用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法
技术领域
本发明涉及用于溶解不溶蛋白质和/或肽的方法。本发明也涉及将不溶性蛋白质和/或肽导入细胞中的方法。本发明进一步涉及呈递不溶性抗原的抗原呈递细胞的产生方法、由该产生方法产生的抗原呈递细胞、使用抗原呈递细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法和诱导细胞毒性T淋巴细胞的试剂,以及使用该抗原呈递细胞预防或治疗癌症和/或传染病的方法和试剂。
技术背景
近年,作为用于难治疗性疾病包括癌症的新治疗方法,免疫细胞疗法备受关注。免疫细胞疗法是通过离体(exvivo)培养患者的免疫细胞,特别是白细胞,活化细胞,并然后将活化的细胞再返回患者他本人/她本人,来人工活化免疫力的治疗方法。由于免疫细胞疗法使用患者他本人/她本人的细胞,因此相对于使用抗癌症药物的常规治疗,其特别的优势在于尤其降低了副作用。
作为免疫细胞疗法,目前流行的是活化的自身淋巴细胞疗法,其中通过淋巴因子以抗原非特异性方式离体(exvivo)活化淋巴细胞,并将活化的淋巴细胞返回身体。此外,期望普及是使用具有强细胞毒活性并特异识别和损伤病变的细胞毒性T淋巴细胞(在下文中,也称为“CTL”)的治疗方法。
对于目前尝试的用于诱导CTL的治疗方法,已经应用将癌症抗原肽等直接施用给患者的方法。该方法的问题是,肽被组织中的肽酶降解、患者的免疫应答的抑制等,并因此,CTL诱导的能力没有期望的那么多。另一方法是树突状细胞疫苗疗法等(例如,非专利文献1),其中抗原呈递细胞例如树突状细胞(在下文中,也称为“DC”)自来源于患者的细胞离体诱导,并用抗原脉冲,以强烈地呈递抗原,然后将DC返回患者体内。
具体地,树突状细胞疫苗疗法是这样的疗法,其中将DC摄入疾病抗原蛋白质等(例如,癌症抗原蛋白质或者与传染病有关的抗原蛋白质)到细胞中,在细胞中加工,并然后将其一部分呈递给主要组织相容性复合物抗原(MHC抗原,主要组织相容性抗原、组织相容性抗原,在人类的情况下,称为人白细胞抗原:HLA),将DC作为疫苗施用以诱导在体内选择性攻击表达疾病抗原的异常细胞的疾病抗原特异性CTL(见例如非专利文献1)。以该方式,由于DC疫苗可以诱导疾病特异性CTL,在免疫细胞疗法中,其是治疗效果最好的疗法之一。
MHC抗原分类为MHCI类和II类,I类诱导抗原特异性CTL,和II类诱导辅助性T(Th)细胞。此外,在人类的情况下,将I类进一步分类成亚型例如HLA-A02和HLA-A24,并且甚至当抗原蛋白质是相同的时候,它们也呈递不同的肽。
在DC疫苗疗法中,重要的事情是将抗原等呈递给DC。作为呈递方法,目前使用两种方法。第一种是将来源于抗原蛋白质的抗原肽与DC表面的MHC抗原(HLA)直接结合的方法,第二种是通过内吞作用等将蛋白质摄入到DC中的方法。
其中,当使用来源于抗原蛋白质的MHCI类限制性抗原肽直接结合抗原呈递细胞的MHCI类抗原时,培养并充分成熟抗原呈递细胞,并然后将溶解于生理溶剂的肽加入到培养溶液中,以使浓度为约1μg/mL,并将溶液温育2至24小时,并然后允许与MHCI类分子结合。
然而,在将来源于抗原蛋白质的抗原肽直与抗原呈递细胞的MHC抗原直接结合的方法中,CTL可以通过由I类呈递的抗原诱导。在例如人类的情况下,已经鉴定了特异性HLA,例如结合抗原肽的I类核心,例如A02和A24,但是还没有鉴定其他HLA类型。即,由于该肽限制于特异性HLA,所以其仅可以用于具有特定HLA相容性的患者。此外,在该情况下,由于也不可以使用II类,所以CD4阳性(辅助)T细胞功能也不可用。
在另一方面,在通过内吞作用摄入抗原蛋白质的方法中,将肿瘤组织在生理缓冲溶液例如磷酸缓冲盐(在下文中,称为“PBS”)中制备成匀浆(破碎处理),并且仅将裂解液中的蛋白质或肽(上清液)加入到DC的培养溶液中。在这种情况下,摄入的蛋白质在溶酶体中加工,装载在主要由II类组织相容性抗原(II类)呈递的通路上,并主要刺激CD4阳性(辅助性)T细胞,以诱导其活化。此外,作为用于掺入胞外物质的系统,存在用于加工废物的机制,其掺入与受体结合的物质,例如,已知甘露糖受体将与受体结合的糖蛋白质等掺入到细胞中。这也涉及通过溶酶体的由II类呈递的通路。相反,胞质中的蛋白质用蛋白酶体加工,并装载在主要由I类组织相容性抗原(I类)呈递的通路上,并且主要刺激CD8阳性(杀伤性)T细胞(CTL),以诱导其活性。
当将肿瘤组织在生理缓冲溶液中制备成匀浆时,将作为上清液的可溶性级分加入到DC中,但将作为沉淀的不溶性级分去除。因此,不能使用包含在不溶性级分中的抗原蛋白质。即使将蛋白质生产为重组蛋白质,由于其回收在不可溶部分中,因此不能通过DC呈递抗原。
此外,当允许树突状细胞通过内吞掺入抗原时,实际上是将抗原运输到指向II类的抗原呈递通路,并因此不能充分地将抗原呈递给CD8阳性(杀伤性)T细胞和来自I类的CTL。为了解决该困难,最近,已经应用电穿孔等用于将蛋白质导入到细胞中的方法。然而,为了导入不溶性蛋白质,需要将蛋白质溶解在生理溶剂中。
为了溶解不溶性蛋白质,通常,在溶剂如具有变性作用的尿素或盐酸胍中一次性溶解蛋白质的技术,并且当蛋白质不容易溶解时,会使用添加的还原剂如二硫苏糖醇(DTT)。
因此,为了抑制随机分子间二硫键,加入谷胱甘肽。根据情况,为了抑制分子间聚集,也加入精氨酸并然后引起氧化还原反应(转变成谷胱甘肽)。氧化还原反应后,用PBS缓冲溶液等(根据情况,加入约10%甘油到PBS中)进行透析等,从而用生理溶剂替换该溶剂以实现溶解和纯化(非专利文献2)。然而,在此类方法的情况下,许多蛋白质不能溶解,并且即使是能溶解的蛋白质,当用生理溶解透析时,几乎全部蛋白质都可能沉淀。因此,不能获得足够的效果。
如上所述,为了提供足够的抗肿瘤效果,需要将靶抗原蛋白质以溶解的状态掺入树突状细胞中并呈递给MHCI类,并因此,认为用于将不溶性蛋白质溶解在生理溶剂中的技术是必需的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:JonathanM.Weiss等人,J.Immunother,VOL.28:542-550(2005)。
非专利文献2:MethodinEnzymology1999;309,217-236
发明概述
技术问题
本发明已经考虑了上述情况,并提供了在生理溶剂中溶解不溶性蛋白质和/或肽(在下文中,也称为“不溶性蛋白质”的方法,所述不溶性蛋白质和/或肽在常规方法中不能充分溶解。此外,本发明也提供了将不溶性蛋白质有效转导入细胞中的方法。此外,本发明提供了呈递不溶性抗原的抗原呈递细胞的产生方法、由该产生方法产生的抗原呈递细胞、使用抗原呈递细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法和诱导细胞毒性T淋巴细胞的试剂,以及使用该抗原呈递细胞预防和治疗癌症和/或传染病的方法或试剂。
解决问题的手段
本发明人实施了多种研究,以解决以上所提及的问题,并且当通过使用生理溶剂替换通过使用变性剂溶解了蛋白质的溶液时,已经发现,通过添加核苷酸可以有效地实现加溶溶解。此外,已经显示,通过电穿孔可以将通过本发明的溶解方法溶解的蛋白质导入细胞中。因此,本发明人已经发现,当将癌症、传染病等的疾病抗原蛋白质溶解并转导到抗原呈递细胞中时,可以诱导对疾病抗原特异的CTL。因此,本发明人完成了本发明。
即,本发明提供了以下(1)至(42)。
(1)用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法,该方法包括:
在一种溶液中将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合,并溶解不溶性蛋白质和/或肽,从而形成不溶性蛋白质和/或肽的溶液的步骤;
将核苷酸加入溶液的步骤;和
从溶液中去除变性剂的步骤。
(2)根据(1)所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法,其中所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
