CN102439433A - 一种区分猪体和牛体明胶胶囊的方法 - Google Patents

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Abstract

一种区分猪体明胶胶囊和牛体明胶胶囊的方法，包括步骤：(a)利用硫酸铵沉淀法从所述明胶胶囊中提取蛋白质，其中样品量在150mg至400mg之间，优选150mg，溶于9mL至HmL，优选10mL的例如是蒸馏水的液体中，温度在35℃至50℃范围之间，优选40℃；和，(b)利用凝胶电泳法分离所述蛋白质，7.5％SDS-PAG E，在200V条件下运行。

Description

一种区分猪体和牛体明胶胶囊的方法
技术领域
本发明涉及一种区分猪体和牛体的明胶胶囊的方法。该方法包括从所述明胶胶囊中提取蛋白质并根据其分子量利用凝胶电泳分离所述蛋白质。
背景技术
伊斯兰教是一种生活方式，也是一个全面的宗教信仰，通过一些管理人、社会和公共方面的章程，指引它的追随者的生活。受穆斯林人的快速增长驱动，清真产品将面临更广的人群。因此，这个表述也显示出在将来对清真产品的需求会增加。例如在医学领域，需要大量的胶囊药物和补充剂进入市场，其是使用明胶作胶囊。由于明胶可来自猪或牛，穆斯林人和其他非猪肉消费者通常试图避免这些胶囊药物和补充剂，除非他们确信所述胶囊不是来自猪体。
有很多现有的技术用于确定明胶胶囊是来自猪体还是牛体。这些技术包括主成分分析(PCA)，酶联免疫吸附分析(ELISA)和磷酸钙沉淀法(CCP)。然而这些方法都具有自己的缺陷，从而限制他们的有效性和可靠性。PCA时间长并且昂贵，其中凝胶经酸水解形成氨基酸，然后在HPLC分离前将氨基酸衍生化。整个方法需要时间约24小时。另外，PCA减少了数据设定的维度，这会影响分析数据的有效性。ELISA是一种非常昂贵的技术，其需要使用特定抗体。CCP技术是基于通过pH滴定法测定磷酸钙沉淀的形成，该技术强烈依赖于纯牛或猪明胶的已知浓度，因此如果明胶不纯，该方法这不能用于区分明胶来自猪体还是牛体。
因此，本发明提供了一种区分胶囊药物和补充剂中猪体明胶和牛体明胶的方法，相比文献中记载的上述已知方法，所述方法简单，快速，可靠和经济。
在此需要指出的是，尽管非猪体明胶并不是确定是否是清真明胶的唯一因素，因为清真产品也可通过其他因素确定，如依照Syarak法律屠宰牲畜，但是该方法能降低穆斯林和非猪消费者消费猪体明胶的风险。
发明内容
根据本发明的目的，提供了一种区分猪体明胶胶囊和牛体明胶胶囊的方法，包括步骤：
(a)利用硫酸铵沉淀法从所述明胶胶囊中提取蛋白质；和，
(b)根据它们的分子量利用凝胶电泳法分离所述蛋白质。
根据本发明，牛体明胶蛋白在分子量130-140kDa之间产生第一条带，在分子量120-130kDa之间产生第二条带，猪体明胶蛋白在分子量235-265kDa之间产生第一条带，在分子量115-130kDa之间产生第二条带，在分子量105-110kDa之间产生第三条带。
本发明包括很多新颖的特征，其表现在下面说明书和附图中充分描述和解释，可以理解，细节上的各种改变都不能脱离本发明的范围或损害本发明的优势。
附图说明
在此可从下面的详细说明书和附图中充分理解本发明，其仅仅是解释，因此对本发明并无限定作用，其中：
图1为利用本发明方法分析四种不同明胶胶囊样品和四种标准物得到的图像。
图2为利用本发明方法分析另一种明胶胶囊和三种标准物得到的图像。
具体实施方式
