碳纳米管的区域优选实施亲水性处理。例如，可使玻璃基板的固定碳纳米管的区域接触碱水溶液。通过亲水性处理，碳纳米管容易固定到玻璃基板上。
在固定碳纳米管的区域，通过滴下碳纳米管的水分散液来固定碳纳米管。在碳纳米管的水分散液中，优选均匀分散碳纳米管。能够通过向含有酸及过氧化氢的水溶液添加碳纳米管，得到碳纳米管的水分散液。酸优选是硫酸和硝酸的混合酸。不特别限定硫酸和硝酸的比率，但是只要按体积比为硫酸∶硝酸＝3∶1左右就可以。不特别限定酸及过氧化氢的量，但是相对于0.5mg CNT，含有4mL酸、500μL过氧化氢水溶液(浓度约30％)左右就可以。
在将碳纳米管添加到含酸及过氧化氢的水溶液中后，优选进行超声波处理。超声波处理的时间可以是1～2小时左右。在进行了过长时间的超声波处理时，碳纳米管有可能断片化。在超声波处理后，用水稀释含有碳纳米管的水溶液，通过渗析进行中性化，由此得到碳纳米管水分散液。
通过将所得到的碳纳米管水分散液少量地分批提供到玻璃基板的规定区域，能够将碳纳米管固定到玻璃基板上。
如上所述，参比电极及对电极也可以不固定在绝缘性基板上，优选配置成能够从绝缘性基板拆下。
2.过氧化物的测定
利用本发明的CNT传感器，能够测定过氧化物(特别是，溶液中的过氧化物)。所谓过氧化物的测定，表示过氧化物的定量及定性中某一个。为了测定过氧化物，首先，将含有过氧化物的溶液提供到固定于绝缘性基板上的碳纳米管上。使被提供的溶液和对电极及参比电极接触。
利用参比电极，设定工作电极。接着，在工作电极和对电极之间形成电位差。然后，测定在工作电极和对电极之间流过的电流值Id。通常，含在试样中的过氧化物的浓度越高，电流值Id就越高。
若预先求出表示过氧化物的浓度和电流值Id之间的关系的校准曲线，则能够迅速求出试样中的过氧化物浓度。
本发明的测定方法能够测定各种过氧化物，例如，能够测定蛋白质、核酸、脂质等活体中的过氧化物。如上所述，作为现有的活体成分的测定手法，广泛知道的有利用过氧化物酶类反应的分光学方法。在现有的分光学方法中，通过测定由酶反应生成的过氧化氢，间接地测定了活体成分。相对于此，本发明的测定方法即使没有像现有测定方法那样产生过氧化氢，也能够直接测定溶液试样中的有机化合物的过氧化物(例如，过氧化脂质等)。
过氧化脂质有望作为临床检查中的氧化生物标记物。例如，过氧化脂质可以成为生活习惯病等的各种疾患(例如，动脉硬化症或糖尿病、老年痴呆症、血液透析合并症、老化等)的指标。过氧化脂质大体分为游离脂肪酸过氧化物(FA-OOH)、甘油三酸酯过氧化物(TG-OOH)、亚油酸胆固醇酯氢过氧化物(cholesteryl linoleate hydroperoxide)等的胆固醇酯过氧化物(CE-OOH)，甘油磷脂和神经鞘脂质的氢过氧化物等的磷脂过氧化物(PL-OOH)、胆固醇过氧化物、糖脂质过氧化物等，本发明的测定方法能够直接测定任何一种过氧化脂质。
过氧化脂质的一部分已经进行了化学合成。本发明者也报告了胆固醇酯过氧化物，作为磷脂的一种的磷脂酰胆碱过氧化物，甘油三酸酯过氧化物等的化学合成(Hui SP，et al.，Analytical Sciences，Vol.16，No.10，pp.1023-1028.；Hui SP，et al.，Journal of Chromatography B，Vol.857，pp.158-163.；Hui SP，et al.，Lipids，Vol.38，No.12，pp.1287-1292.)。若预先利用这些化学合成的过氧化物，以校准曲线的形式取得过氧化物的浓度和CNT传感器的电流值Id之间的关系，则能够根据试样测定中的电流值Id，求出过氧化物浓度。