(3)根据(1)或(2)所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法,其中构成核苷酸的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任意一种,和加入一种核苷酸或加入多种核苷酸的组合。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法,其中构成核苷酸的磷酸基团的数量是1个至3个。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法,其中在将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合后加入或同时加入所述核苷酸。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法,其中在从溶液中除去变性剂的步骤中,在用生理溶剂替换溶液时去除变性剂,并优选地,该生理溶剂包含核苷酸。
(7)根据(1)至(6)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法,其中所述不溶性蛋白质和/或肽是天然存在的蛋白质和/或肽、通过基因重组技术产生的蛋白质和/或肽或者化学合成的蛋白质和/或肽。
(8)根据(1)至(7)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法,其中所述不溶性蛋白质和/或肽是抗原蛋白质。
(9)根据(1)至(8)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法,其中所述变性剂是尿素和/或盐酸胍。
(10)根据(1)至(9)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法,其中在一种溶液中将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合的步骤中,还加入还原剂。
(11)根据(1)至(10)中任一项所述的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法,其中所述还原剂是二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。
(12)用于将不溶性蛋白质和/或肽转导到细胞中的方法,该方法包括:
在一种溶液中将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合,并溶解不溶性蛋白质和/或肽,从而形成不溶性蛋白质和/或肽的溶液的步骤;
将核苷酸加入溶液的步骤;和
在用生理溶剂替换溶液时去除变性剂,从而形成不溶性蛋白质和/或肽的生理溶液的步骤;和
将生理溶液转导入目的细胞的细胞质或细胞内。
(13)根据(12)所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
(14)根据(12)或(13)项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中构成核苷酸的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任意一种;并加入一种核苷酸或加入多种核苷酸的组合。
(15)根据(12)至(14)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中构成核苷酸的磷酸基团的数量是1个至3个。
(16)根据(12)至(15)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中在将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合后加入或同时加入所述核苷酸。
(17)根据(12)至(16)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中用于替换蛋白质和/或肽的溶液的生理溶剂包含核苷酸。
(18)根据(12)至(17)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中所述细胞是具有抗原呈递功能的细胞。
(19)根据(12)至(18)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中所述具有抗原呈递功能的细胞是树突状细胞。
(20)根据(12)至(19)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中所述不溶性蛋白质和/或肽是天然存在的蛋白质和/或肽、通过基因重组技术产生的蛋白质和/或肽或者化学合成的蛋白质和/或肽。
(21)根据(12)至(20)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中所述不溶性蛋白质和/或肽是抗原蛋白质或肽。
(22)根据(12)至(21)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中所述变性剂是尿素和/或盐酸胍。
(23)根据(12)至(22)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中在一种溶液中将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合的步骤中,还加入还原剂。
(24)根据(12)至(23)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中所述还原剂是二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。
(25)根据(12)至(24)中任一项所述的用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞的方法,其中通过电穿孔将所述溶解的不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞质和/或细胞内。
(26)用于产生呈递不溶性抗原的抗原呈递细胞的方法,该方法包括:
在一种溶液中将不溶性抗原与变性剂混合,并溶解不溶性抗原,从而形成含不溶性抗原的溶液的步骤;
将核苷酸加入溶液的步骤;
在用生理溶剂替换溶液时去除变性剂,从而形成含不溶性抗原的生理溶液的步骤;和
将含不溶性抗原的生理溶液转导入抗原呈递细胞的细胞质或细胞内。
(27)根据(26)所述的用于产生抗原呈递细胞的方法,其中所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
(28)根据(26)或(27)所述的用于产生抗原呈递细胞的方法,其中构成核苷酸的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任意一种;并加入一种核苷酸或加入多种核苷酸的组合。
(29)根据(26)至(28)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法,其中构成核苷酸的磷酸基团的数量是1个至3个。
(30)根据(26)至(29)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法,其中用于替换抗原的溶液的生理溶剂包含核苷酸。
(31)根据(26)至(30)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法,其中所述抗原是获自肿瘤细胞、肿瘤组织、传染病细胞或病原性细胞的破碎物的不溶性级分。
(32)根据(26)至(31)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法,其中所述抗原是蛋白质或肽。
(33)根据(26)至(32)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法,其中所述抗原是天然存在的蛋白质和/或肽、通过基因重组技术产生的蛋白质和/或肽或者化学合成的蛋白质和/或肽。
(34)根据(26)至(33)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法,其中所述抗原呈递细胞是树突状细胞。
(35)根据(26)至(34)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法,其中所述变性剂是尿素和/或盐酸胍。