本发明主要基于的原理是：不同体的明胶包括不同的蛋白质混合物。利用此原理，发明人创造了一种利用硫酸铵沉淀法从所述明胶胶囊中提取蛋白质的方法。然后根据其分子量利用凝胶电泳(如，7.5％SDS-PAGE，在200V运行)分离这些蛋白质。由于不同蛋白质在SDS-PAGE中具有不同的迁移率，通过和标准的牛和猪明胶比较，牛和猪的明胶蛋白质的不同分布图可以用于确定明胶的来源。
依据本发明，所述方法包括步骤：
(a)使用洁净的剪刀切明胶胶囊，移出其内部物并采用一片吸纸清洁所述胶囊。
(b)称量150mg胶囊和0.835g硫酸铵。
(c)在100mL烧杯中，将所述胶囊溶解在10mL蒸馏水中，水浴保持40℃。通常明胶充分溶解需要温度在30℃以上。
(d)明胶溶解后，用磁棒持续搅拌下，向溶液中一点一点加入硫酸铵盐。
(e)加入所有盐后，所述溶液搅拌下保持30分钟。
(f)三十分钟后，将1mL上清液收集至在1mL微量离心管中。当吸出所述上清液时，所述溶液需保持持续搅拌。这能保证没有析出蛋白质沉积在烧杯底部。
(g)然后将所述离心管在14000rpm，35℃下离心分离20分钟。这是为了旋转沉积所述析出蛋白质。
(h)离心过后，从所述离心管轻轻倒出所述上清液。在所述离心管底部或侧面或会存在可见的颗粒，这取决于胶囊中的蛋白质量。如果没有可见颗粒则表示仅旋转沉积出微量的蛋白质。
(i)然后将所述颗粒重新悬浮在70μL的TSE缓冲液中。这样让所述蛋白质溶解在所述缓冲液中，注：所需TSE的份量可根据样品不同而不同，其是为了在SDS-PAGE中可见。
(j)重新悬浮后，所述管旋转约10秒均质混合缓冲液中的蛋白质。注：如果所述颗粒不能完全溶解在所述缓冲液中，例如在有色硬质明胶胶囊的情况下，则在500rpm，35℃下离心分离所述溶液4分钟，从而旋转沉积所述不溶杂质。收集上清液。
(k)然后从所述管中取20μL溶液移入一个新的包含5μL样品缓冲液的微量离心管。简单转动所述混合物，然后在95℃加热4分钟。
(l)对标准的牛和猪的重复步骤(a)至(k)。
(m)步骤(k)后，将15μL每种样品和标准物装入7.5％，8cm＊10cm聚丙烯酰胺凝胶孔中。
(n)所有样品和标准物装完后，所述凝胶在200V电泳分离50分钟。
(o)运行结束，马上将所述凝胶移入容器中并浸入考马斯亮蓝染色液中1小时。
(p)1小时后，去除所述染色液，所述凝胶在退色液中浸泡30分钟。然后换成新鲜的退色液再浸泡30分钟，最后用蒸馏水浸泡所述凝胶。
(q)然后用VersaDoc成像系统抓取凝胶图像并用Quantity One 1-D分析软件(Bio-Rad，USA)分析。
上述方法是利用最优选的参数。然而，在本发明中，步骤(b)中从样品中提取蛋白质的明胶胶囊片的合适量范围为150mg至400mg，用于溶解所述明胶胶囊片的蒸馏水合适量为9mL至11mL。由于明胶通常在高于30℃的温度溶解，因此所述蒸馏水在水浴中保持恒温来溶解所述明胶，温度范围为35℃至50℃。
在上述步骤(a)-(k)中包括从所述明胶胶囊样品和标准物中提取蛋白质和用于凝胶电泳的准备步骤。所述凝胶电泳，如步骤(m)-(p)，依据分子量分离所述蛋白质。然后用所述凝胶中分离的蛋白质的带像来确定明胶胶囊的来源。
根据本发明的方法，下面是所述配比：
1、TSE缓冲液
Figure BPA00001463412100041
2、样品绥冲液
Figure BPA00001463412100042
＊加入新鲜2β-巯基乙醇
3、染色溶液
Figure BPA00001463412100043
4.退色液
Figure BPA00001463412100044
所述凝胶电泳，是十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(7.5％SDS-PAGE，200V下运行)，是根据Laemmli(1970)的改进方法操作。7.5％聚丙烯酰胺凝胶(尺寸8cm＊10cm＊1.0mm)的制备如下：