如上所述，过氧化脂质的测定对生活习惯病等的各种疾患的诊断、治疗和治疗药物的开发等做贡献。
当然，本发明的测定方法还能够测定溶液试样中的过氧化氢的浓度。如上所述，作为现有的活体成分的测定手法，广泛知道的有利用了过氧化物酶类反应的分光学方法。在该方法中，利用对活体成分具有特异性的酶使活体成分产生反应而产生过氧化氢，在以过氧化物酶作为催化剂的基于过氧化氢的氧化反应中使色素显色，通过分光学方法测定基于该色素的吸收。作为代表性的例子，有以下的胆固醇酯的测定。
[化学式1]
胆固醇酯酶
第1段 酯化胆固醇→游离型胆固醇+脂肪酸
胆固醇氧化酶
第2段 游离型胆固醇+O2+H2O→胆甾烯酮+H2O2
过氧化物酶
第3段 H2O2+氨基安替比林(色原体)+苯酚→苯醌色素+H2O
第4段 使用分光光度计进行苯醌色素的吸光度测定
若使用本发明的测定方法，则能够测定在第2段产生的过氧化氢(通过活体成分的特异性酶反应产生的过氧化氢)。本发明的测定方法对于低浓度的过氧化氢，也能够以高灵敏度进行测定，并且，即使在溶液试样中混合存在各种活体成分，也能够实现适当的测定。例如，如后述的实施例所示，即使抗坏血酸或胆红素，尿酸，人血清白蛋白等混合存在，也基本不会对过氧化氢的测定造成影响。此外，若是进行过滤处理的血清，则充分降低对过氧化氢测定的影响。如上所述，通过本发明的测定方法，能够提供一种代替利用了上述的过氧化物酶类反应的分光学方法的、新的活体成分的测定手法。
根据本发明的测定方法，通过测定过氧化氢，能够测定各种活体成分。活体成分的例子中包含：葡萄糖，总胆固醇，游离胆固醇，甘油三酸酯，磷脂，LDL胆固醇，HDL胆固醇，游离脂肪酸，尿酸，肌酸酐，胆红素，乳酸，丙酮酸，胆碱。此外，活体成分也可以是酶。酶的例子中包含：胆碱酯酶，淀粉酶，脂肪酶等，在酶活性测定系统中包含含有过氧化氢生成反应的酶。
根据本发明的测定方法，除了活体成分以外，还能够测定通过包含过氧化氢生成反应的免疫学测定系统来测定的微量成分。在这种微量成分的例子中，除了包含激素、肿瘤标记物、细胞因子之外，包括药物等的外因性物质等。
实施例
1.CNT传感器的制作
(1)基板的准备
利用光刻法，用抗蚀剂膜覆盖玻璃基板(20mm×20mm)的电极形成预定部位以外的区域。在电极形成预定部位，通过蒸镀法形成钛和金膜，形成二层结构的电极。之后，除去抗蚀剂膜。
另一方面，向3mL硫酸少量分别分批添加1mL的30％过氧化氢水溶液来调制硫酸/过氧化氢混合液。将形成了电极的玻璃基板放入20mL的烧杯中，对整个烧杯进行冷却的同时滴下硫酸/过氧化氢混合液。轻轻搅拌的同时，在室温下培养10分钟。10分钟后，用去离子水清洗玻璃基板，接着，用纯乙醇进行清洗。
将清洗后的玻璃基板正面(电极形成面)朝上放入50mL锥形离心管(Falcon tube)中。将该锥形离心管置于加热到80℃的加热器之上。此时，用铝箔使锥形离心管倾斜。用剪刀剪切1.5mL微管的盖子，向盖子的凹部注入二氯硅烷。将保持二氯硅烷的盖子移到50mL锥形离心管内，轻轻闭合锥形离心管的盖，静置1分钟。从50mL锥形离心管取出玻璃基板，把玻璃基板直接置于加热器上，在80℃下静置30分钟。之后，用去离子水清洗玻璃基板。
向玻璃基板正面的用于载置碳纳米管的部分，供给4μL的2N氢氧化钠，使其反应10分钟并进行亲水性处理。之后，用去离子水清洗玻璃基板。
(2)单层碳纳米管的酸处理