(36)根据(26)至(35)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法,其中在一种溶液中将不溶性蛋白质和/或肽与变性剂混合的步骤中,还加入还原剂。
(37)根据(26)至(36)中任一项所述的用于产生抗原呈递细胞的方法,其中所述还原剂是二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。
(38)通过根据(26)至(37)中任一项所述的产生方法产生的抗原呈递细胞。
(39)用于诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法,该方法包括将通过根据据(26)至(37)中任一项的产生方法产生的抗原呈递细胞施用给包括人类在内的哺乳动物的步骤。
(40)用于治疗或预防癌症和/或传染病的方法,该方法包括将通过根据(26)至(37)中任一项的产生方法产生的抗原呈递细胞施用给包括人类在内的哺乳动物的步骤。
(41)用于诱导细胞毒性T淋巴细胞的组合物,该组合物包含,作为活性成分的通过根据(26)至(37)中任一项的产生方法产生的抗原呈递细胞。
(42)用于治疗或预防癌症和/或传染病的组合物,该组合物包含,作为活性成分的通过根据(26)至(37)中任一项的产生方法产生的抗原呈递细胞。
发明的有利效果
使用本发明的加溶方法,可以溶解不溶性蛋白质例如天然存在的蛋白质和重组的蛋白质。此外,当使用经溶解的蛋白质时,通过电穿孔可以将它们直接转导入胞质。使用本发明的具体方法包括,用于呈递不溶性抗原的抗原呈递细胞的产生方法,产生免疫应答药物和制备试剂和药物的应用,以及提供含溶解的蛋白质抗原的例如蛋白质疫苗、肽疫苗或树突状细胞疫苗。
附图简述
图1显示在添加精氨酸、核苷酸和它们二者的情况下溶解TRP-2融合蛋白,以及通过SDS-PAGE检测上清液和沉淀中含有的TRP-2融合蛋白的结果。
图2显示通过分别添加4种类型核苷酸或它们的组合溶解TRP-2,以及通过SDS-PAGE检测上清液和沉淀中含有的TRP-2的结果。
图3显示通过添加核糖核苷酸(GTP)或脱氧核糖核苷酸(dGTP)溶解TRP-2,以及通过SDS-PAGE检测上清液和沉淀中含有的TRP-2的结果。
图4显示通过加入GMP或GTP溶解TRP-2,以及通过SDS-PAGE检测上清液和沉淀中含有的TRP-2的结果。
图5显示通过加入UMP或UTP溶解TRP-2,以及通过SDS-PAGE检测上清液和沉淀中含有的TRP-2的结果。
图6显示通过加入UMP溶解TRP-2、使用具有不同pH的溶液透析,以及通过SDS-PAGE检测上清液和沉淀中含有的TRP-2的结果。
图7a显示当通过蛋白质印迹分析人黑素瘤细胞系匀浆物的可溶性级分(S)和不溶性级分(P)时,在没有转移的情况下,在凝胶中残留的蛋白质的CBB染色结果。图7b显示使用抗MART-1抗体的蛋白质印迹结果。
图8显示当通过本发明的溶解方法溶解Mewo不溶性级分,并使用抗MART-1抗体的蛋白质印迹的结果。
图9显示当使用UMP溶解小鼠黑素瘤(B16)匀浆物的沉淀级分,并通过SDS-PAGE检测上清液或沉淀中含有的蛋白质的量的结果。
图10显示当使用UMP溶解人乳腺癌(MDA-MB-231)匀浆物的沉淀级分,并通过SDS-PAGE检测上清液或沉淀中含有的蛋白质的量的结果。
图11显示当使用UMP溶解人前列腺癌(DU145)匀浆物的沉淀级分,并通过SDS-PAGE检测上清液或沉淀中含有的蛋白质的量的结果。
图12显示在用CD11b/CD11c和CD80/CD86抗体诱导树突状细胞后,表型的分析。
图13显示通过四聚体分析证实TRP-2特异的CTL诱导效应。
图14a是证实B16的H-2Kb和H-2Db表达的图。图14b是显示当通过电穿孔将B16的裂解物(可溶性级分:sup)或者溶解的不溶性级分(ppt)导入DC中时,通过使用TerascanVP系统测定细胞毒活性,证实在用DC免疫的小鼠的体内诱导了特异识别B16的癌抗原的CTL的图。
实施方案的描述
在下文中,描述了实施本发明的实施方案。然而,无需说明的是,本发明并不受限于这些实施方案,并且在不超出概述的范围的情况下,可以将本发明实施于多个实施方案。
用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法
首先,描述了根据本发明的用于溶解不溶性蛋白质和/或肽的方法(在下文中,也称为“本发明的用于溶解的方法”)。
在说明书中使用的“不溶性”指蛋白质的性质,以及蛋白质在液体中,特别地在水或生理溶剂中不能溶解或较少溶解,以致在室温不能形成均质的混合溶液的性质。在蛋白质存在于水、水和盐,以及水和不会变性蛋白质的生理溶剂中的情况下,在15100×g离心(进行离心)该蛋白质的溶液1小时后,当该蛋白质基本上不存在于上清液中,或者该蛋白质的至少50%、期望地75%或更多、和更期望地100%在上清液中不存在时,将在本发明书中所描述的天然不溶性蛋白质的性质称为不溶性。
本文中所述的“蛋白质”包括肽、多肽等,并且其并不限于在自然界中存在的天然存在蛋白质,但其包括来源于通过基因转移等转化的细胞的重组蛋白质、通过使用无细胞蛋白质表达系统体外表达的蛋白质和以无机合成化学方式产生的合成蛋白质。此外,可以包括这样的蛋白质,其中构成蛋白质的氨基酸的一部分或者全部由乙酰化、磷酸化、甲基化等的功能基团提供,或者用糖链、蛋白质、脂类等修饰。值得注意的是,在本说明书、权利要求和摘要中,为了明确本发明也包括不溶性肽,在一些情况下,可以将蛋白质和肽二者描述为“不溶性蛋白质和/或肽”。
本文中所用的“不溶性蛋白质”指当在室温搅拌时,在水或生理溶剂中不溶解或者较少溶解的蛋白质,和使用变性剂是溶解的但当用生理溶剂替换该溶剂时产生沉淀的蛋白质。此外,即使本来的天然形式是可溶性蛋白质,但如果通过使用异种生物表达为重组蛋白质(例如,在基因重组技术中,构建表达系统大肠杆菌的情况下),将回收为包涵体(包含体)的靶蛋白质也称为不溶性蛋白质。
在肿瘤组织或肿瘤细胞的破碎物中含有的不溶性蛋白质的实例包括具有跨膜结构的膜蛋白。由于膜蛋白包括亲水部分和疏水部分,所以通常已知,其被回收在不溶性级分中。膜蛋白包括已知为癌抗原的分子,非常重要的是,将这些蛋白质溶解并用于免疫细胞疗法。在肿瘤组织或肿瘤细胞的破碎物中含有的不溶性蛋白质的实例包括MART-1、PSMA和TRP-2。此外,也考虑,当本来可溶的抗原蛋白质突变时,改变了氨基酸的组成,并且该蛋白质不再具有正常的结构,并从而变成不溶的。在蛋白质如阮病毒(J.Mol.Neurosci.2007;32:90-96)、超氧化物歧化酶(J.Biol.Chem.2008;283:866-874)和αA-晶体蛋白(Biochemistry2008;47:9697-9706)中已经观察到了上述现象。
在该说明书中,术语“加溶”指在维持其氨基酸序列的情况下,在生理溶剂中溶解不溶性蛋白质。其指当将使用变性剂溶解不溶性蛋白质的溶液用生理溶剂替换,并离心时,在离心后,增加在上清液中回收的不溶性蛋白质的量。
在本发明的加溶方法中使用的核苷酸是结合了碱基、糖和磷酸的化合物。糖部分为D-2-脱氧核糖的核苷酸称为脱氧核糖核苷酸,其是构成DNA的一部分。此外,糖部分为核糖的核苷酸称为核糖核苷酸,其是构成RNA的一部分。对于磷酸部分,结合的是1个至3个磷酸。对于碱基部分,结合的是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
在本发明的加溶方法中,可以使用任一脱氧核糖核酸和核糖核酸。此外,与核苷酸结合的磷酸的数目可以是1至3个中的任意一种。作为构成核苷酸的碱基,可以使用与核苷酸结合的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的任一碱基。然而,由于取决于构成的碱基和溶解的蛋白质,加溶的效率不同,期望的是使用任意一种或多种碱基的组合。实例包括腺苷一磷酸(AMP)、尿苷一磷酸(UMP)、鸟苷一磷酸(GMP)、胞苷一磷酸(CMP)、腺苷二磷酸(ADP)、尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胞苷二磷酸(CDP)、腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧胸苷二磷酸(dTDP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧胞苷二磷酸(dCDP)、脱氧腺苷一磷酸(dAMP)、脱氧胸苷一磷酸(dTMP)、脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)、脱氧胞苷一磷酸(dCMP)、脱氧核苷三磷酸(dNTP;dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物)。