(i)制备溶解凝胶：
所述溶解的凝胶溶液通过加入和混合上述配方中的所有试剂制备，除了过硫酸铵和TEMED是在所有其他试剂添加完毕后再加入的，轻轻旋转所述混合物并快速移入凝胶注模成型玻璃板中距顶部5cm。然后，少量水饱和丁醇溶液(水∶丁醇1∶1)填在所述溶液表面使得所述凝胶层变平。当所述凝胶完全聚合时(20分钟)，移去水饱和丁醇溶液并用蒸馏水冲洗所述凝胶。
(ii)制备积层凝胶：
Figure BPA00001463412100052
所述积层凝胶溶液通过加入和混合上述配方中的所有试剂制备，除了过硫酸铵和TEMED是在所有其他试剂添加完毕后再加入的，加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻旋转所述混合物并快速移入所述聚合溶解凝胶(早先提到的)直到溢出。然后，立即插入制孔梳(well forming comb)。积层凝胶完全聚合后(50分钟)，移去所述梳。在装载样品前用电极缓冲液填满所形成的孔。
(iii)电极缓冲液(运行缓冲液)
Figure BPA00001463412100053
Figure BPA00001463412100061
通过使用上述方法分析有在架上提供的五种不同的产品(样品)，得到图1和图2所示图像，其中在样品中，带(3)和(4)表示牛的软凝胶，带(6)和(7)表示牛的硬凝胶和带(11)表示猪的硬凝胶，而在标准品中，带(1)和带(13)表示蛋白标记物(未染色的)，带(5)和带(9)表示牛的凝胶标准品(来自清真凝胶)和带(2)，(8)和(12)表示猪明胶标准样品(Sigma生产)。带(10)表示牛和猪的标准样品相同比例混合物，所述图更类似于猪的。
图1和图2示出了用来分别牛和猪的明胶的标记。在牛的中，有两条带在分子量130-140kDa和120-130kDa(圆形)；而在猪的中，有一条带在分子量235-265kDa之间(矩形框)和有两条带在分子量115-130kDa和105-110kDa(圆形)。图1中所述四种样品，如(3)，(4)，(6)和(7)所示带与牛标准样品(5)和(9)的带类似。因此，可以推断，所有这四种胶囊都来自于牛体。另外，图2中的一种样品，如(11)所示带与猪标准样品(2)，(8)，(10)和(12)的带相似。因此可以推断该样品(11)来自猪体。
根据上面所述内容，本发明涉及一种区分猪体和牛体明胶胶囊的方法，其中上述说明书根据本发明优选实施例描述了本发明。然而，可以理解的是本发明优选实施例的限制性说明仅仅是有助于论述本发明，可以预想，对本领域技术人员而言，可以设计各种改进和等价物，其都未脱离附加的权利要求的范围。

Claims (15)

1.一种区分猪体明胶胶囊和牛体明胶胶囊的方法，包括步骤：
(a)利用硫酸铵沉淀法从所述明胶胶囊中提取蛋白质；和，
(b)根据它们的分子量利用凝胶电泳法分离所述蛋白质。
2.根据权利要求1所述方法，包括步骤：
(a)将150-400mg所述明胶胶囊溶解在9-11mL蒸馏水中，所述蒸馏水保持在水浴中温度为35℃-50℃；
(b)向步骤(a)中所述明胶溶液中加入0.835g硫酸铵盐，期间保持混合溶液处于搅拌状态；
(c)将步骤(b)中的所述混合溶液在搅拌条件下静置约30分钟；
(d)吸取步骤(c)中所述溶液混合物的1mL上清液至1mL微量离心管，期间保持所述混合溶液处于搅拌中；
(e)在14000rpm，35℃条件下，离心分离步骤(d)中的所述上清液20分钟，直至沉淀出析出的蛋白质；