用硫酸及硝酸(均为关东化学产品)的混合酸清洗0.5mg的单层碳纳米管(SWCNT；Carbon Nanotechnologies Inc.)。使清洗后的SWCNT悬浮在1.8mL硫酸、0.6mL硝酸及0.2mL过氧化氢水(关东化学)的混合液中，进行1个小时的超声波处理。用水稀释所得到的黑色SWCNT分散液，进行渗析直到pH成为中性，得到1mg/mL的SWCNT水分散液。
(3)单层碳纳米管的载置
用浴槽型超声波器进行10分钟超声波处理，使SWCNT水分散液中的SWCNT分散。在预先加温到80℃的加热器上放置玻璃基板，向电极间隙部每次4μL地分5次共重叠20μL的SWCNT分散液(1mg/mL)。之后，为了稳定化，在150℃下静置2个小时。
2.过氧化氢的测定
(1)电化学测定
用1×PBS(pH7.4)稀释30％过氧化氢水溶液，调制3μM、30μM、300μM、3mM、30mM的过氧化氢水溶液(试样)。将CNT传感器设置于多探针检验台(prober)上，用真空泵固定玻璃基板。在工作电极及对电极上分别连接电极探头。并且，以与玻璃基板之间的间隙大致为2mm的方式，设置对电极及参比电极(参照图2)。
向玻璃基板的SWCNT载置部和参比电极之间提供20μL的1×PBS(参照图2)。向工作电极和对电极之间施加-50mV的电压，连续2分钟测定电流值Id。取20～30秒钟的测定电流值平均作为1×PBS的测定电流值(基准值)。
在回收1×PBS之后，将试样(各浓度的过氧化氢水溶液)提供到SWCNT载置部和参比电极之间，连续2分钟测定电流值Id。按照浓度由低到高的顺序提供试样。取20～30秒钟的测定电流值平均，作为各浓度的过氧化氢水溶液的测定电流值。
设横轴为过氧化氢浓度(对数刻度)，纵轴为各浓度的过氧化氢水溶液的测定电流值和1×PBS的测定电流值(基准值)之间的差(对数刻度)，制作校准曲线(参照图3；黑色方形，实线)。
(2)分光学测定(对照实验)
如下进行试样的调制。混合了20μL的最终浓度的10倍浓度的过氧化氢水溶液、20μL 10×PBS(pH7.4)、20μL 15mM的4-氨基安替比林、20μL的0.4％二甲基苯胺、20μL的400mM戊二酸二甲酯、99μL去离子水。过氧化氢的浓度设为3μM、30μM、300μM、3mM、30mM。向上述混合液添加1μL的5U/μL过氧化物酶(POD)，在水浴器中，在37℃下培养10分钟。10分钟后，测定了反应液的吸光度(565nm)。
设横轴为过氧化氢浓度(对数刻度)，纵轴为反应液的吸光度(对数刻度)，制作了校准曲线(参照图3；空心圈，虚线)。
(3)测定结果
如图3所示，在电化学测定(黑色方形，实线)中，在3μM～30mM的浓度范围内得到了直线校准曲线，但是在分光学测定(空心圈，虚线)中，在3μM～3mM的浓度范围内得到了直线的校准曲线。电化学测定的可测定浓度区域与分光学测定相比，在高浓度侧扩展1个数量级。此外，在电化学测定中，对每一试样的测定需要30秒钟，很短。另一方面，在分光学测定中，需要进行10分钟的培养。可知从缩短测定时间的观点来看，电化学测定的实用性比分光学测定高。
3.阻碍物质对过氧化氢的测定的影响的研究
(1)抗坏血酸、胆红素、尿酸及人血清白蛋白的影响的研究
作为试样，调制了3mM过氧化氢水溶液以及向3mM的过氧化氢水溶液添加了测定阻碍物质(抗坏血酸，胆红素，尿酸或人血清白蛋白)的水溶液。设抗坏血酸及胆红素的浓度为0.5μM、5μM、50μM、500μM。设尿酸的浓度为30μM、300μM、3mM。设人血清白蛋白浓度为0.05mM、0.5mM、2mM、5mM。各试样的溶媒为1×PBS。