在本发明的加溶方法中使用的变性剂一般是尿素、盐酸胍、表面活性剂等,并指具有切割形成不溶性三维结构的离子键、氢键、疏水相互作用等的性质的试剂。以将变性剂溶解于水溶液的状态下使用此类变性剂。例如,优选其pH可以调整的缓冲溶液如磷酸钠水溶液。
在本发明的加溶方法中使用的还原剂是二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2ME)等,并指具有切割形成不溶性三维结构的二硫键的性质的试剂。可以以将它们事先与还原剂混合或者溶解于不同溶剂的状态下使用此类还原剂。
在本发明的加溶方法中,从含有变性剂的蛋白质溶液中去除变性剂的方法的实例包括,通过透析或者凝胶过滤替换该溶剂的方法。特别地,出于易于操作考虑,优选的是透析。用于替换的溶剂可以是不含变性剂的任一溶剂,并例如,可以使用水和生理溶剂。特别地,当将蛋白质溶剂加入细胞的培养溶液时,或者当将蛋白质溶剂施用给活体时,优选地,将该溶液用生理溶剂替换。例如,作为生理溶剂,优选的是PBS(磷酸缓冲盐水)、生理盐水等。此外,当将核苷酸加入生理溶剂时,可以更有效地溶解不溶性蛋白质。加入到生理溶剂的核苷酸的浓度优选地为约10μM。
基于蛋白质的来源,本发明的加溶方法的实施方案不同。
例如,a)获自肿瘤组织和细胞的蛋白质,作为天然存在的蛋白质,如下溶解。
a-1)细分组织,然后通过反复冻融破坏细胞,或者通过超声波等破碎细胞,并通过离心分级成上清液(可溶性级分)和沉淀(不溶性级分)。
a-2)将回收的沉淀使用变性剂,例如4至8M尿素溶解。当沉淀不易溶解时,可以加入还原剂,例如DTT、2ME等。
a-3)当加入还原剂时,优选地加入氧化的谷胱甘肽等。
a-4)在用变性剂溶解不溶性蛋白质的状态下,加入核苷酸。优选地,以使得终浓度为0.5mM至10mM的量加入核苷酸。
a-5)通过用含约10μM核苷酸的生理溶剂透析,去除变性剂等。
例如,b)通过使用真核细胞、菌体等表达的不溶性重组蛋白质,如下溶解。
b-1)通过例如,超声波破碎细胞或菌,和离心以分离不溶性级分并回收不溶性蛋白质。
b-2)用变性剂例如,4至8M尿素溶解回收的不溶性蛋白质。当沉淀不易溶解时,加入还原剂例如,DTT、2ME等。
b-3)实施层析系统进行纯化以获得靶蛋白质。可以使用任一层析系统,只要不影响溶剂、可以提取靶蛋白质即可,例如,优选的是使用蛋白质特异性抗体的亲和层析,或者当蛋白质包含组氨酸标签等时,优选的是镍亲和层析等。
b-4)此外,当实施纯化时,可以根据所使用的靶蛋白的性质或溶剂,通过使用纯化方法纯化蛋白质,例如,分子排阻层析、凝胶过滤层析、凝胶渗透层析、离子交换层析等(所述层析可以与高效液相层析组合)。
b-5)在纯化前、纯化期间或纯化后,将还原剂加入到蛋白质溶液中。在纯化后加入还原剂的情况下,在添加还原剂后,将溶液室温维持约1小时以发生还原反应。作为还原剂,例如,优选的是DTT。
b-6)通过使用不含还原剂的变性剂透析,去除过量的还原剂。
b-7)优选地,加入氧化的谷胱甘肽(根据需要,还原的谷胱甘肽)等。
b-8)加入核苷酸并室温维持1小时。优选地,以使得终浓度为0.5mM至10mM的量加入核苷酸。
b-9)通过使用含有约10μM核苷酸的生理溶剂透析,去除变性剂。
例如,c)不溶性的合成蛋白质如下溶解。
c-1)从含氨基酸和随机结合肽片段的合成蛋白质溶液中通过例如高效液相层析回收靶不溶性蛋白质。
c-2)用变性剂例如,4至8M尿素溶解回收的不溶性蛋白质。当不溶性蛋白质不易溶解时,可以加入还原剂,例如DTT、2ME等。
c-3)当加入还原剂时,优选地加入氧化的谷胱甘肽等。
c-4)在不溶性蛋白质用变性剂溶解的状态下,加入核苷酸。优选地,以使得终浓度为0.5mM至10mM的量加入核苷酸。
c-5)通过使用含有约10μM核苷酸的生理溶剂透析,去除变性剂等。
以这种方式在生理溶剂中溶解的蛋白质和/或肽不同于不溶性状态,并可以使用滤器进行灭菌,其可以作为疫苗施用给患者。
关于用于将不溶性蛋白质转导入细胞的方法:
接下来,描述了根据本发明的用于将不溶性蛋白质转导入细胞的方法。通过例如,电穿孔,将已经通过上述本发明加溶方法溶解的不溶性蛋白质转导入细胞的胞质和/或细胞内,产生抗原呈递细胞。
根据上述本发明加溶方法,在生理溶剂中溶解不溶性蛋白质。当在生理溶剂中溶解不溶性蛋白质时,不易发生在导入蛋白质期间或之后由于溶剂的毒性杀死细胞的问题。
在本发明的用于导入细胞的方法中,作为用于导入溶解于生理溶剂的不溶性蛋白质的方法,可以使用通常使用的多种方法。例如,可以应用电穿孔。
在本发明的导入方法中,当通过电穿孔将溶解的不溶性蛋白质导入抗原呈递细胞(例如,树突状细胞)时,导入的蛋白质和/或肽呈递给MHCI类,并可以诱导CTL。此外,通过交叉呈递(crosspresentation),将肽的一部分呈递给MHCII类,并且其活化Th细胞。通过将抗原呈递给MHCII类活化Th1细胞,其产生对于细胞免疫所必需的细胞因子,并促进CTL的诱导。
电穿孔是应用物理原理的导入方法,其中当将细胞暴露于电脉冲时,原核/真核细胞的膜短暂的破裂。例如,当在将抗原蛋白质等加入到细胞培养溶液中的状态下给予电脉冲时,从扩大的细胞膜的孔可以将溶解的蛋白质直接导入胞质中。
将培养细胞的培养溶液用无血清培养基、PBS等替换,并制备成约1×106个细胞/mL。将蛋白质溶液加入到细胞悬浮液中,将细胞悬浮液放入小电极杯中,并将电极与电穿孔仪器主体连接。快速实施电脉冲,并回收于5倍体积或更多体积的培养基中。然后,培养至少1小时,并用于期望的应用。
当在可药用溶剂(例如,生理盐水)中悬浮其中已经导入了溶解的蛋白质和/或肽的树突状细胞时,其可以作为树突状细胞疫苗施用给患者。
接下来,描述了根据本发明的抗原呈递细胞的产生方法。
在本发明的抗原呈递细胞的产生方法中,对所使用的生理溶剂不溶的抗原的实例包括,获自肿瘤组织或肿瘤细胞的破碎物的不溶性级分、获自感染了病毒的传染病细胞的破碎物的不溶性级分、获自病原性细菌的破碎物的不溶性级分、人工合成的不溶性蛋白质或肽等。特别地,获自肿瘤组织或肿瘤细胞的破碎物的不溶性级分、获自感染了病毒的传染病细胞的破碎物的不溶性级分、获自病原性细菌的破碎物的不溶性级分含有在肿瘤组织或肿瘤细胞中、在传染病细胞和病原性细菌中特异表达的不溶性蛋白质抗原。与仅用上清液诱导CTL的常规方法比较,当溶解此类不溶性级分并允许呈递抗原时,期望诱导了更高的抗肿瘤活性、抗(病毒)传染病活性、抗病原性细菌活性。
在一种溶液中混合不溶性抗原和变性剂(例如,4至8M尿素),以产生含不溶性抗原的溶液。根据需要,将DTT或2ME作为还原剂加入。然后,在含不溶性抗原的溶液中加入核苷酸。
将含不溶性抗原的溶液替换为生理溶剂,从而去除变性剂。因此,可以获得含不溶性抗原的生理溶液。
将含不溶性抗原的生理溶液转导入抗原呈递细胞(例如,树突状细胞)中。对于转导方法,优选的是将不溶性抗原直接转导入胞质的方法,并例如,可以应用电穿孔。
由于在如此产生的抗原呈递细胞中,转导的抗原在细胞中降解并呈递给MHCI类,可以诱导对抗原特异的CTL。特别地,当转导了蛋白质时,由于呈递了序列中含有的多个表位,因此可以活化多种类型的对抗原特异的CTL。此外,由于也呈递了MHCII类的表位,所以也活化了Th1细胞,并可以进一步促进CTL的活化。
因此,可以将如此产生的抗原呈递细胞用于诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法、诱导细胞毒性T淋巴细胞的试剂、用于预防或治疗癌症和/或传染病的方法和用于预防或治疗癌症和/或传染病的试剂。更特别地,例如,获取从收集自癌症患者的肿瘤组织或肿瘤细胞的破碎物中获得的不溶性级分,或者从与来自患病毒传染病的患者相同的病毒的破碎物中获得的不溶性级分或者从与来自患病原性细菌传染病患者相同的病原性细菌的破碎物中获得的不溶性级分,并且将此类不溶性级分用于本发明的加溶方法并溶解,并将溶解的级分加入到抗原呈递细胞例如收集自相同患者的淋巴细胞或树突状细胞,并培养以诱导抗原呈递细胞,并且将诱导的抗原呈递细胞施用给相同的患者。由此,可以诱导对肿瘤细胞、病毒或病原性细菌特异的细胞毒性T淋巴细胞,从而可以预防或治疗疾病如癌症或病毒传染病。此外,将借助本发明加溶方法溶解重组蛋白质或者合成蛋白质获得的溶解蛋白质加入到抗原呈递细胞例如收集自患者的淋巴细胞或树突状细胞中,并培养以诱导抗原呈递细胞,并且将诱导的抗原呈递细胞施用给相同的患者。通过常规方法可以将诱导的抗原呈递细胞施用给患者,例如,可以保持原状施用给患者,或者可以以常规形式如注射施用给患者,并且可以作为常规疫苗制剂施用。此外,待施用的抗原呈递细胞的量可以根据患者疾病的症状或类型;以及在用于预防时,根据所预防的疾病和受试者的类型来任意地确定。此外,通过使用产生的抗原呈递细胞,将收集自患者的淋巴细胞和抗原呈递细胞混合,并培养以体外诱导CTL。