(f)轻轻倒出所述上清液并收集所述析出的蛋白质；
(g)重新使所述蛋白质悬浮在TSE缓冲液中，在所述缓冲液中完全溶解所述蛋白质并摇动所述混合物约10秒钟至所述蛋白质在所述缓冲液中均质混合；
(h)将20μL步骤(g)中的所述溶液移至新的微量离心管中，所述离心管包含5μL样品缓冲液，摇动所述混合物并在95℃下加热所述混合物4分钟；
(i)对标准牛的和猪的样品重复步骤(a)-(h)；
(j)将步骤(h)和(i)中的每种样品和标准样品15μL装入7.5％8cm＊10cm聚丙烯酰胺凝胶孔中并将所述凝胶在200V条件下电泳分离50分钟；
(k)立即将所述凝胶移入容器中并浸入考马斯亮蓝染色液中1小时；
(l)去除所述染色液，所述凝胶在退色液中浸泡30分钟；
(m)然后换成新鲜的退色液再将所述凝胶浸泡30分钟；
(n)用VeraDoc成像系统抓取所述凝胶图像前，用蒸馏水浸泡所述凝胶；和
(o)用Quantity One 1-D分析软件(Bio-Rad，USA)分析所述图像。
3.如权利要求2所述方法，其中步骤(a)中所述明胶胶囊为150mg。
4.如权利要求2所述方法，其中步骤(a)中所述蒸馏水为10mL。
5.如权利要求2所述方法，其中步骤(a)中所述水浴为40℃。
6.如权利要求2所述方法，其中步骤(h)中所述混合物在装入所述聚丙烯酰胺凝胶孔前在沸水中加热4分钟。
7.如权利要求2所述方法，其中步骤(g)中所述TSE缓冲液为70μL。
8.如权利要求2或7所述方法，其中所述TSE缓冲液包括12.5mL的40mMTRlS，5mL的10％(w/v)SDS，pH 8.8，0.01861g的1mM EDTA和32.5mL的蒸馏水，总体积为50mL。
9.如权利要求2所述方法，其中步骤(h)中的所述样品缓冲液包括3.8mL的蒸馏水，1.0mL的0.5M Tris-HCl，pH 6.8，0.80mL的甘油，1.6mL的10％(w/v)SDS，0.4mL的2β-巯基乙醇，0.4mL的0.05％(w/v)溴酚蓝，总体积为8.0mL。
10.如权利要求9所述方法，其中新鲜加入所述2β-巯基乙醇。
11.如权利要求2所述方法，其中步骤(k)中所述考马斯蓝染色溶液包括500mL的蒸馏水，1.0g的0.1％(w/v)考马斯蓝R250，400mL的甲醇(40％v/v)和100mL的乙酸(10％v/v)，总体积为1.0L。
12.如权利要求2所述方法，其中步骤(l)中所述退色液包括500mL的蒸馏水，400mL的甲醇(40％v/v)和100mL的乙酸(10％v/v)，总体积为1.0L。
13.如权利要求2所述方法，其中步骤(k)中所述聚丙烯酰胺凝胶包括以4.85mL的蒸馏水，2.5mL的1.5M Tris-HCl，pH 8.8，100μL的10％(w/v)SDS，2.5mL的30％(w/v)丙烯酰胺/双丙烯酰胺，50μL的10％过硫酸铵和5μL的TEMED，单体总体积为10mL来溶解凝胶。
14.如权利要求2所述方法，其中如果所述蛋白质在所述TSE缓冲液中未完全溶解，则在步骤(g)中将所述混合物进一步在500rpm，35℃条件下离心分离4分钟从而沉淀出未溶解的杂质，并将所得上清液收集用于接下来的步骤(h)。
15.如权利要求1或2所述方法，其中来自牛体明胶的蛋白质在分子量130-140kDa产生第一条带，在分子量120-130kDa产生第二条带和，来自猪体明胶的蛋白质在分子量235-265kDa产生第一条带，在分子量115-130kDa产生第二条带和在分子量105-110kDa产生第三条带。
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