以与上述的使用了CNT传感器的电化学测定同样的步骤，测定了各试样的过氧化氢。设3mM过氧化氢水溶液(无测定阻碍物质)的测定电流值为100％，在纵轴上绘制了各试样的测定电流值的相对值(参照图4～图7)。
(2)人血清的影响的研究
关于人血清，将空腹状态的健康人(24岁，男性)的血液采集到10mL平口采血管中，在室温下静置1个小时之后，以3500rpm进行10分钟的离心操作来分离血清。将500μL血清以10万分子量截留过滤器(amicon)进行过滤处理，得到通过了过滤器的液体。在8000rpm下进行10分钟的离心操作。
作为试样，准备了3mM过氧化氢水溶液和向3mM的过氧化氢水溶液添加了人血清(未经过过滤处理的或经过过滤处理的)的水溶液。设人血清的最终浓度为1000倍稀释、100倍稀释、10倍稀释。各试样的溶媒为1×PBS。
按照与使用了上述的CNT传感器的电化学测定同样的步骤，测定了各试样的过氧化氢。设3mM过氧化氢水溶液(无血清)的测定电流值为100％，在纵轴上绘制了各试样的测定电流值的相对值(参照图8)。
(3)测定结果
图4是示出抗坏血酸存在下的过氧化氢的测定结果的图表。抗坏血酸的活体内的基准范围为3～10μM。根据该结果，可知健康人血清中的抗坏血酸对测定造成的影响大约小于10％。
图5是表示胆红素存在下的过氧化氢的测定结果的图表。胆红素的活体内的基准范围为4～24μM。根据该结果，可知健康人血清中的胆红素对测定造成的影响大约小于5％。
图6是示出尿酸存在下的过氧化氢的测定结果的图表。尿酸的活体内的基准范围为150μM～420μM。根据该结果，可知健康人血清中的尿酸对测定造成的影响大约小于5％。
图7是示出人血清白蛋白存在下的过氧化氢的测定结果的图表。人血清白蛋白的活体内的基准范围为0.59～0.74μM。根据该结果，可知健康人血清中的人血清白蛋白对测定造成的影响大约小于10％。
图8是示出人血清存在下的过氧化氢的测定结果的图表。未经过滤处理的血清的存在引起较大的测定障碍(空心圈，虚线)。另一方面，通过对血清进行过滤处理，能够减轻测定障碍(黑色方形，实线)。因使用10万分子量截留过滤器进行了过滤处理，认为分子量大于10万的高分子(例如，脂蛋白，球蛋白，部分未被除去的白蛋白)阻碍了测定。
4.乳酸的测定
用1×PBS(pH7.4)稀释乳酸水溶液，调制了1μM、10μM、100μM、1mM、10mM的乳酸水溶液(试样)。按照与上述的使用了CNT传感器的电化学测定同样的步骤，测定各试样的乳酸。
具体来说，向玻璃基板的SWCNT载置部和参比电极之间，提供20μL的预先在水浴器中以37℃培养了2分钟的空白试样(19μL 1×PBS，1μL乳酸氧化酶(LOD，5mU/μL))。向工作电极和对电极之间施加电压，并连续2分钟测定电流值Id。取20～30秒钟的测定电流值平均，作为空白试样的测定电流值(基准值)。
在回收空白试样之后，将20μL的预先在水浴器中以37℃培养了2分钟的试样(各浓度的乳酸水溶液19μL，1μL的LOD(5mU/μL))提供到SWCNT载置部和参比电极之间，连续2分钟测定电流值Id。按浓度从低到高的顺序提供试样。取20～30秒钟的测定电流值平均，作为各浓度的乳酸水溶液的测定电流值。
设横轴为乳酸浓度(对数刻度)，纵轴为各浓度的乳酸水溶液(含LOD)的测定电流值和1×PBS(含LOD)的测定电流值(基准值)之差(对数刻度)，制作了校准曲线(参照图9)。
如图9所示，在0.001mM～1.0mM的范围内得到良好的校准曲线。人血清中的乳酸的浓度为数mM。因此，若考虑将血清试样稀释10倍或100倍来进行测定，则可以说使用了CNT传感器的电化学测定的测定范围良好。