实施例1
核苷酸有效性的研究
将重组小鼠酪氨酸酶相关的蛋白质2(在下文中,也称为“TRP-2”)用作为不溶性蛋白质,并研究了使用核苷酸的加溶方法。
首先,制备包含在N末端添加了组氨酸标签(His-tag)的由遍在蛋白片段(在下文中,称为“Ubi”)和TRP-2组成的重组融合蛋白(在下文中,称为“UT”)。Ubi分离自编码SEQIDNO:1中所述的氨基酸序列的cDNA,并且TRP-2分离自编码基于在SWISS-PROT数据库的ACNo.P29812中所述的氨基酸序列的N末端第56个残基谷氨酸(E)到N末端第472个残基的丝氨酸(S)的cDNA。将Ubi和TRP-2插入到pET19b载体(Novagen公司)中,以形成表达质粒(pET19b/UT)。当用pET19b/UT转化大肠杆菌(Rosetta-gami2(DE3)pLysS:Novagen,#71352-3)以表达重组蛋白质时,产生了具有序列:NH2-His-Ubi-TRP-2-CO2H(SEQIDNO:2)的融合蛋白(UT蛋白质),但其形成了包涵体(包含体)且是不溶的。
在含蛋白酶抑制剂(CompleteEDTA-free,Roche,#04693132001)的PBS中悬浮已经表达了UT蛋白质的大肠杆菌,通过使用超声波装置破坏,通过使用M-X100离心机,TMP-11转子(TOMY)在4℃在15100×g进行离心1小时。
将离心后不溶的级分(沉淀)悬浮于4M尿素/PBS(pH7.4),将悬浮液室温搅拌1小时,并在4℃在15100×g离心1小时。
将离心后不溶的级分(沉淀)
1)溶解于8M尿素/150mMNaCl/5mMDTT/20mM磷酸钠(pH8.5)中,并将该溶液进行
2)使用AKTAExplorer液相层析系统(AmershamPharmasiaBiotech)的镍亲和(HisTrapHP柱,AmershamPharmasiaBiotech,#17-5247-01),和
3)用6M尿素/150mMNaCl/5mMDTT/20mM磷酸钠(pH8.5)凝胶过滤层析(Superose12HR柱,AmershamPharmasiaBiotech,#17-0538-01),以部分地纯化重组蛋白质。
将DTT加入到已经经历了凝胶过滤纯化的样品中,以使浓度为5mM,并使混合物反应1小时,然后用6M尿素/150mMNaCl/20mM磷酸钠(pH8.5)实施透析以去除未反应的DTT。
使用上述方法,获得了蛋白质样品。然而,在上述方法中获得的蛋白质样品处于含有变性剂的状态。因此,对于转导入细胞,不能将该样品原样使用,并因此,必需将该溶剂用生理溶剂更换。然后,通过下述4至10的步骤,尝试将蛋白质溶解于生理溶剂(在下文中,在生理溶剂中溶解蛋白质称为“加溶”)。添加精氨酸的方法是熟知的技术,并将其作为对照。
4)将谷胱甘肽(GSSG)加入到3)中获得的蛋白质样品中,以实施氧化-还原反应。
5)加入添加剂(精氨酸或dNTP)并使混合物在室温反应1小时。
6)加入甘油(10%)。
7)用生理溶剂(例如,PBS)实施透析。
8)回收样品并在4℃在15100×g离心1小时。
9)将样品分离成上清液(可溶性级分)和沉淀(不溶性级分),并回收它们。
10)通过例如SDS-PAGE分析加溶有效性。
详细地说明4至10的步骤。将2mMDTT加入到溶解于6M尿素/150mMNaCl/20mM磷酸钠(pH8.5)的UT样品中,并将该溶液在室温维持1小时,然后用6M尿素/150mMNaCl/20mM磷酸钠(pH8.5)实施透析,以去除过量DTT。将样品分配成3个样品管(1)、(2)和(3),并将2.5mM氧化的谷胱甘肽(GSSG)加入到每一管中(每一浓度为终浓度)。此外,将精氨酸(L(+)精氨酸,Wako,#015-04617)只加入到管(3)中,使得终浓度为125mM。将全部管都维持1小时。然后,将10%甘油(终浓度)加入到已经添加了精氨酸的管(3)和加入到管(2)中。用10%甘油/150mMNaCl/20mMTris(羟甲基)氨基甲烷(pH8.4)分别透析这三种类型的反应溶液,从而替换溶剂。由于该透析操作产生了不溶性蛋白质,将不溶性蛋白质在10℃在15100×g离心1小时,并分级成上清液和沉淀(没有溶解的蛋白质回收在沉淀中,且已经溶解的蛋白质回收在上清液中)。
将2×SDS-PAGE样品缓冲溶液(tris-SDS-2ME样品处理溶液:DaiichiPureChemicalsCo.,Ltd.,#423437)加入到上清液中。将沉淀级分溶解于与上清液的量相同的1×SDS-PAGE样品缓冲溶液中,将等同量的每一部分都进行SDS-PAGE。电泳后,将溶液用考马斯亮蓝G250染色溶液染色,并估计在每一上清液和沉淀中回收的蛋白质的量。如图1和表1的(1)、(2)和(3)中所示,蛋白质没有回收在任一可溶性级分中。从以下公式计算表1中显示的加溶率,其中通过使用GelDoc2000(BIORAD)的CCD照相机,将用考马斯亮蓝染色的凝胶拍照为图像,并将每一条带“a”和“b”的面积乘以浓度,以表示为数值(v)。条带“b”是“a”的降解产物。
加溶率(%)=S(v)×100/S(v)+P(v)
S(v):上清液的条带“a”的面积×浓度+上清液的条带“b”的面积×浓度
P(v):沉淀的条带“a”的面积×浓度+沉淀的条带“b”的面积×浓度
使用溶解于6M尿素/150mMNaCl/20mM磷酸钠(pH8.5)的相同蛋白质,在加入dNTP(illustradNTPSet,100mMSolutions,GEHealthcare,27-2035-01)而不是精氨酸,以使终浓度为12.5mM的情况下进行加溶,并研究在加入12.5mMdNTP和125mM精氨酸的情况下的加溶。其他操作与(1)至(3)中的那些操作相同。对应的结果显示于图1和表1的(4)和(5)中。在加入了dNTP的情况下,在上清液中观察到了明显的条带,并且比率为50.8%。也在加入了dNTP和精氨酸(Arg)的情况下,在上清液中观察到了明显的条带,但比率为20.7%。
表1
当加入精氨酸或dNTP时,UT融合蛋白的加溶率
(1)未添加
(4)(2)+dNTP
(2)10%甘油
(5)(2)+Arg+dNTP
(3)(2)+Arg
从上述结果中发现,常规方法不能溶解的蛋白质可以通过添加dNTP溶解。此外,认为加入了dNTP时,不再需要添加精氨酸。
实施例2
核苷酸种类(碱基)的研究
作为不溶性蛋白质的模型,使用重组小鼠TRP-2(rTRP-2;SEQIDNO:3)。rTRP-2分离自编码基于在SWISS-PROT数据库的ACNo.P29812中所述的氨基酸序列的N末端第56个残基谷氨酸(E)到N末端第472个残基的丝氨酸(S)的cDNA,并插入到pET19b载体(Novagen)中,以形成表达质粒(pET19b/mdT)。当用pET19b/mdT转化大肠杆菌(Rosetta-gami2(DE3)pLysS:Novagen,#71352-3)并表达重组时,获得了在N末端具有组氨酸标签(His-标签)的重组蛋白质。重组蛋白质形成了包涵体,并且是不溶的。将该不溶性级分溶于8M尿素/PBS/5mMDTT(pH8.5)或8M尿素/PBS/10mMDTT(pH8.0),并通过使用AKTAexplorer液相层析系统(AmershamPharmasiaBiotech)的镍亲和(HisTrapHP柱,AmershamPharmasiaBiotech,#17-5247-01)和凝胶过滤层析(HiPrep26/60SephacrylS300HR柱,AmershamPharmasiaBiotech,#17-1196-01)部分地纯化该溶液。为了用生理缓冲溶液替换纯化样品的溶剂,实施用PBS的透析,但几乎沉淀了全部量。
在5个样品管中制备溶解于6M尿素/PBS/5mMDTT(pH8.5)的rTRP-2。将2.5mM还原的谷胱甘肽(GSH)和2.5mMGSSG加入到所有管中。将dATP(dA,Sigma,#D6500)、dTTP(dT,Sigma,#D5288)、dCTP(dC,Sigma,#D4635)、dGTP(dG,Sigma,#D4010)或dNTP加入到各个管中,使得终浓度为10mM,并将所有管都维持1小时。之后,将10%甘油加入到每一管中。将这些溶液用10%甘油/PBS(pH8.0)分别透析,并替换溶剂。然后,在10℃在15100×g离心该溶液1小时并分级成上清液和沉淀,并且将沉淀级分溶解于8M尿素/PBS(pH8.0)。在下文中,类似于实施例1,用SDS-PAGE实施分析。
如在图2中所示,当使用任一碱基时,证实rTRP-2回收在可溶性级分中。其中,当加入dT和dG时,几乎全部量的蛋白质都能溶解。
实施例3
核苷酸的种类(核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的研究
在6个样品管中制备溶解于6M尿素/PBS/5mMDTT(pH8.5)的rTRP-2,并将2.5mMGSH和2.5mMGSSG加入到所有管中。将GTP(Sigma,#G8877)或dGTP加入到各个管中,使得浓度为2mM、10mM或50mM,并将所有管都维持1小时。之后,将10%的甘油加入到各个管中。用10%甘油/PBS(pH8.0)实施透析,并替换溶剂。之后,在10℃在15100×g离心该溶液1小时,并分级成上清液和沉淀,并然后类似于实施例1,通过SDS-PAGE实施分析。
如在图3中所示,在2至10mMGTP和2至10mMdGTP时,上清中溶解并回收了约50%。然而,当GTP和dGTP的浓度达到50mM时,几乎所有量都是不溶的,并回收在沉淀级分中。从上所述,认为合适的是加入10mM或更少的核苷酸。因此,其显示,构成核糖核酸的核苷酸和构成脱氧核糖核酸的核苷酸具有相同的效果。
实施例4
核苷酸的种类(单磷酸盐和三磷酸盐)的研究(鸟嘌呤的实例)
在6个样品管中制备溶解于6M尿素/PBS/5mMDTT(pH8.5)的rTRP-2(与实施例3中一样),并将2.5mMGSH和2.5mMGSSG加入到所有管中。将10mMGMP(Sigma,#G8377)、2mMGMP、0.5mMGMP、10mMGTP、2mMGTP或0.5mMGTP加入到各个管中,并将所有管都维持1小时。之后,将10%甘油加入到每一管中。用10%甘油/PBS(pH8.0)实施透析,并替换溶剂。之后,在10℃在15100×g离心该溶液1小时,分级成上清液和沉淀,并因此类似于实施例1,用SDS-PAGE实施分析。
如在图4中所示,在加入0.5至10mMGMP和0.5至2mMGTP的情况下,几乎全部量的TRP-2都是可溶的并回收在上清液中。在加入10mMGTP的情况下,其以部分不溶的状态回收,但50%或更多都以可溶状态回收。从上所述表明,尽管GMP和GTP具有添加浓度的不同合适范围,但GMP和GTP二者都具有等同的效果。
实施例5
核苷酸的种类(单磷酸盐和三磷酸盐)的研究(尿嘧啶的实例)
该实施例举例了尿嘧啶的作用,其是对应于dTTP的构成核糖核酸的碱基,所述dTTP的加溶效率在实施例2中是高的。类似于鸟嘌呤的实例,除使用UMP(Sigma,#U6375)而不是GMP和使用UTP(Sigma,#U6625)而不是GTP外,与实施例4中一样。
如在图5中所示,在加入0.5至10mMUMP和0.5至2mMUTP的情况下,几乎全部量的rTRP-2都是溶解的并回收在上清液中。在加入10mMUTP的情况下,rTRP-2以部分不溶的状态回收,但50%或更多的rTRP-2都以可溶状态回收。从上所述表明,尽管UMP和UTP具有添加浓度的不同合适范围,但UMP和UTP二者都具有等同的加溶作用。从实施例2中的研究和本实施例的研究中显示,可以使用核苷酸的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸二者,其中磷酸的数目是不同的。
实施例6
pH的研究
与实施例5相同,将rTRP-2溶解于已经加入了10mMUMP的6M尿素/PBS/5mMDTT(pH8.5),并制备没有加入10mMUMP的rTRP-2,并且将它们反应1小时。然后,将已经加入了UMP的rTRP-2分成两部分,并用10μMUMP/10%甘油/PBS(pH7.4)或(pH8.0)透析。用10%甘油/PBS(pH7.4)透析没有加入UMP的rTRP-2。在10℃在15100×g离心回收的样品1小时,并分级成上清液和沉淀。将沉淀级分溶解于8M尿素-PBS。在下文中,与实施例1类似,实施通过SDS-PAGE的分析。
结果如在图6中所示,其显示,在pH7.4实施透析的情况下,当没有加入UMP时,在可溶性级分中没有检测到蛋白质,并且几乎所有蛋白质都是不溶的和沉淀的,但当加入了UMP时,蛋白质也回收在可溶性级分中。此外,其显示,当pH达到8.0时,加溶效率是增加的。
实施例7
来源于细胞的天然不溶性蛋白质的定量
将每一种人黑素瘤细胞系Malme-3M、Mewo和G-361培养在75cm2培养瓶中。当细胞覆盖了底部表面时,用PBS洗涤培养细胞三次。洗涤后,刮取细胞,并且在4℃在1000×g离心5分钟并回收为沉淀。测量其湿重。
对于每一湿重,再次将细胞悬浮于PBS中,使得细胞为400μL/100mg。之后,实施冷冻(-80℃)和融化(30℃)6次,并在4℃在15100×g离心1小时(在下文中,将该离心操作简称为“离心”),分级成上清液(可溶性级分:S)和沉淀(不溶性级分:P)。通过BCA方法测量上清液中蛋白质的量,并将沉淀中的蛋白质溶解于与上清液相同体积的8M尿素-PBS后,通过Bradford方法测量沉淀中蛋白质的量。
结果显示于表2中。在Malme-3M和G-361中,在沉淀中回收了50%或更多的蛋白质,在Mewo中,在沉淀中回收了47%的蛋白质。因此证实,用于制备裂解物脉冲(lysate-pulse)DC的树突状细胞(DC)的常规处理方法中使用的可溶性蛋白质,占细胞中含有的蛋白质总量的约50%。
表2
冷冻和融化黑素瘤细胞系后,在上清液(sup)或沉淀(ppt)中含有的蛋白质的量
±SE(n=2)
实施例8
在来源于细胞的天然不溶性蛋白质中检测癌抗原
为了估计在沉淀(不溶性)级分中含有多少癌抗原,使用特异识别已知为黑素瘤的癌抗原的MART-1蛋白质的抗体实施蛋白质印迹法。将上面获得的来源于每一黑素瘤细胞系的上清液和沉淀通过SDS-PAGE分离成等体积。将它们转移到Immun-BlotPVDF膜(BIO-RAD,#162-0176),并然后用TBS中的SuperBlock封闭缓冲液(ThermoSCIENTIFIC,#37535)封闭。之后,抗人MART-1单克隆抗体(MART-1小鼠Mab:SPRING,#E6704)、生物素化抗小鼠Ig(WholeAb:GEHealthcare,#RPN1001-2ML)和Amersham链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物(GEHealthcare,#RPN1234)反应,并通过作为底物的BCIP/NBT溶液(Wako,#547-01941)显色。在各个反应前,将PVDF膜用0.1%Tween20-PBS洗涤。
结果,在Malme-3M的上清液中没有检测到MART-1的条带,和在Mewo和G-361的上清液中检测到了轻微的MART-1的条带。此外,在来源于每一细胞的沉淀中观察到了明显的MART-1的条带(图7)。从上述结果推断,大量的癌抗原蛋白质包含在癌细胞的不溶性级分中。
认为,如果能将在不溶性级分中含有的蛋白质溶解在生理溶剂中,那么与仅使用在常规方法中使用的裂解物中的蛋白质的情况比较,可以将大量的(且不同的)癌抗原蛋白质脉冲树突状细胞。
然后,为了研究通过本发明的加溶方法可以溶解的在不溶性级分中含有的蛋白质的程度,实施了以下的实验。
实施例9
不溶性重组蛋白质的加溶
从实施例4和5中,由于核苷酸中特别是GMP和UMP的加溶效果是强且稳定的,所以在以下实验中添加的核苷酸将限于这两种核苷酸。
将溶解于8M尿素-PBS的rTRP-2以每管等同的体积分成3个测试管(在每一测试管中各含0.367mg)。将具有终浓度2.5mM的GSSG加入到这些测试管中。此外,以等量每管将具有终浓度10mM的GMP加入到第一测试管中;将终浓度10mM的UMP加入到第二测试管中;并将6M尿素-PBS加入到第三测试管中。在室温让它们反应1小时。之后,将1/10体积的50%甘油和6M尿素-PBS加入到反应溶液中,并用含对应的10μM核苷酸(GMP、UMP或无)的10%甘油-PBS(pH8.0)透析该溶液。通过离心,将回收的样品分成上清液和沉淀,并通过BCA方法定量溶解于上清液中的蛋白质(可溶性蛋白质)的量。