5.胆固醇酯(亚油酸胆固醇酯(cholesteryl linoleate))的过氧化物的测定
将3.2mg亚油酸胆固醇酯溶解到10mL 100％甲醇中，调制50μM亚油酸胆固醇酯溶液。用100％甲醇稀释亚油酸胆固醇酯溶液，各调制200μL的50nm、500nm、5μM的亚油酸胆固醇酯溶液。向各亚油酸胆固醇酯溶液20μL添加180μL的1×PBS进行10倍稀释，并调制成甲醇的最终浓度成为10％(胆固醇酯的最终浓度成为5nM～5μM)。同时，调制向180μL的1×PBS添加了20μL的100％甲醇的溶液，用于阴性对照。
接着，调制亚油酸胆固醇酯的过氧化物。首先，用胆固醇和亚麻酸调制出胆固醇酯。接着，以血卟啉作为光敏剂，在光照射下，流入氧气来进行基于单态氧的过氧化反应。利用NMR法、HPLC法、质量分析法等各种分析方法，确定了所生成的过氧化物的构造。关于过氧化物的调制顺序的详细内容，记载在在先技术文献(Hui SP，et al.，Analytical Sciences，Vol.16，No.10，pp.1023-1028.)中。
用100％甲醇稀释亚油酸胆固醇酯过氧化物的溶液，调制了50nm、500nm、5μM、50μM的亚油酸胆固醇酯过氧化物溶液。向各亚油酸胆固醇酯过氧化物溶液20μL添加180μL的1×PBS来稀释10倍，调制成甲醇的最终浓度成为10％(胆固醇酯过氧化物的最终浓度成为5nm～5μM)。同时，调制向1×PBS 180μL添加了20μL 100％甲醇的溶液，用于阴性对照。
按照与上述的使用了CNT传感器的电化学测定同样的步骤，测定各试样的亚油酸胆固醇酯或亚油酸胆固醇酯过氧化物。
具体来说，向玻璃基板的SWCNT载置部和参比电极之间，提供20μL的阴性对照试样。工作电极和对电极之间施加-300mV的电压，连续2分钟测定电流值Id。取60～120秒钟的测定电流值平均，作为阴性对照试样的测定电流值(基准值)。
在回收了阴性对照试样之后，将20μL试样(亚油酸胆固醇酯溶液或亚油酸胆固醇酯过氧化物溶液)提供到SWCNT载置部和参比电极之间，连续2分钟测定电流值Id。按浓度从低到高的顺序提供试样。取60～120秒钟的测定电流值平均，作为各浓度的亚油酸胆固醇酯溶液或亚油酸胆固醇酯过氧化物溶液的测定电流值。
设横轴为胆固醇酯或胆固醇酯过氧化物的浓度(对数刻度)，纵轴为各浓度的试样的测定电流值和阴性对照试样的测定电流值(基准值)之差(对数刻度)，制作了图表(参照图10)。
如图10所示，在含有亚油酸胆固醇酯过氧化物的溶液试样中，观察到依赖浓度的信号的增大(黑色方形，实线)。另一方面，在含有(非过氧化)亚油酸胆固醇酯的溶液试样中，没有显现依赖于浓度的信号的变化(空心圈，虚线)。由此，给出了将过氧化物的结构「-OOH」、即氢过氧化物作为信号的启示。
根据以上结果，认为不限于胆固醇酯过氧化物，同样能够测定各种过氧化脂质。
6.氧化LDL的测定(电流响应)
通过通常的方法(超离心法)，从由健康人采集的血清分离了低密度脂蛋白(LDL)。将所得到的LDL和硫酸铜稀释混合到1×PBS 2mL中，以使其最终浓度分别成为83μg/mL、0.553μM，在室温培养而对LDL进行氧化。设混合了LDL和硫酸铜的时间点为0分钟，按以下的三种方法测定了随着时间经过生成的氧化LDL(共轭二烯体)。
1)共轭二烯法
在从混合之后经过了1分钟后，3分钟后及5～180分(5分钟间隔)后，测定了混合液的吸光度(234nm)。
2)TBARS法