结果显示于表3中。在没有加入核苷酸的情况下,以可溶性状态回收的rTRP-2为82.8%,而在加入GMP的情况下,为97.2%,并且在加入UMP的情况下,为100%。本发明加溶方法的有效性得到了证实。
表3
核苷酸在rTRP-2的加溶中的作用
±SD(n=2)
实施例10
来源于细胞的天然不溶性蛋白质的加溶
与实施例7中一样获得Mewo细胞的不溶性级分。将其溶解于8M尿素-PBS,并将得到的溶液分成每管等体积的3个测试管(每一测试管分别含有182μg不溶性蛋白质)。将具有终浓度10mM的GSSG加入到这些测试管中。此外,以等量每管将终浓度10mM的GMP加入到第一个测试管中;将终浓度10mM的UMP加入到第二测试管中;并将6M尿素-PBS加入到第三测试管中。在室温让它们反应1小时。之后,将1/10体积的50%甘油和6M尿素-PBS加入到反应溶液中,并用含对应的10μM核苷酸(GMP、UMP或无)的10%甘油-PBS(pH7.4)透析该溶液。通过离心,将回收的样品分成上清液和沉淀,并通过BCA方法定量溶解于上清液中的蛋白质的量。
结果显示于表4中。在没有加入核苷酸的情况下,以可溶性状态回收的蛋白质为35.9%,而在加入GMP的情况下,为45.8%(与没有加入核苷酸的情况比较,p<0.02),并且在加入UMP的情况下,为59.9%(与没有加入核苷酸的情况比较,p<0.02)。证实了本发明加溶方法的有效性得到了显著的增加。
表4
核苷酸在Memo不溶性级分的加溶中的作用
±SD(n=4)
*P<0.02
此外,通过如实施例8中所述的蛋白质印迹法估计在如此获得的可溶性蛋白质中是否含有MART-1。经加溶处理后的上清液(S)和用与上清液等体积的2×SDS-PAGE样品处理溶液溶解的沉淀(P)通过SDS-PAGE,分别以等体积分离。在下文中,通过如在实施例8中所述的相同操作检测MART-1(图8)。此外,通过使用GelDoc2000(BIORAD)获取图像,并通过产物的浓度和得到的条带的面积计算加溶率。结果显示,当通过添加GMP实施加溶时,在上清液(可溶性级分)中回收了46.6%,并当通过添加UMP实施加溶时,在上清液(可溶性级分)中回收了47.3%。
实施例11
从重组蛋白质的研究中证实,在加入的核苷酸为单磷酸盐的情况下和在核苷酸为三磷酸盐的情况下二者都具有相同水平的效果。证实了天然存在蛋白质的再现性。实施例7通过使用来源于人细胞的蛋白质实施了研究。该实施例通过使用实验系统实施了证实,其中向来源于小鼠细胞的不溶性蛋白质中加入了作为单磷酸盐实例的UMP。
将B16黑素瘤体外培养,并在PBS中通过使用刮棒刮取和回收贴壁细胞。在4℃在700×g离心该溶液5分钟,并丢弃上清液,并将细胞的沉淀冷冻于-80℃。之后,再次加入PBS,并通过冻融(6次)和超声波破碎细胞。在下文中,实施如实施例7中所述的相同操作,并通过使用变性剂将B16黑素瘤的不溶性级分溶解以形成溶液。将10mMUMP作为核苷酸加入到该溶液中。1小时后,用10μMUMP/10%甘油/PBS(pH7.4)透析该溶液,并离心。离心后,回收上清液和沉淀并通过SDS-PAGE和通过蛋白质定量分析。结果显示于图9和表5中。在SDS-PAGE中,在透析后未加入核苷酸的情况下(加入PBS:图中“-”)和在加入了UMP的情况下(图中“+”)二者都在上清液中观察到了蛋白质。然而,在蛋白质定量中,在(-)中的上清液回收率为27.6%,而在(+)中为41.2%。确定了在添加UMP的情况下加溶效率是增加的。即证实了单磷酸盐核苷酸与三磷酸盐核苷酸类似,在天然不溶性蛋白质的加溶中是有效的。
表5
上清液回收率
实施例12
此外,通过使用UMP,证实了在来源于人细胞的不溶性蛋白质中的加溶。通过使用乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)和前列腺癌细胞系(DU145),实施了与实施例7类似的实验。结果显示于图10和11以及表6中。在MDA-MB-231中,当没有加入UMP时,上清液回收率为40.0%,当加入了UMP时,为45.0%。同时,在DU145中,当未加入UMP时,上清液回收率为18.5%,当加入了UMP时,为22.6%。在这两种情况中,在添加UMP的情况下,加溶效率是增加的。
从上述结果可以证实,添加核苷酸在不溶性蛋白质的加溶中是有效的。
表6
两种类型细胞系的不溶性蛋白质的上清液回收率
实施例13
小鼠DC的诱导
为了证实根据本发明方法溶解的蛋白质对于药物的研究和开发是有用的,尝试应用使用小鼠树突状细胞的抗原呈递方法。根据非专利文献1(JonathanM.Weiss等人,J.Immunother,VOL.28:542-550(2005)),通过电穿孔,将在生理溶剂中溶解的来源于癌细胞的可溶性蛋白质转导入树突状细胞的胞质中,该转导的蛋白质在细胞中片段化,并作为抗原肽呈递给MHCI类,并且可以在施用了DC的个体中诱导免疫应答。
当将实施例2中产生的不溶性rTRP-2溶解,并然后通过电穿孔转导入DC时,实施了是否实际上发生了抗原呈递的验证。
将购买的8周龄雄性C57BL/6饲养在SPF环境中,并在第9周或更晚收集骨髓细胞。将收集的骨髓细胞种植在培养瓶中的AIM-V(Invitrogen,087-0112DK)培养基中,在37℃5%CO2中温育4至6小时。然后,去除漂浮的细胞。在加入了10ng/ml小鼠IL-4(Peprotech,#214-14)和20ng/ml小鼠GM-CSF(Peprotech,#315-03)的AIM-V中培养贴壁细胞1天,并在第二天用新鲜培养基替换该培养基。此外,每隔一天用新的培养基替换该培养基。将开始培养贴壁细胞后直到第7天自然漂浮的细胞用作为成熟DC。
图12显示证实成熟DC的细胞表面抗原的实例。通过用分析CD11c的PE抗CD11c,CloneN418(BioLegend,#117307)和PEArmenianHamsterIgG同种型对照,CloneHTK888(BioLegend,#400907)标记;通过用分析CD11b的FITC抗小鼠CD11b,CloneM1/70(BioLegend,#101205),和FITC大鼠IgG2b,同种型对照,CloneRTK4530(BioLegend,#400605)标记;通过用分析CD80的FITC抗小鼠CD80,Clone16-10A1(BioLegend,#104705),和FITCArmenianHamsterIgG同种型对照,CloneHTK888(BioLegend,#400905)标记;以及对于CD86的分析,通过用生物素抗小鼠CD86,CloneGL-1(BioLegend,#105003),和生物素大鼠IgG2a,同种型对照,CloneRTK2758(BioLegend,#400503)标记,然后用链霉亲和素-PE/Cy5(BioLegend,#405205)标记,通过使用流式细胞仪(CYTOMICSFC500,BECKMANCOULTER)实施每一CD的分析。
图12a)是显示用CD11c和CD11b显影的图,其显示82.3%的细胞为CD11c阳性。同时,图12b)是显示用CD80和CD86显影的图,其显示81.6%的细胞为CD80阳性或者CD86阳性。从上所述,证实所使用的细胞是成熟的DC。
电穿孔
用X-VIVO20(TakaraBioInc.,#04-448Q)更换培养第7天回收的DC的培养基,并计数细胞的数目。加入对于活细胞数2×105个细胞,添加UMP或GMP而溶解的rTRP-2150pmole,用缓冲液制备成体积0.4ml,细胞总数为约1×106。此时,培养基的比率为至少75%。将该细胞悬浮液置于2mm间隙的NEPA小杯电极(NEPAGENE,#EC-002S)中,并通过使用ElectrosquarePorator(BTX,ECM830),以500微秒500v脉冲。脉冲后,立即用5倍体积的X-VIVO20回收细胞,并在37℃在5%CO2中温育1小时。温育细胞后,活细胞率为大约20%。在该技术中用FITC-葡聚糖(Sigma,#FD500S)脉冲时,在以前的研究中证实,FITC-葡聚糖可以转导入几乎所有的细胞中。在将细胞温育1小时后,加入10ng/mlIL-4、20ng/mlGM-CSF和10ng/ml小鼠IFN-γ(Pepratech,#315-05),并将细胞培养约15小时。培养细胞后,回收细胞,并将培养基用含0.5%正常C57BL/6血清的PBS替换,并制备,以使活细胞数为约2×105个细胞/200μl。
免疫