在混合之后经过了10分钟后，30分钟后，60分钟后，120分钟后及180分钟后，各采集25μL的混合液。向各混合液(25μL)添加1mL的5.3mg/mL硫代巴比土酸(TBA)醋酸钠溶液，在100℃下反应1个小时。反应后，测定了反应液的吸光度(535nm)。
3)本发明的方法
在混合之后经过了1分钟后，3分钟后及5～180分(5分钟间隔)后，各采集20μL混合液。将各混合液(25μL)提供到上述的CNT传感器的SWCNT载置部和参比电极之间。施加电压使工作电极相对于参比电极的电位成为-300mV，连续2分钟测定电流值Id。
将共轭二烯法(实心黑圆)、TBARS法(黑三角)及本发明的方法(黑色方形)的测定结果示于图11。图11的横轴表示混合之后的经过时间，纵轴从右起表示按共轭二烯法测定的吸光度(234nm)、按本发明的方法测定的电流变化量及按TBARS法测定的硫代巴比土酸反应性物質(TBARS)的丙二酰二醛(MDA)换算量。
如图11所示，观察到共轭二烯法、TBARS法及本发明的方法均随着时间经过而信号增大。特别是，在使用了CNT传感器的本发明的方法中，从反应初期开始就明确出现信号的变化，在初始阶段就能够检测到脂质的过氧化。作为对照实验，分别以没有添加硫酸铜而用1×PBS稀释的LDL溶液，以及只含硫酸铜的1×PBS作为测定对象的情况下，没有观察到电流值的增加。
根据以上结果，本发明的方法与共轭二烯法及TBARS法相比，能够高灵敏度地且在短时间内检测到脂质的氧化状态。
7.氧化LDL的测定(电位变化响应)
通过通常的方法(超离心法)，从由健康人采集的血清中分离出LDL。将所得到的LDL和硫酸铜稀释混合到0.2mL 1×PBS中，以使其最终浓度分别成为83μg/mL、0.553μM，在37℃下培养而对LDL进行氧化。设混合了LDL和硫酸铜的时间点为0分钟，按上述的共轭二烯法测定随着时间的经过生成的氧化LDL(共轭二烯体)，在混合之后经过3个小时后，几乎观察不到吸光度的增加。将该混合之后经过了3个小时后的试样设为氧化LDL溶液。此外，将代替硫酸铜而添加1×PBS来调制的试样设为未氧化LDL溶液。
在向上述的CNT传感器的SWCNT载置部和参比电极之间提供20μL缓冲溶液之后，随着时间经过测定对参比电极的工作电极的电位。在信号大体稳定之后，吸取缓冲溶液的一部分(10μL)。接着，向SWCNT载置部和参比电极之间的间隙提供了10μL的氧化LDL溶液或未氧化LDL溶液之后，随着时间的经过测定对参比电极的工作电极的电位。
将提供了氧化LDL溶液(实线)或未氧化LDL溶液(虚线)之后的对参比电极的工作电极的电位变化的测定结果示于图12。图12的横轴表示经过时间，纵轴表示对参比电极的工作电极的电位的变化。此外，图表中央的箭头表示提供氧化LDL溶液或未氧化LDL溶液的时间。
如图12所示，在提供氧化LDL溶液或未氧化LDL溶液之前的0～1000秒之间，观察到基线的趋势(向右上升)。在提供了氧化LDL溶液的情况下，观察到大约30mV的电位变化。另一方面，在提供了未氧化LDL溶液的情况下，只观察到5mV以下的电位变化，很难与连续变化进行区别。此外，在提供了含有未氧化的HDL的溶液的情况下，以及提供了只含有硫酸铜的溶液的情况下，均没有观察到电位变化。
根据以上结果，可知CNT传感器对氧化LDL做出响应。
本申请主张于2009年7月17日申请的日本专利申请2009-169126的优先权。该在先申请的说明书及附图中所记载的所有内容均援用到本申请说明书中。
工业实用性
CNT传感器在下述方面较有利，即，不使用光源或检测器，通过电信号体现反应，以及能够大量生产。因此，即使说使用CNT传感器的本发明的测定方法能够掀起临床检查的革命也不为过。
首先，CNT传感器能够用作检查室外的检查(POCT，SMBG，OTC)平台。本发明的测定方法与以往在实验室中用于脂质过氧化物的测定的化学发光-HPLC法相比，操作显著简化，测定时间也较短，所以还能够进行以往很难成为POCT对象的脂质过氧化物的POCT。
此外，只要将持续采集血液的装置连接到CNT传感器，或将针刺到组织的间质液中并连接到CNT传感器，就能够实时地监视运动选手的训练效果，能够从戴在手腕或腰上的小型发送装置向PC发送数据。这种装置还能够应用于家庭医疗或老人保健设施中患者的监视中。
并且，CNT传感器还能够对医院的临床检查室带来戏剧性的变化。目前在医院检查室中使用的生化学分析装置为大型且昂贵，需要对试管及导管进行清洗等的维护。对于生化学分析装置也严格要求节约成本和空间，因此试药使用量较少的小型装置受到欢迎。但是，目前的分光学分析装置的缩小已到了极限。
通过利用小型且低价能够用后扔掉的CNT传感器片，能够使分析装置小型化到目前不可能实现的水平。此外，试药使用量也能够达到目前的10分之1以下，能够开发不需要维护作业的装置。这种装置能够在诊所、手术室、急救室、急救车、医疗车、老人保健设施、甚至是街头的廉价体检等各种场合进行各种项目的实时检查。
此外，还能够在抗氧化食品或抗氧化药物等的筛选中，利用CNT传感器。例如，只要制作用CNT传感器进行一定的氧化反应的系统，就能够将植物提取物或药物添加到其中，从而容易检测抗氧化活性。如利用CNT传感器的便携性优点，在世界的任何环境(例如，丛林或山中等)下都能够筛选天然的抗氧化物，对食品产业界以及医药产业都做出大贡献。
附图标记说明
110 绝缘性基板
112 玻璃基板
120 工作电极
130 碳纳米管
140 试样溶液
150 对电极
160 参比电极

Claims (8)

1.一种对试样中的过氧化物进行测定的方法，其特征在于，包括：
准备CNT传感器的步骤，该CNT传感器具备工作电极、单层碳纳米管、对电极、参比电极，该工作电极配置在绝缘基板上，该单层碳纳米管接触上述工作电极并且在该单层碳纳米管的表面具有羟基或羧基；
以与上述单层碳纳米管接触的方式，将含有过氧化物的溶液的上述试样提供到上述CNT传感器的步骤；以及
在上述工作电极和上述对电极之间形成电位差的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，
上述单层碳纳米管是在含有酸及过氧化氢的溶液中被分散而处理过的碳纳米管。
3.根据权利要求1所述的方法，
上述过氧化物是通过使用对活体成分具有特异性的酶使上述活体成分进行反应而生成的过氧化氢。
4.根据权利要求3所述的方法，
上述活体成分选自：葡萄糖、总胆固醇、游离胆固醇、甘油三酸酯、磷脂、LDL胆固醇、HDL胆固醇、游离脂肪酸、尿酸、胆红素、乳酸、丙酮酸、肌酸酐、胆碱、酶。
5.根据权利要求1所述的方法，
上述过氧化物是过氧化脂质。
6.根据权利要求5所述的方法，
上述过氧化脂质是酯化胆固醇过氧化物、胆固醇过氧化物、磷脂过氧化物、甘油三酸酯过氧化物、糖脂质过氧化物。
7.一种过氧化物测定用的传感器，具备：
工作电极，配置在绝缘基板；
单层碳纳米管，接触上述工作电极，在该单层碳纳米管表面具有羟基或羧基；
对电极；以及
参比电极，
以与上述单层碳纳米管接触的方式提供用于测定过氧化物的试样溶液。
8.根据权利要求7所述的过氧化物测定用的传感器，
上述单层碳纳米管是在含有酸及过氧化氢的溶液被分散而处理过的碳纳米管。
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