将用于电穿孔的DC的一部分保持原状培养,在免疫当天,向其加入1μg/ml的TRP-2肽(SVYDFFVWL:SEQIDNO:4),培养6小时,并回收和类似地制备,以使活细胞的数量为约2×105个细胞/200μl(肽脉冲的DC)。将用作为阳性对照(肽)的肽脉冲DC、其中通过电穿孔转导了由于添加UMP溶解的rTRP-2的DC(T(U))或者其中通过电穿孔转导了由于添加GMP溶解的rTRP-2的DC(T(G))以2×105个细胞/200μl/小鼠的数量腹膜内施用给C57BL/6小鼠,从而实施免疫。免疫每隔一周实施,实施三次。最终免疫后一周,回收脾细胞。
CTL诱导的证实
将回收的脾细胞用H-2KbTRP-2四聚体-SVYDFFVWL(SEQIDNO:4)-(MBL,#TS-5004-1)或者作为阴性对照的H-2KbOVA四聚体-SIINFEKL(SEQIDNO:5)-(BCI,#TS-5001-1)标记,并且同时,通过使用抗CD8a抗体-FITC,Clone53-6.7(BDBioscience,#553030)或者大鼠IgG2a,k同种型对照,CloneR35-95(BDBioscience,#553929),按照由MBL提供的技术,通过细胞计数器实施TRP-2特异的CTL的分析。
结果显示于表13中。在任一小鼠来源的脾细胞中都没有检测到CD8阳性细胞和OVA四聚体阳性(CD8+OVA+)细胞。在用阴性对照组标记的未处理小鼠来源的脾细胞中,CD8阳性细胞和TRP-2四聚体阳性(CD8+TRP-2+)细胞为0.0%。在用肽标记的肽脉冲DC免疫的小鼠来源的脾细胞中,CD8+TRP2+细胞为2.4%。此时,在用T(U)免疫的小鼠来源的脾细胞中,诱导了2.3%CD8+TRP2+细胞;并且在用T(G)免疫的小鼠来源的脾细胞中,诱导了1.5%CD8+TRP2+细胞。从上述的结果中证实,将可溶性rTRP-2转导入DC中并免疫可以诱导TRP-2特异的CTL。
在与单一表位(SVYDFFVWL:SEQIDNO:4)比较的CTL的诱导有效性结果中,用于将不溶性蛋白质和/或肽转导入细胞中的本发明方法显示出与用肽脉冲的情况下基本上等同的CTL诱导效应。在用肽脉冲的情况下,虽然可以诱导只对脉冲的肽特异的CTL,但是在通过本发明的转导方法将溶解的蛋白质转导入DC的情况下,由于可以将蛋白质中的多个表位呈递给多种类型的MHC(不仅包括I类还包括II类),因此推定,与肽脉冲的DC疫苗比较,可以增强作用。
实施例14
使用癌细胞匀浆物的不溶性级分诱导CTL
如在实施例13中所示,当溶解了不溶性重组蛋白质(rTRP-2)时,可以通过电穿孔将rTRP-2掺入到DC中。通过四聚体测定显示,当将掺入了蛋白质的DC施用给小鼠时,可以在小鼠体内诱导CTL。此次,将通过本发明方法溶解的B16小鼠黑素瘤细胞匀浆物的不溶性级分用于制备DC,并研究在小鼠体内的抗肿瘤免疫效果。
制备B16裂解物和溶解不溶性级分
在75cm2培养瓶中培养B16。当细胞覆盖了底物表面时,用PBS洗涤培养的细胞3次。洗涤后,刮取细胞,并在4℃在1000×g离心5分钟,并且回收为沉淀。测量沉淀的湿重。
对于每一湿重,再次将沉淀悬浮于PBS中,使得浓度为400μL/100mg。之后,将悬浮液实施冷冻(-80℃)和融化(30℃)6次,离心,并分级成上清液和沉淀。通过BCA方法测量上清液(裂解物:sup)中蛋白质的量。将沉淀溶解于8M尿素-PBS,将终浓度10mM的GSSG和终浓度10mM的UMP加入到该溶液中,并在室温让它们反应1小时。之后,将1/5体积的50%甘油和6M尿素-PBS加入到反应溶液中,并用含10μMUMP的10%甘油-PBS透析反应溶液。离心回收的样品,并通过BCA方法定量上清液(溶解的不溶性级分:ppt)中溶解的蛋白质的量。
DC的制备和免疫
与实施例10类似,成熟DC诱导自C57BL/6小鼠的骨髓细胞。将成熟DC悬浮于X-VIVO20,使得浓度为1×107个细胞/mL,并将悬浮液分配成每个0.2mL。将0.2mL含10μMUMP的10%甘油-PBS、0.2mL以前制备的B16裂解物(终浓度:2mg/mL)或者0.2mLB16加溶作用溶解的不溶性级分(终浓度:2mg/mL)加入该悬浮液中,并实施电穿孔。电脉冲后立即回收细胞,并将它们悬浮于含5倍体积的0.2%正常C57BL/6小鼠血清的AIM-V培养基中,并且在37℃在5%CO2中温育该悬浮液1小时。然后,加入终浓度20ng/mL的GM-CSF、终浓度10ng/mL的IL-4和终浓度10ng/mL的IFN-γ,并将混合的悬浮液类似培养过夜。然后,回收并洗涤各DC。将DC悬浮于含0.2%正常C57BL/6小鼠血清的PBS中,将5×105个细胞/小鼠腹膜内施用给C57BL/6小鼠。作为阴性对照,类似地施用没有进行电穿孔和用裂解物或溶解的不溶性级分共培养的DC,并在一周后再次免疫,此后一周后,从每一小鼠中收集脾细胞。
细胞毒性测试
通过CD8a+T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec,#130-090-859)分离并区分来自脾细胞的CD8a+细胞,并然后悬浮在含10%FBS、25mMHEPES(Invitrogen、#15630-080)、5×10-5M2-ME(Invitrogen,#21985-023)、2mML-谷氨酰胺(Invitrogen,#25030-081)、1×10-5M丙酮酸钠(Invitrogen,#11360-070)、1%非必需氨基酸(Invitrogen,#11140-050)和100μg/mL链霉素和100u/mL青霉素(Invitrogen,#15070-063)的RPMI1640(完全)培养基中,以使浓度为1×106个细胞/mL。将10U/mLIL-2(Chairon)加入到悬浮液中,并将该悬浮液培养3天以产生效应细胞。
对于靶细胞,使用加入了终浓度1ng/mL的IFN-γ,并已经培养了24小时的传代培养B16细胞。通过使用抗H-2Kb抗体(BDPharmingenPE,#553570)和抗H-2Db抗体(BDPharmingenFITC,#553573),通过流式细胞仪分析用IFN-γ处理的MHCI类分子的表达。如在图14a中所示,阳性细胞率为37.4%。这意味着由于抗原特异性识别所致的最大细胞毒性是37.4%。将用IFN-γ处理的B16细胞悬浮于含5%FBS的RPMI1640培养基中,以使浓度为1×106个细胞/mL,并加入Calcein-AM(DoujinKagakuKenkyusho,#349-07201),并搅拌以使终浓度为2μg/mL,并且在37℃在5%CO2存在的情况下每10分钟搅拌一次,并温育30分钟。在该操作中,用含5%FBS的RPMI1640培养基洗涤Calcein-AM标记的B16细胞,以得到靶细胞。以5、10和20的效应细胞(E)数目与靶细胞(T)数目比率(E/T比率)混合效应细胞和靶细胞,并在37℃在5%CO2存在的情况下温育该细胞2小时。从而,实施细胞毒性测试。通过使用TerascanVP(MINERVATECH)系统实施细胞毒性的测量。
结果显示于图14b中。坐标轴的纵坐标显示来源于两个一组的效应细胞的细胞毒性平均值,以及表示其SD的误差线。用裂解物共培养的DC(Cosup)和用溶解的不溶性级分共培养的DC(Coppt)免疫的小鼠来源的效应细胞与未施用抗原电穿孔的DC(Ep(-))免疫的小鼠来源的效应细胞具有相同水平的细胞毒性。即,仅证实了非特异性细胞毒性。此外,在用TRP-2肽脉冲的DC(Pep)免疫的小鼠来源的效应细胞中,也没有观察到特异性细胞毒性。在另一方面,在用通过电穿孔掺入了裂解物的DC(Epsup)免疫的小鼠来源效应细胞中,E/T为20,并且证实了特异性细胞毒性。此外,在用通过电穿孔掺入了溶解的不溶性级分的DC(Epppt)免疫的小鼠来源的效应细胞中,E/T为10和20,并且显示出了更强的抗原特异性细胞毒性。
从上述结果中,当将通过本说明书中所述的加溶作用方法溶解的蛋白质用作为抗原时,可以诱导比通过常规方法所诱导的CTL具有更高效应的CTL,这表明,抗癌症免疫要比通过单一表位肽所诱导的抗癌症免疫更强。此外,其显示,在本加溶方法中可以使用通常丢弃的肿瘤组织匀浆物的不溶性级分。
工业应用性
如上所述,使用本发明的方法可以有效的溶解不溶性蛋白质。此外,可以容易地将本发明方法溶解的蛋白质转导入细胞中。因此,其通过抗原呈递细胞有效的诱导了CTL。在使用本发明技术的情况下,可以将通过溶解例如癌症和传染病的不溶性抗原蛋白质,并转导入树突状细胞等中诱导的抗原呈递细胞用作为特异性针对抗原蛋白质的CTL诱导剂,并可以用于患具有抗原蛋白质的癌症或传染病患者的治疗等等。